許江城 ， 劉 斌 ， 蔡京美 ， 金孟燮 ， 佘銳萍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ; 2.北京韓美藥品有限公司 ， 北京 順義 101312)

免疫抑制動(dòng)物模型在新藥開發(fā)與評(píng)價(jià)中廣泛使用，現(xiàn)有研究多使用成年動(dòng)物建模[1-2]。由于幼齡個(gè)體與成年個(gè)體在藥物代謝和藥效方面不完全一致，使用幼齡動(dòng)物模型進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)幼齡個(gè)體用藥已經(jīng)成為共識(shí)并得到各國(guó)藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)的推薦。

目前幼齡大鼠免疫抑制模型的相關(guān)報(bào)道較少。參考成年動(dòng)物研究[3-5]，觀察本課題組建立的幼齡大鼠環(huán)磷酰胺(CYP)免疫抑制模型，探索血液學(xué)和腸道黏膜免疫指標(biāo)變化特點(diǎn)，為模型今后的應(yīng)用提供更多數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性4周齡SD大鼠60只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)在北京韓美藥品有限公司動(dòng)物房屏障環(huán)境內(nèi)(許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0013)，試驗(yàn)經(jīng)IACUC委員會(huì)批準(zhǔn)，獨(dú)立通風(fēng)籠架(IVC)飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

1.2 儀器和試劑 儀器：SYSMEX XT-2000i血液分析儀，日立7020生化分析儀。試劑：希斯美康血液分析試劑，美康生化分析試劑，PAS染色試劑盒(Sigma公司,395B-1KT)，環(huán)磷酰胺單水合物(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，sIgA一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0645R)。

1.3 試驗(yàn)分組 環(huán)磷酰胺免疫抑制模型組隨機(jī)選取30只雌性4周齡SD大鼠口服給與環(huán)磷酰胺30 mg/kg體重隔1日共2次，剩余30只編入對(duì)照組。

1.4 體重和臨床觀察 自第一次給藥起，共觀察14 d。臨床觀察包含死亡數(shù)，一般健康狀況和毒性癥狀。每日稱量大鼠體重并記錄(n=10)。

1.5 血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 第2、4、8、15天，測(cè)定紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)(NEUT)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYMPH)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(EO)、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)(BASO)、單核細(xì)胞數(shù)(MONO)和網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)(RET)。

1.6 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 4 d時(shí)測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(T-BIL)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、血清尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、血清葡萄糖(GLU)。計(jì)算得到白球比例(白球比，A/G=白蛋白/球蛋白)和球蛋白(GLO，總蛋白-白蛋白)。

1.7 小腸腸道黏膜免疫指標(biāo)的檢測(cè) 15 d大鼠剖檢取材，計(jì)數(shù)小腸派氏結(jié)(Peyer′s Patch, PP)后中性多聚甲醛固定。腸道石蠟切片H.E.染色后光鏡檢查，記錄5個(gè)視野內(nèi)5根腸絨毛的長(zhǎng)度寬度和隱窩深度，100個(gè)上皮細(xì)胞之間的淋巴細(xì)胞(Intraepithelial lymphocyte, IEL)數(shù)。PAS染色記錄不同腸段內(nèi)5根絨毛內(nèi)100個(gè)上皮細(xì)胞之間的杯狀細(xì)胞(Goblet cell，gc)數(shù)。sIgA免疫組化染色記錄5個(gè)視野內(nèi)分泌型免疫球蛋白A(secretory IgA))陽(yáng)性區(qū)域面積。

1.8 數(shù)據(jù)采用x±s表示，使用GraphPad PRISM?6.0版本軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重變化與臨床表現(xiàn) 試驗(yàn)期間模型組大鼠未見死亡與異常表現(xiàn)。對(duì)照組大鼠體重增加(105.8±6.0，205.5±16.9 g：d1，d14)，模型組大鼠體重雖增加但增長(zhǎng)緩慢(106.7±4.5，171.4±8.9 g：d1，d14)。自4 d起體重與對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05)，4 d降幅15%而14 d降幅17%。

2.2 血液學(xué)指標(biāo)的變化 如表1所示，4周齡大鼠與對(duì)照組相比多項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)顯著下降(P<0.05)，但變化趨勢(shì)各有特點(diǎn)。白細(xì)胞總數(shù)降幅最高為第8天(81%)，第15天時(shí)部分恢復(fù)。嗜中性粒細(xì)胞數(shù)降幅最高為第8天(82%)，第15天恢復(fù)并增加16%。淋巴細(xì)胞降幅最高為第8天(84%)，第15天時(shí)仍降低35%。單核細(xì)胞第4天時(shí)為最大降幅(96%)，第8天是恢復(fù)至正常水平，第15天時(shí)升高62%。紅細(xì)胞僅8天時(shí)顯著降低，第15天恢復(fù)，網(wǎng)織紅細(xì)胞第4天是最低，第15天時(shí)超過(guò)對(duì)照組水平。

