梁浩堅(jiān)+汪傳喜+許結(jié)儀+鄭優(yōu)榮+李仲平+藍(lán)嵐茵+林詩(shī)雅

[摘要]目的評(píng)估核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血者血液篩查的功效。方法采用Grifols公司（原諾華診斷公司）PROCLEIX TIGRIS全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析系統(tǒng)和PROCLEIX ULTRIO HIV-1/HCV/HBVAssay核酸檢測(cè)試劑，對(duì)2011年1月～2014年12月的1 146 740例無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HIV/HCV/HBV三項(xiàng)單人份核酸檢測(cè)，同時(shí)采用血清學(xué)試劑進(jìn)行HBsAg，HCVAb，HIVAb/Ag檢測(cè)。對(duì)核酸檢測(cè)單獨(dú)反應(yīng)性標(biāo)本（血清學(xué)陰性，核酸檢測(cè)反應(yīng)性）進(jìn)行鑒別試驗(yàn)以確定感染病毒種類。結(jié)果1146740例獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，核酸檢測(cè)的反應(yīng)性比率為0.97%（10 645/1146 740），低于血清學(xué)HBsAg，HCVAb，HIVAbAg三項(xiàng)總的檢測(cè)陽(yáng)性率1.66%（19024/1146740）。在1114428例經(jīng)血清學(xué)全項(xiàng)檢測(cè)合格的標(biāo)本中，單人份核酸檢測(cè)共檢出2457例核酸反應(yīng)性樣本，核酸單獨(dú)反應(yīng)性比率為0.22%；在2457例核酸單獨(dú)反應(yīng)性標(biāo)本中，鑒別試驗(yàn)反應(yīng)性的樣本為718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA4例，HIV-RNA 3例。核酸鑒別試驗(yàn)陽(yáng)性率為29.22%（718/2457）。結(jié)論目前在廣州地區(qū)輸血傳播疾病的殘余風(fēng)險(xiǎn)主要還是輸血感染HBV。核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于血液篩查，將有助于縮短病原體檢測(cè)的窗口期，降低輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)，血清學(xué)和核酸檢測(cè)兩種方法互為補(bǔ)充，應(yīng)同時(shí)使用以保障血液安全。

[關(guān)鍵詞]核酸檢測(cè)；血液篩查；輸血風(fēng)險(xiǎn)；血液安全；轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)

輸血相關(guān)傳染病的預(yù)防和控制是全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。2010年，國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)（原衛(wèi)生部）確定在全國(guó)15家采供血機(jī)構(gòu)開展核酸檢測(cè)（NAT）試點(diǎn)工作，以進(jìn)一步保證血液檢測(cè)質(zhì)量，提升我國(guó)無償獻(xiàn)血者血液檢測(cè)水平。到目前NAT技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于全國(guó)各地血站的血液篩檢。該技術(shù)的檢測(cè)靈敏度較ELISA檢測(cè)方法高，能顯著縮短病原體檢測(cè)的窗口期，從而降低輸血傳播病毒的殘余風(fēng)險(xiǎn)50%以上。但NAT技術(shù)從理論上并不能完全消除“窗口期”，國(guó)外已有經(jīng)核酸檢測(cè)后仍發(fā)生輸血后感染的病例報(bào)道，包括HIV和HBV。本中心2010年11月正式將NAT技術(shù)應(yīng)用于血液篩查項(xiàng)目中，對(duì)全部無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA核酸檢測(cè)。本研究通過對(duì)無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本的常規(guī)血清學(xué)及核酸檢測(cè)結(jié)果的分析，以評(píng)估核酸檢測(cè)的檢測(cè)功效，以及本地獻(xiàn)血者人群的感染狀況?，F(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2011年1月～2014年12月，廣州血液中心采集的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本1146740例。所有無償獻(xiàn)血者均符合現(xiàn)行的衛(wèi)生部《獻(xiàn)血者健康檢查要求》（GB18467-2011）。血液采集后同時(shí)留取核酸檢測(cè)標(biāo)本和酶免檢測(cè)標(biāo)本管各一支。核酸檢測(cè)標(biāo)本采集、保存和處理等均嚴(yán)格按照衛(wèi)生部核酸檢測(cè)試點(diǎn)技術(shù)要求操作。

