王楠楠 ， 梁 曉 ， 濮思源 ， 張啟迪

(青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 山東 青島 266109)

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化學、微生物等病原因子的刺激所致的一種炎癥反應。我國奶牛乳房炎的發(fā)病率一般在20%～75%，其中臨床型乳房炎發(fā)病率在9.7%～55.6%，隱性乳房炎發(fā)病率卻高達20%～40%[1]。乳房炎導致產(chǎn)奶量和奶質量下降，直接給我國的奶牛業(yè)、乳制品企業(yè)和社會帶來了巨大的經(jīng)濟損失。流行病學研究表明，乳房炎在生殖性能上也有負面影響，臨床型乳房炎間接損害奶牛的生殖性能，使奶牛空懷天數(shù)增加、受胎率下降、早期流產(chǎn)比例增加、不規(guī)律的間隔發(fā)情[2]，由此造成的間接經(jīng)濟損失更是難以估量。當乳汁受到隱性乳房炎致病因子侵害后，乳腺分泌細胞受到破壞，并且乳汁中含有大量的病原微生物及其產(chǎn)生的毒素，人類食用后可引起發(fā)燒、嘔吐、腹瀉、脫水和過敏等癥狀。

近幾年，在政府優(yōu)惠政策的支持下，奶牛養(yǎng)殖業(yè)逐漸邁入產(chǎn)業(yè)化發(fā)展渠道，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大。臨床型乳房炎得到了很好的控制，而隱性乳房炎對人類經(jīng)濟和健康卻帶來了挑戰(zhàn)。本研究對濰坊某牛場隱性乳房炎進行系統(tǒng)調查，并對病原菌進行分離鑒定和藥物敏感性試驗，探明乳房炎對藥物的耐藥狀況，采用敏感藥物治療，并提出相應防治措施，對控制奶牛隱性乳房炎提供了相應的技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基 美藍染液，購自上海紀寧試劑有限公司；AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿，購自美國FERA Animal Health動保公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；MH培養(yǎng)基和MH肉湯，購自青島海博生物技術有限公司；胎牛血清，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗動物 濰坊市某奶牛場，規(guī)模4 200頭奶牛，其中正在泌乳期的奶牛2 000頭，后備牛(青年牛、育成牛、犢牛)為2 200頭。

1.3 儀器設備 生物潔凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、光學顯微鏡：上海躍進醫(yī)療機械廠。

1.4 采樣及細菌培養(yǎng) 采樣前應對雙手進行消毒，佩戴手套，用酒精棉徹底清潔乳頭末端和乳頭孔處，直至棉球表面沒有臟物為止，收集時需先棄掉頭幾把奶(3～5把)；采樣時保持采樣瓶45°傾斜，乳頭不要接觸瓶口。若一頭奶牛需要多個乳區(qū)采樣，消毒按照由里往外的順序消毒，而采樣則按照由前往后的順序；奶樣量應為采樣瓶的二分之一到三分之二之間。采用顯微鏡直接體細胞計數(shù)法(DMSCC)，如每毫升乳汁體細胞數(shù)超過 50 萬即可認為是隱性乳房炎[3]，但是有關的規(guī)定和標準卻不盡相同，一般在20萬～50萬以內(nèi)為安全。將體細胞數(shù)超過50萬的奶樣進行涂AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿，分別用3個無菌棉簽對一份奶樣在診斷皿的3個區(qū)域涂抹。將診斷皿置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察記錄結果。

1.5 AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿診斷標準 一區(qū)革蘭陰性菌：藍色為克雷伯菌，粉色為大腸桿菌，白色菌群但介質變黃為假單胞菌屬。二區(qū)革蘭陽性鏈球菌屬：深藍色為乳房鏈球菌，淺藍色為鏈球菌屬，紫色為腸球菌屬，薰衣草色為乳酸乳球菌屬。三區(qū)革蘭陽性葡萄球菌數(shù)：白色為葡萄球菌數(shù)，粉色為金黃色葡萄球菌，藍色為溶血葡萄球菌。

1.6 藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)2012年推薦的抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準進行藥敏試驗[5]。將鏈球菌屬和克雷伯菌挑取單菌落接種到MH肉湯培養(yǎng)基(鏈球菌要加入5%血清)，取200 μL菌液用涂布器在MH培養(yǎng)基(鏈球菌要加入5%血清)上涂勻，用鑷子放置藥敏紙片并輕壓，放置10 min。于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，記錄結果。

