毛晨龍 ， 李 健 ， 陳耀星 ， 饒 沖 ， 趙會斌 ， 薛佳祺 ， 趙戰(zhàn)勤

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 河南 洛陽 471003 ； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

炔雌醚(Quinestrol)是一種化學(xué)合成雌激素，用于乳腺癌與前列腺癌治療、女性避孕藥和鼠類不育劑。通過多種途徑進入環(huán)境，已經(jīng)成為最重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一。研究發(fā)現(xiàn)，炔雌醚干擾下丘腦-垂體-睪丸軸的分泌功能，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，造成生精細胞凋亡，生殖器官萎縮，精子質(zhì)量下降，嚴重破壞雄性生殖功能[1-2]。生殖系統(tǒng)，尤其是睪丸內(nèi)的生精細胞對氧化應(yīng)激非常敏感，因此，提高機體的抗氧化功能，有利于改善雄性動物生殖功能[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有顯著的抗氧化功能。其中，牛膝多糖是從中藥牛膝根中提取的一種生物活性多糖，具有抗氧化功能、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，在養(yǎng)殖業(yè)已被廣泛用作綠色環(huán)保型飼料添加劑[4-5]。目前，關(guān)于牛膝多糖對雄性生殖功能的保護作用機制尚不十分明確。因此，本文開展牛膝多糖對成年大鼠生殖器官發(fā)育、抗氧化功能和精子品質(zhì)影響的研究，揭示牛膝多糖對生殖系統(tǒng)的保護作用，為探尋綠色、安全、天然的生殖功能保護藥材提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物處理 20只8周齡成年雄性封閉群SD大鼠，購自河南省實驗動物中心，平均體重260±20 g。飼養(yǎng)條件，12 h光照-黑暗周期，20 ℃～22 ℃，濕度40%。適應(yīng)飼養(yǎng)1周，隨機分為4組，進行灌胃藥物處理，每天1次，連續(xù)1周。對照組：橄欖油+生理鹽水；第二組：100 mg/kg體重牛膝多糖；第三組：1.0 mg/kg體重炔雌醚；第四組：1.0 mg/kg體重炔雌醚+100 mg/kg體重牛膝多糖。炔雌醚溶于50 μL橄欖油，牛膝多糖溶于0.2 mL生理鹽水。試驗結(jié)束后，取睪丸、附睪、精囊腺和前列腺稱重，制作睪丸切片，進行蘇木精-伊紅(H.E.)染色和Tunel染色。Tunel染色結(jié)果棕黃色判定為陽性，統(tǒng)計1 000個生精細胞中陽性細胞數(shù)。睪丸勻漿檢測抗氧化酶活性。GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA和NO檢測試劑盒，購自上海安迪生物科技有限公司。

1.2 樣品處理與檢測 取左側(cè)附睪尾檢測精子質(zhì)量。采用細胞計數(shù)板統(tǒng)計精子數(shù)量(106/mL)。精子涂片采用姬姆薩氏染色檢測精子形態(tài)和頂體完整率(%)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)采用SPSS18軟件包進行單因素方差分析(One Way ANOVA)，多重比較(LSD)，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準差(Mean±SD)”表示，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 生殖器官和睪丸生精小管組織結(jié)構(gòu) 與對照組相比，炔雌醚處理組睪丸、附睪、精囊腺和前列腺重量分別下降25.33%、50.78%、40.34%和41.49%(表1)，差異極顯著(P<0.01)。與炔雌醚組相比，炔雌醚+牛膝多糖組睪丸、附睪、精囊腺和前列腺重量顯著升高(P<0.01)但仍顯著低于對照組(P<0.01)。牛膝多糖組生殖器官重量與對照組接近，差異不顯著。

表1大鼠生殖器官重量與生精細胞Tunel表達的變化

分組睪丸/g附睪/g精囊腺/g前列腺/gTunel炔雌醚+牛膝多糖2.73±0.34A0.85±0.19B0.87±0.22B0.76±0.17B154.5±27.53B炔雌醚(1)2.27±0.26B0.63±0.15C0.71±0.17C0.55±0.11C273.8±32.57A牛膝多糖(100)3.12±0.35A1.24±0.22A1.28±0.21A0.97±0.20A113.2±26.47C對照組3.04±0.26A1.28±0.18A1.19±0.25A0.94±0.15A124.44±20.25C