1.2主要儀器與試劑

核酸檢測(cè)儀器：Grifols公司（原諾華診斷公司）PROCLEIX TIGRIS全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析系統(tǒng)，試劑配置恒溫箱（RPI）。試劑為PROCLEIXULTRIO Assay核酸聯(lián)檢試劑盒和核酸鑒別試劑盒（Discriminatory Assay）。核酸檢測(cè)試劑批號(hào)：（593226，614952，624775，116153等）。血清學(xué)檢測(cè)儀器：STAR全自動(dòng)加樣儀和全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀（FAME24/30）。ELISA檢測(cè)主要試劑包括乙肝表面抗原試劑盒（法國(guó)梅里埃，批號(hào)B11FA，20110704；上?？迫A：批號(hào)201101031，201201011，201302011）、丙型肝炎抗體試劑盒（美國(guó)強(qiáng)生ORTHO：批號(hào)EXE187，EXE208；上?？迫A：批號(hào)201103011，201202031，201303011）及人類免疫缺陷病毒（HIVl/2）抗原抗體檢測(cè)試劑盒（法國(guó)伯樂，批號(hào)1F0189，280213，3F0259；北京萬泰，批號(hào)1201 10204，120121 120，12013 1022）。

1.3檢測(cè)策略

血液標(biāo)本采用血清學(xué)和NAT并行檢測(cè)操作策略；對(duì)核酸檢測(cè)單獨(dú)反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行分項(xiàng)鑒別試驗(yàn)。

1.4檢測(cè)方法

采用PROCLEIX TIGRIS 全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析系統(tǒng)（TMA方法）對(duì)血液核酸標(biāo)本進(jìn)行單人份聯(lián)合檢測(cè)（HIV-1/HCV/HBV）；對(duì)核酸檢測(cè)單獨(dú)反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行分項(xiàng)鑒別試驗(yàn)；核酸檢測(cè)結(jié)果反應(yīng)性結(jié)果由檢測(cè)系統(tǒng)軟件自動(dòng)判定，其判定標(biāo)準(zhǔn)為樣本的S/CO值≥1。采用兩種不同廠家的ELISA試劑對(duì)獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行血清學(xué)HBsAg、HCVAb、HIVAgAb檢測(cè)，嚴(yán)格執(zhí)行說明書進(jìn)行相關(guān)操作，通過陰陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控品來控制試劑盒的質(zhì)量和檢測(cè)的有效性；血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的判定：樣本OD≥cut off值。

1.5檢測(cè)原理

Grifols核酸檢測(cè)試劑是以轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（transcription-mediated amplification，TMA）技術(shù)原理來檢測(cè)病毒核酸的方法。其檢測(cè)基本原理是：利用特異性的目標(biāo)捕獲試劑和磁微珠分離純化被檢測(cè)病毒核酸分子，再通過TMA技術(shù)來擴(kuò)增HBVDNA、HCV RNA和HIV-1 RNA（1型）的核酸片斷，最后通過雜交保護(hù)（HPA）方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。試劑中含有內(nèi)標(biāo)分子，用以監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)過程，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析，對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行x²檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血清學(xué)與核酸檢測(cè)結(jié)果的比較

對(duì)1 146 740例獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，核酸檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率為0.97%，低于血清學(xué)（HBsAg，HCVAb，H1VAbAg三項(xiàng)之和）的檢測(cè)陽(yáng)性率1.66%，二者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x²=2128.4，P<0.05），見表1。

2.2核酸檢測(cè)

4年中Grifols單人份核酸檢測(cè)系統(tǒng)的總陽(yáng)性率為0.97%，并且陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐年緩慢增加的趨勢(shì)。在對(duì)每年的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較時(shí)，各年度間檢測(cè)陽(yáng)性率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x²=2.442，P<0.05），見表2。