1.7 治療 選擇對菌株敏感的藥物進行乳頭注射治療。對鏈球菌屬引起的隱性乳房炎乳頭注射頭孢氨芐和卡那霉素，對克雷伯菌引起的隱性乳房炎乳頭注射頭孢噻呋，凝固酶陰性葡萄球菌感染的乳房炎先對其進行排空乳區(qū)法，進而乳頭注射孢氨芐和卡那霉素。其他細菌引起的隱性乳房炎均采用乳頭注射頭孢氨芐和卡那霉素。在對大腸桿菌感染的乳房炎進行排空乳區(qū)法，使其自愈。一個療程為 4 d，每個療程統(tǒng)計治愈率，其中在前一個療程中治愈的，下一個療程不繼續(xù)給藥，4個療程無法治愈的定為瞎乳區(qū)(乳區(qū)完全沒奶或豆腐渣樣奶或清水奶)。

1.8 奶牛隱性乳房炎治療后檢測方法 治療結束后，進行CMT試驗，檢測藥物的治愈率。擠奶前用溫水清洗治療后的乳區(qū)，棄掉2把乳汁，然后每個乳區(qū)取2 mL奶樣置于CMT診斷盤中待檢測，每2 mL乳汁中加入2 mL的CMT診斷液，充分混合，根據(jù)凝集反應判斷治愈情況。

1.9 奶牛隱性乳房炎治愈標準[5]。

表1CMT試驗的判定標準

判定指標乳汁凝集反應體細胞總數(shù)(萬/mL)陰性無變化0～20弱陽性部分形成凝膠狀40～150陽性全部呈凝膠狀,回旋搖動時凝塊集中在中央,停止搖動時呈凸凹狀附于底部。80～500強陽性全部呈凝膠狀并保持原狀,并固著于底部。>500

2 結果

奶牛場中泌乳奶牛為2 000頭，通過顯微鏡體細胞直接計數(shù)法對2 000頭奶牛的每個乳區(qū)進行體細胞計數(shù)，其中121頭奶牛中的253個乳區(qū)的體細胞超過50萬。奶牛隱性乳房炎發(fā)病數(shù)為121頭， 發(fā)病率6.33%，發(fā)病乳區(qū)數(shù)為253。奶牛隱性乳房炎的發(fā)生率結果如表2所示。

表2奶牛隱性乳房炎的發(fā)生率

檢測奶牛/頭發(fā)病數(shù)/頭陽性率/%發(fā)病乳區(qū)20001216.33253

在253例奶樣中鏈球菌屬檢出率最高為 46.24%，大腸桿菌為32.41%，克雷伯菌為16.60%，金黃色葡萄球菌僅有1例，AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿結果具體見表3。

主要病原菌藥敏試驗結果見表4。對濰坊某奶牛場中造成奶牛隱性乳房炎的主要細菌鏈球菌屬、克雷伯菌進行藥敏試驗，結果中顯示鏈球菌屬對頭孢氨芐、頭孢噻呋、卡那霉素敏感，敏感率分別為82.05%、70.08%、67.52%，對氨芐青霉素耐藥，耐藥率為84.62%；克雷伯菌對頭孢噻呋敏感，敏感率為73.81%，對氨芐青霉素、紅霉素耐藥，耐藥率分別為71.43%、61.90%。

表3AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿結果

病菌菌株數(shù)菌株比例/%鏈球菌屬11746.24大腸桿菌8232.41克雷伯菌4216.60凝固酶陰性葡萄球菌41.58假單胞菌屬20.79腸球菌屬20.79乳酸乳球菌屬20.79金黃色葡萄球菌10.40其他菌屬10.40

對奶牛隱性乳房炎治療結果如表5所示：對鏈球菌屬治療1個療程時治愈率為77.78%，2個療程時治愈率為88.89%，3個療程時治愈率為90.60%，4個療程時治愈率為91.45%；對克雷伯菌治療1個療程時治愈率為30.95%，2個療程時治愈率為38.10%，3個療程時治愈率為40.48%，4個療程時治愈率為40.48%；對凝固酶陰性葡萄球菌治療1個療程時治愈率為25%，2個療程時治愈率為50%，3個療程時治愈率為50%，4個療程時治愈率為75%；對其他菌屬治療1個療程時治愈率為57.14%，2個療程時治愈率為85.71%，3個療程時治愈率為85.71%，4個療程時治愈率為85.71%。