注：數(shù)據(jù)表達為平均值±標(biāo)準差。肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著(A and B:P< 0.01)， 下表同

對照組生精小管充滿大量生精細胞，管腔內(nèi)有長形精子(見中插彩版圖1 A)。炔雌醚組生精小管萎縮，細胞數(shù)量減少，大量細胞皺縮，管內(nèi)少見精子(見中插彩版圖1 C)。與炔雌醚組相比，炔雌醚+牛膝多糖組生精小管稍微萎縮，細胞較多，管腔內(nèi)有精子(見中插彩版圖1 D)。牛膝多糖組與對照組相比，睪丸組織結(jié)構(gòu)無明顯變化(見中插彩版圖1 B)。

圖1 大鼠睪丸生精小管組織結(jié)構(gòu)變化與Tunel表達

A-D蘇木精-伊紅(H.E.)染色； E-H：Tunel染色。A，E：對照組； B，F(xiàn)：100 mg/kg牛膝多糖； C，G：1 mg/kg 炔雌醚；D，H：1.0 mg/kg 炔雌醚 + 100 mg/kg牛膝多糖．A-H：標(biāo)尺= 100 μm．sg：精原細胞； sc：精母細胞； sp：精子細胞。

2.2 Tunel表達 牛膝多糖組和對照組每1 000個生精細胞中凋亡細胞數(shù)量分別為113.2個和124.4個(圖1E-1H；表 1)。炔雌醚組凋亡細胞數(shù)量升高至273.8，差異極顯著(P<0.01)。炔雌醚+牛膝多糖組凋亡細胞數(shù)量下降至154.5，顯著低于炔雌醚組(P< 0.01)；但仍顯著高于牛膝多糖組和對照組(P<0.01)。

2.3 精子質(zhì)量 炔雌醚造成精子數(shù)量、活性和頂體完整率下降49.45%、40.74%(P<0.01)和16.54%(P<0.05)，畸形率升高48.03%(P<0.01)(表2)。精子畸形包括精子頭部、體部和尾部畸形；頭部畸形分為頭部過大、無定形及雙頭等；體部畸形分為彎折、殘缺等；尾部畸形分為彎折、卷曲及缺失等。與炔雌醚組相比，牛膝多糖+炔雌醚精子數(shù)量和活性均升高(P<0.01)，畸形率升高27.39%(P<0.01)。牛膝多糖單獨處理組與對照組相比，精子品質(zhì)無顯著變化。

2.4 抗氧化酶活性變化 對照組睪丸SOD、GSH-Px和T-AOC活性分別為142.63 U/mL、50.12 U/L和12.14 U/mL；MDA和NO含量分別為4.58 nmol/mL和11.56 μmol/ L(表3)。牛膝多糖組抗氧化酶活性有所提高，差異不顯著。與對照組相比，炔雌醚組抗氧化酶活性下降，MDA和NO含量升高，差異極顯著(P<0.01)。與炔雌醚組相比，炔雌醚+牛膝多糖處理顯著升高抗氧化功能。

表2炔雌醚與牛膝多糖對精子質(zhì)量的影響

分組精子數(shù)量(106/mL)精子活性/%畸形率/%頂體完整率/%炔雌醚+牛膝多糖60.2±8.86B60.8±7.22B27.3±5.05a74.4±7.52a炔雌醚41.5±4.84C44.8±8.65C37.6±6.64a68.1±8.70b牛膝多糖82.5±9.65A77.2±9.34A23.7±4.82b84.5±7.83a對照組82.1±10.12A75.6±8.52A25.4±5.56b81.6±9.58a

注：數(shù)據(jù)表達為平均值±標(biāo)準差。肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(a and b:P<0.05)

表3炔雌醚與牛膝多糖對睪丸抗氧化功能的影響

分組超氧化物歧化酶谷胱甘肽過氧化物酶總抗氧化能力丙二醛一氧化氮炔雌醚+牛膝多糖128.65±28.37A42.38±6.23A9.44±2.48B5.28±1.63B15.48±3.52B炔雌醚88.62±25.65B27.26±5.81B6.68±1.37C7.28±1.65A24.35±6.23A牛膝多糖150.34±24.75A52.28±5.32A12.58±2.26A4.07±0.58B10.42±2.16C對照組142.63±28.54A50.12±6.04A12.14±2.15A4.58±0.62B11.56±2.57B