表1 模型中幼齡大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化

注：Con(對(duì)照組)，CYP(環(huán)磷酰胺模型組)。*：P<0.05，模型組與當(dāng)日對(duì)照組相比

2.3 血清生化指標(biāo)的變化 如表2所示，4周齡大鼠第4天時(shí)血清球蛋白與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。肝功(ALT，AST，ALP，A/G，T-BIL)、腎功(CREA，BUN)、心肌(CK，LDH)、代謝(TG，T-CHO，GLU)相關(guān)指標(biāo)均在機(jī)體正常范圍內(nèi)且無(wú)病理變化。

2.4 小腸腸道黏膜免疫指標(biāo)變化 如圖1所示，小腸段PP數(shù)量與對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05)，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)，杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。如中插彩版圖2所示腸道sIgA陽(yáng)性面積降低，腸道sIgA分泌量減少。腸絨毛發(fā)育指標(biāo)中腸絨毛高度、絨毛寬度及隱窩深度與對(duì)照組相比無(wú)明顯影響，與對(duì)照組均無(wú)明顯差異。

表2 模型中幼齡大鼠血清生化指標(biāo)變化

注：Con(對(duì)照組)，CYP(環(huán)磷酰胺模型組)。*：P<0.05，模型組與當(dāng)日對(duì)照組相比

圖1 幼齡大鼠腸道黏膜免疫指標(biāo)的變化

A：PP數(shù)量顯著下降； B：IEL數(shù)量顯著降低； C：gc數(shù)量顯著降低。

*：P<0.05， **：P<0.01，模型組與對(duì)照組相比

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種無(wú)活性的前藥，在體內(nèi)代謝后發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。免疫抑制作用多表現(xiàn)為生長(zhǎng)抑制，外周血細(xì)胞數(shù)量減少，免疫器官萎縮，免疫細(xì)胞功能抑制等[1,4-6]。環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制在成年動(dòng)物模型中已有眾多報(bào)道，而使用幼齡大鼠建立的免疫抑制模型和其免疫抑制特點(diǎn)研究還非常缺乏。此階段動(dòng)物建立的模型適用于評(píng)價(jià)低年齡段個(gè)體的用藥情況。

SD大鼠在4周齡時(shí)正處于一個(gè)非常快速的生長(zhǎng)發(fā)育階段，除體重增長(zhǎng)明顯外白細(xì)胞數(shù)量也較高[7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4周齡幼齡雌性大鼠在CYP免疫抑制模型中表現(xiàn)出以下變化特點(diǎn)：大鼠生長(zhǎng)發(fā)育抑制，外周血中白細(xì)胞總數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞數(shù)和單核細(xì)胞數(shù)顯著減少。其中淋巴細(xì)胞恢復(fù)速度最慢，單核細(xì)胞回升最快并代償性增高超過(guò)對(duì)照組水平。血清GLO降低說(shuō)明抗體水平下降。模型中，固有免疫水平和獲得性免疫水平均受到抑制。固有免疫水平在15 d時(shí)恢復(fù)程度較獲得性免疫高。

圖2 杯狀細(xì)胞與分泌型IgA的變化

▲： 杯狀細(xì)胞 ； ●：sIgA免疫組化陽(yáng)性顆粒A： 對(duì)照組gc ； B： CYP模型組gc數(shù)量降低 ； C： 對(duì)照組sIgA陽(yáng)性區(qū)域 ； D： CYP模型組sIgA陽(yáng)性區(qū)域面積減少

腸黏膜免疫屏障是機(jī)體防御系統(tǒng)重要組成部分，有研究報(bào)道CYP可以引起成年大鼠PP以及gc數(shù)量減少[8-9]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)幼齡動(dòng)物的表現(xiàn)與成年動(dòng)物相類似。在PP、gc顯著減少的同時(shí)，IEL數(shù)量與sIgA的量也較對(duì)照組顯著下降。證明腸道黏膜免疫水平如同外周血細(xì)胞一樣也受到CYP較強(qiáng)的抑制作用。而小腸絨毛的發(fā)育(長(zhǎng)度、寬度和隱窩深度)則未見顯著影響。

綜上所述，4周齡雌性SD大鼠在模型中表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)遲緩與血液固有免疫水平和獲得性免疫水平降低，而未見其他毒性和副作用。其中白細(xì)胞及其分類細(xì)胞數(shù)量和PP數(shù)量變化顯著、檢測(cè)便捷、免疫抑制相關(guān)性高，推薦在模型使用中優(yōu)先選擇。幼齡大鼠免疫抑制后的變化特點(diǎn)，為模型在低齡兒童或動(dòng)物藥品、保健食品、化妝品、農(nóng)藥等研發(fā)或評(píng)估中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

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