2.3血清學(xué)合格標(biāo)本中核酸檢測(cè)情況

在1114428例血清學(xué)檢測(cè)合格標(biāo)本中，單人份核酸檢測(cè)共檢出2457例核酸反應(yīng)性樣本，核酸單獨(dú)反應(yīng)性比率為0.22%；在對(duì)每年檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較時(shí)，各年度間血清學(xué)檢測(cè)合格標(biāo)本其NAT檢測(cè)陽(yáng)性率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x²=16.506，P<0.05），見表3。

2.4核酸鑒別結(jié)果

在2457例核酸單獨(dú)反應(yīng)性標(biāo)本中，鑒別試驗(yàn)反應(yīng)性的樣本為718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA 4例，HIV-RNA 3例，獻(xiàn)血者中核酸單獨(dú)陽(yáng)性的樣本大多屬于HBV感染，HBV DNA鑒別陽(yáng)性率與另外兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x²=2091.464，P<0.05）。核酸鑒別試驗(yàn)總陽(yáng)性率為29.22%（718/2457）。見表4。

3討論

目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于血液篩查的核酸檢測(cè)技術(shù)主要有TMA及PCR兩種。我中心使用的是Grills公司基于TMA技術(shù)的核酸檢測(cè)試劑，對(duì)全部獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行單人份核酸檢測(cè)。這種檢測(cè)方法的靈敏度高，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，擴(kuò)增效率高，可以防止低拷貝的病毒陽(yáng)性血液的漏檢。其分析靈敏度為：HBVDNA 10.4IU/mL，HCV RNA 3.0IU/mL和HIV RNA45.0IU/mL。并且該方法的整個(gè)反應(yīng)過程在1個(gè)試管中進(jìn)行，因此也減少了污染發(fā)生的可能。本研究顯示，廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本的核酸陽(yáng)性檢出率明顯低于酶免檢測(cè)項(xiàng)目陽(yáng)性檢出率（P<0.05）。在所有因輸血傳播病毒項(xiàng)目檢測(cè)不合格而淘汰的21481份標(biāo)本中，血清學(xué)和NAT一致陽(yáng)性的僅有8616份（占40.1%），而血清學(xué)單獨(dú)陽(yáng)性的有10408份（占48.5%），NAT單獨(dú)陽(yáng)性的有2457份（占11.4%）。對(duì)于這部分檢測(cè)結(jié)果不一致的情況，一方面是由于血清學(xué)和核酸檢測(cè)都存在檢測(cè)的假陽(yáng)性的可能，另一方面也說明了血清學(xué)和核酸檢測(cè)二者具有的互補(bǔ)作用。因此在目前的技術(shù)條件下，血清學(xué)和核酸檢測(cè)對(duì)獻(xiàn)血者的篩查是缺一不可的。