3 討論

3.1 牛膝多糖對成年雄性大鼠生精細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用 炔雌醚是一種合成的脂溶性雌激素，通過污水排放和動物排泄物進入環(huán)境，是最重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一[6]。炔雌醚造成大鼠、小鼠及蒙古沙鼠睪丸、附睪、精囊腺、前列腺重量、精子數(shù)量及質(zhì)量等下降，并破壞氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡、抑制生殖激素分泌[1]。牛膝多糖作為一種綠色天然的抗氧化劑，能夠增強抗氧化功能、調(diào)節(jié)細胞凋亡。崔培等研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖顯著提高肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和溶菌酶(LZM)活性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖抑制炔雌醚造成的大鼠睪丸氧化應(yīng)激和生精細胞凋亡，改善睪丸組織結(jié)構(gòu)、增加睪丸、附睪、精囊腺和前列腺的重量，增加附睪內(nèi)精子數(shù)量，減少畸形率，提高精子活性。牛膝多糖抑制炔雌醚對雄性生殖的破壞作用可能歸功于其對抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)作用。

3.2 牛膝多糖對雄性大鼠睪丸抗氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用 機體內(nèi)SOD、GSH-Px、維生素、三肽及還原劑等可清除活性氧和脂質(zhì)過氧化物，維持氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡；一旦該平衡被打破，氧化應(yīng)激將發(fā)生，誘發(fā)生精細胞凋亡，降低精子質(zhì)量，破壞雄性生殖功能。本試驗結(jié)果顯示，炔雌醚誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進生精細胞凋亡，牛膝多糖顯著提高大鼠睪丸SOD、GSH-Px和T-AOC活性，降低NO和MDA含量，緩解炔雌醚誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減少炔雌醚誘導(dǎo)的生精細胞過度凋亡，抑制炔雌醚對抗氧化功能的破壞作用。有研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖上調(diào)Bcl-2和Survivin表達，下調(diào)Fas、bax 和p53表達降低，減少腎、視網(wǎng)膜和腦細胞凋亡[8-9]。本結(jié)果表明，牛膝多糖增強大鼠抗氧化功能，抑制生精細胞凋亡可能是其調(diào)節(jié)雄性生殖功能的重要途徑之一。本研究首次發(fā)現(xiàn)牛膝多糖緩解炔雌醚引起的大鼠抗氧化功能下降、生精細胞凋亡和精子品質(zhì)異常，發(fā)揮對雄性生殖功能的保護作用，有助于探尋防治生殖功能損傷的新調(diào)控途徑和中藥制劑開發(fā)。

[1] Shen W, Shi D, Wang D,etal. Inhibitive effects of quinestrol on male testes in Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus)[J]. Res Vet Sci, 2012, 93(2): 907-913.

[2] Li J, Chen F, Li C,etal. Quinestrol induces spermatogenic apoptosis in vivo via increasing pro-apoptotic proteins in adult male mice[J]. Tissue Cell, 2014a, 46(5): 318-325.

[3] Agarwal A, Saleh R A, Bedaiwy M A. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction[J]. Fertil Steril, 2003, 79(4):829-843.

[4] 封海波，劉娟，宋振輝，等．川牛膝多糖對口蹄疫疫苗受免小鼠樹突狀細胞成熟的影響．中國獸醫(yī)雜志，2014, 50(3):18-20.

[5] 李金貴，谷文英，劉傳敏，等．牛膝多糖對環(huán)磷酰胺致小鼠免疫抑制作用的影響[J]．中國獸醫(yī)雜志，2010, 46(4): 24-25.

[6] Tang T, Qian K, Shi T,etal. Photodegradation of quinestrol in waters and the transformation products by UV irradiation[J]. Chemosphere, 2012, 89:1 419-1 425.

[7] 崔培，范耘碩，白東清，等．牛膝多糖對血鸚鵡部分非特異性免疫與脂類代謝指標(biāo)的影響[J]．大連海洋大學(xué)學(xué)報，2016,21(4):397-403.

[8] 楊旭東，張杰，包海花．牛膝多糖對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響[J]．中國中醫(yī)眼科雜志，2011, 1:8-10.

[9] 張杰，楊旭東，宋高臣．牛膝多糖對糖尿病大鼠腦組織保護作用及其機制[J]．中醫(yī)藥通報, 2010, 9(5): 58-59.