沈海瀅+王曉倩+王云云+屈鋒

摘 要 以熔融石英毛細(xì)管為免疫分析載體材料， 以腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）為模型蛋白， 將AFP捕獲抗體固定于毛細(xì)管， AFP和AFP的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體分別注入毛細(xì)管進(jìn)行孵育， 形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。注入化學(xué)發(fā)光底物液后， HRP催化底物液發(fā)光， 產(chǎn)生的光信號通過成像儀轉(zhuǎn)化為圖片。對圖片進(jìn)行灰度值分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析檢測法。當(dāng)捕獲抗體稀釋倍數(shù)為100， 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為200， 化學(xué)發(fā)光曝光時間為20 s時， 本方法可在3.1～50 ng/mL濃度范圍實(shí)現(xiàn)甲胎蛋白測定， 檢出限為2.7 ng/mL。對20例人血清臨床實(shí)際樣本進(jìn)行檢測， 結(jié)果令人滿意， 加標(biāo)回收率在96.0%～106.7%之間。本方法樣本消耗少、材料簡單、檢測成本低、不依賴大型儀器、 適用性廣， 具有較好的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 石英毛細(xì)管； 甲胎蛋白； 免疫分析； 灰度分析

1 引 言

隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的快速發(fā)展和人們對健康保健的日益重視， 社會對實(shí)用性的檢測技術(shù)需求越來越多， 體外診斷的新方法、新技術(shù)已成為生物分析檢測的熱點(diǎn)和重點(diǎn)研發(fā)方向。目前， 低成本、操作簡便、小型化的體外診斷方法和裝備的研究正受到科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)療檢測市場的廣泛關(guān)注。

現(xiàn)有的體外診斷產(chǎn)品中， 免疫檢測類產(chǎn)品占比很大， 主要采用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法以及膠體金免疫層析法[1～3]。前兩者以微孔板為檢測載體， 技術(shù)較成熟， 但檢測時間較長， 一般需要2～3 h； 電化學(xué)發(fā)光法主要基于磁珠捕獲抗原進(jìn)行檢測， 檢測速度快， 一般可在30 min內(nèi)完成， 但檢測成本較高， 約為酶聯(lián)免疫吸附法的3～4倍； 放射性免疫檢測靈敏度高， 但對操作環(huán)境及操作人員要求很高； 膠體金免疫層析檢測速度快， 可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測， 但難以實(shí)現(xiàn)定量分析。近年來， 一些學(xué)者報(bào)道了基于納米材料及微流控技術(shù)的新型體外免疫診斷方法， 但納米材料的制備較難控制其穩(wěn)定性， 真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的并不多見[4，5]。本課題組多年從事毛細(xì)管電泳生物醫(yī)藥分析研究， 所用的分離載體是熔融石英毛細(xì)管， 其性質(zhì)穩(wěn)定， 透光性好， 表面易進(jìn)行物理、化學(xué)修飾， 加工工藝成熟， 成本低廉[6～10]。本實(shí)驗(yàn)將熔融石英毛細(xì)管用于免疫檢測的載體材料， 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫檢測方法， 目的是實(shí)現(xiàn)基于石英毛細(xì)管材料和灰度分析的定量免疫檢測。傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測器大多采用光電倍增管， 檢測區(qū)域有限， 分析速度慢， 而以電感耦合器件（CCD）為代表的圖像傳感器則可以提供更加廣泛的檢測區(qū)域， 具有光電轉(zhuǎn)換效率高、動態(tài)線性范圍寬、多通道同時分析等優(yōu)點(diǎn)， 成為未來生物傳感器的一個發(fā)展方向[11，12]。實(shí)驗(yàn)中使用的便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀采用制冷CCD， 靈敏度高， 體積小， 僅有0.006 m3， 能夠高效捕獲化學(xué)發(fā)光信號， 形成圖片?；叶仁侵负诎讏D像中點(diǎn)的顏色深度， 灰度分析法具有結(jié)果直觀， 分析快速等優(yōu)點(diǎn)， 在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、圖像識別領(lǐng)域有廣泛的用途[13]， 很多體外診斷試劑的檢測應(yīng)用也采用灰度值分析方法[14]。