表4主要病原菌藥敏試驗結果

表5藥物治療結果

病菌乳區(qū)數(shù)治療時間治愈率/%治療時間治愈率/%治療時間治愈率/%治療時間治愈率/%鏈球菌屬1174d77.78(91/117)8d88.89(104/117)12d90.60(106/117)16d91.45(107/117)克雷伯菌424d30.95(13/42)8d38.10(16/42)12d40.48(17/42)16d40.48(17/42)凝固酶陰性葡萄球菌44d25(1/4)8d50(2/4)12d50(2/4)16d75(3/4)其他菌屬74d57.14(4/7)8d85.71(6/7)12d85.71(6/7)16d85.71(6/7)

3 討論

造成濰坊某奶牛場奶牛乳房炎的主要病原菌為鏈球菌屬、 克雷伯菌和大腸桿菌。濰坊某奶牛場中金黃色葡萄球菌感染的奶牛隱性乳房炎僅有一例，在濰坊地區(qū)其他奶牛養(yǎng)殖場中由金黃色葡萄球菌感染的奶牛隱性乳房炎卻高達10%。大腸桿菌性奶牛乳房炎多見于高產(chǎn)奶牛及產(chǎn)后泌乳高峰時期的奶牛，大腸桿菌主要來源于牛糞及其污染的環(huán)境，從損傷的生殖道進入血液或淋巴而引起感染。對于大腸桿菌沒有采用抗生素治療的原因是，大腸桿菌死亡，細胞壁破裂會釋放內(nèi)毒素，細胞內(nèi)毒素在體內(nèi)，會誘發(fā)其他一系列病理反應。有研究者認為抗生素誘導釋放的內(nèi)毒素不僅是因為抗生素殺滅大腸桿菌后，大腸桿菌壁破裂而釋放出來的，可能是細菌在抗生素作用下通過某些機制逐漸釋放出來[6]。藥敏試驗結果顯示，鏈球菌屬對頭孢噻呋、頭孢氨芐、卡那霉素敏感，克雷伯菌對頭孢噻呋敏感。由于奶牛場中抗生素的濫用，使得一些病原菌產(chǎn)生耐藥性，因而單一藥物的治療很難取得理想效果，在治療過程中采用聯(lián)合用藥會產(chǎn)生更好的療效。

臨床型乳房炎造成的損失是顯而易見的；而隱性乳房炎由于缺乏明顯癥狀，常被人們所忽略。據(jù)統(tǒng)計我國奶牛業(yè)每年因乳房炎引起的損失達135億人民幣，其中70%的損失是來自隱性乳房炎引起的產(chǎn)奶量降低[7]。根據(jù)濰坊某奶牛場的實際情況，按照操作規(guī)程使用大小合適的杯組和運行正常的設備進行擠奶操作；擠奶時應佩戴乳膠手套，消毒要及時；潮濕或被糞便污染的墊料應及時清除，保持奶牛飼養(yǎng)環(huán)境的干凈、干燥；確保日糧中有足量的維生素E和硒；定期進行奶牛隱性乳房炎的檢測，并進行合理的藥物治療，可以有效的預防和治療奶牛乳房炎，降低病情的危害，提高企業(yè)經(jīng)濟效益。

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[3] Little R B. Mastitis[M]. New York and London: W. NBorine, 1946.

[4] 高海慧, 任敏, 郭抗抗, 等. 陜西某奶牛場隱性乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗[J]. 動物醫(yī)學進展, 2014, 35(6):152-156.

[5] 李宏濱. 三個與奶牛乳房炎抗性相關基因的克隆及比較基因組學分析[D]:北京： 中國農(nóng)業(yè)科學院; 2008.

[6] 王麗平, 郭永剛, 史曉麗, 等. 不同抗生素對大腸桿菌形態(tài)的影響及其誘導游離內(nèi)毒素的釋放[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2004, 24(6):596-597.

[7] 方必春. 奶牛敗血性乳房炎的調查與分析[J]. 畜牧與獸醫(yī), 1991, 23(3):123-126.