在獻(xiàn)血者血液篩查中引入核酸檢測(cè)技術(shù)，其主要目的是檢測(cè)出原有血清學(xué)檢測(cè)可能漏掉的具有感染性的獻(xiàn)血者樣本。在本研究中的1114428份血清學(xué)檢測(cè)合格標(biāo)本中，單人份核酸檢測(cè)共檢測(cè)出反應(yīng)性樣本2475例，陽(yáng)性檢出率為0.22%（2457/1114428），結(jié)果明顯高于大連和沈陽(yáng)地區(qū)0.07%，這可能與各地區(qū)病毒流行率差異、檢測(cè)樣本數(shù)量、使用試劑差異，以及檢測(cè)模式（單人份與多人份混樣檢測(cè)）不同有關(guān)。在對(duì)這些核酸單獨(dú)陽(yáng)性樣本的鑒別檢測(cè)中，共檢出718例陽(yáng)性結(jié)果，鑒別陽(yáng)性檢出率為29.22%。這個(gè)鑒別率與汪德海等報(bào)道的一致，而低于大連，杭州等地的數(shù)據(jù)。而出現(xiàn)核酸檢測(cè)聯(lián)檢反應(yīng)性，而鑒別試驗(yàn)全部為非反應(yīng)性的原因可能有：（1）聯(lián)檢結(jié)果假陽(yáng)性。這可能是由于酶免及核酸檢測(cè)平行進(jìn)行，檢測(cè)人員若操作不規(guī)范，導(dǎo)致陽(yáng)性標(biāo)本的小范圍污染，增加聯(lián)檢結(jié)果假陽(yáng)性的可能；或由于檢測(cè)試劑本身的非特異性反應(yīng)。（2）鑒別試驗(yàn)的假陰性。如病毒濃度處于極低的濃度水平，由于病毒顆粒在血漿中的泊松分布，導(dǎo)致取樣時(shí)未能吸取到帶有病毒的樣本；或可能是因不合適的儲(chǔ)存條件，不良的運(yùn)送，干擾物質(zhì)的存在，導(dǎo)致樣本中病毒的降解，也會(huì)造成鑒別試驗(yàn)假陰性的結(jié)果。由于我國(guó)乙肝的流行率相對(duì)較高，因此獻(xiàn)血者中核酸單獨(dú)陽(yáng)性的樣本大多屬于HBV感染。而HBV感染，特別是隱匿性乙肝感染（OBI）的病毒濃度通常很低，因此出現(xiàn)上述低濃度樣本的可能性很大。已有文章報(bào)道，對(duì)于不可鑒別的樣本，采用其他核酸檢測(cè)方法，或乙肝感染標(biāo)志物（如乙肝核心抗體）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，部分樣本仍然呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。提示這些不可鑒別的樣本中存在一定比例的真陽(yáng)性。

從結(jié)果中可以看出目前廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血者的HBV感染率較高，輸血傳播HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)明顯高于HCV和HIV，從核酸鑒別試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，在718例鑒別陽(yáng)性結(jié)果中，HBV DNA陽(yáng)性711例，占99.03%。文獻(xiàn)報(bào)道，HBV輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)主要來自于血清轉(zhuǎn)換前的窗口期、變異病毒株和隱匿性HBV感染3個(gè)方面。其中獻(xiàn)血者中的HBV DNA單獨(dú)陽(yáng)性者大部分屬于隱匿性HBV感染，表明輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)主要來自于隱匿性HBV感染。本文檢出HCV RNA 4例和HIV RNA 3例，其中HCV RNA及HIV RNA各一例送衛(wèi)生部臨檢中心驗(yàn)證為陰性。另外2例HIV RNA因獻(xiàn)血者聯(lián)系電話注銷，無法進(jìn)行隨訪追蹤，3例HCV RNA中2例經(jīng)確證為陽(yáng)性。在2015年鑒別試驗(yàn)中，又發(fā)現(xiàn)HIV RNA陽(yáng)性2例，送惠州市中心血站作定量檢測(cè)后確證為HIV陽(yáng)性。經(jīng)隨訪追蹤獻(xiàn)血者，一周后再進(jìn)行檢測(cè)，血清學(xué)及核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性，因此確定該2例標(biāo)本為HIV“窗口期”感染。

血清學(xué)檢測(cè)的是抗原或抗體，NAT檢測(cè)的是病毒核酸，核酸檢測(cè)能從血清學(xué)檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢出漏檢的病毒感染者，是血清學(xué)檢測(cè)的有力補(bǔ)充，我國(guó)許多城市自引入核酸檢測(cè)后也多有這方面報(bào)道。在本研究中的1114428份血清學(xué)檢測(cè)合格標(biāo)本中，單人份核酸檢測(cè)共檢測(cè)出反應(yīng)性樣本2475例（0.22%），證實(shí)核酸檢測(cè)的必要性。將NAT技術(shù)應(yīng)用于血液篩查，可以顯著降低因血清學(xué)漏檢而導(dǎo)致的輸血傳播疾病的殘余風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提高血液安全，以保障臨床用血安全。