本研究以熔融石英毛細(xì)管為載體， 建立了基于灰度分析的免疫檢測方法。以腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）為模型蛋白， 通過雙抗體夾心方式進(jìn)行檢測， 與抗體偶聯(lián)的辣根過氧化物酶（HRP）催化化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)光， 產(chǎn)生的光信號通過成像儀轉(zhuǎn)化為圖片[12，15，16]， 進(jìn)行灰度值分析。研究結(jié)果表明， 毛細(xì)管免疫檢測和灰度分析結(jié)合， 實(shí)際使用的樣本量僅為0.8 μL， 而ELISA檢測一般需要50 μL， 因此本方法大幅降低了樣本使用量。檢測過程中僅需石英毛細(xì)管、醫(yī)用注射器等常用耗材， 操作簡單， 不依賴大型儀器。所建方法具有普適性， 可用于基于化學(xué)發(fā)光免疫分析的生物標(biāo)志物的快速檢測。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑：

便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀（國家納米科學(xué)中心研制）； 熔融石英毛細(xì)管（北京華陽利民儀器有限公司）； 醫(yī)用注射器（北京科龍生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）； 表面活化劑（美國Anteo Technologies公司）； 磷酸鹽緩沖液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德國Merck公司）； AFP捕獲抗體、AFP的HRP酶標(biāo)抗體及AFP標(biāo)準(zhǔn)液（北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司）； 癌胚抗原（CEA）標(biāo)準(zhǔn)液、前列腺特異性抗原（PSA）標(biāo)準(zhǔn)液、糖類抗原125（CA125）標(biāo)準(zhǔn)液及糖類抗原199（CA199）標(biāo)準(zhǔn)液（北京沫之東生物技術(shù)有限公司）； 化學(xué)發(fā)光底物液（美國Millipore公司）； 實(shí)驗(yàn)用水由Millipore純水儀制備。

2.2 分析方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)操作步驟 實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示：（1）活化毛細(xì)管 將毛細(xì)管裁剪為10 cm長， 使用醫(yī)用注射器將表面活化劑注入毛細(xì)管， 室溫靜置30 min， 對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行活化后， 用水沖洗。（2）固定捕獲抗體及封閉 將AFP的捕獲抗體按照一定比例用PBS稀釋， 將稀釋液注入毛細(xì)管內(nèi)部， 室溫靜置1 h后再用PBS清洗， 將含5% BSA的PBS溶液注入毛細(xì)管中， 室溫靜置30 min進(jìn)行封閉。（3）注入待測蛋白 將待測蛋白AFP溶液注入到毛細(xì)管， 室溫孵育30 min后用PBS清洗。（4）注入酶標(biāo)抗體及化學(xué)發(fā)光底物液 將稀釋為一定濃度的HRP酶標(biāo)抗體注入毛細(xì)管， 室溫孵育30 min， PBS沖洗后注入化學(xué)發(fā)光底物液。

2.2.2 成像分析 將化學(xué)發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為圖片形式， 進(jìn)行成像灰度分析。毛細(xì)管置于成像儀中， 選擇一定的曝光時間， 檢測化學(xué)發(fā)光信號。毛細(xì)管中的化學(xué)發(fā)光底物在酶標(biāo)抗體上HRP酶的催化作用下產(chǎn)生的光信號轉(zhuǎn)化為圖片。圖片上的灰度值表示待測蛋白AFP抗原的濃度。通過ImageJ軟件分析圖片， Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 毛細(xì)管內(nèi)徑對檢測的影響

市售毛細(xì)管有多種內(nèi)徑， 考察了不同內(nèi)徑毛細(xì)管對檢測的影響。毛細(xì)管內(nèi)徑不同， 可提供抗體結(jié)合的位點(diǎn)面積不同。內(nèi)徑較小的毛細(xì)管， 可節(jié)省樣品， 但內(nèi)壁表面積較小， 可吸附的捕獲抗體的量較小， 因而后續(xù)可結(jié)合的抗原以及酶標(biāo)抗體也較少， 故化學(xué)發(fā)光信號較弱， 灰度低， 不利于靈敏檢測。較大內(nèi)徑的毛細(xì)管所提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量增加， 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也增加， 化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)。考察了50， 75， 100， 150和200 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管， 分別檢測相同濃度的AFP， 比較其灰度強(qiáng)度。結(jié)果表明， 灰度強(qiáng)度所指示的化學(xué)發(fā)光信號與AFP濃度呈正相關(guān)（圖2和圖3）。灰度照片和灰度強(qiáng)度均顯示毛細(xì)管內(nèi)徑對AFP檢測有明顯影響。使用50 μm毛細(xì)管， 灰度強(qiáng)度較弱； 內(nèi)徑增加到75 μm， 灰度強(qiáng)度增大； 使用100 μm內(nèi)徑毛細(xì)管， 灰度較強(qiáng)且均勻； 當(dāng)內(nèi)徑大于100 μm時， 信號強(qiáng)度降低， 且在橫截面方向上信號分布不均。理論上， 大內(nèi)徑的毛細(xì)管可提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量多， 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也多， 可使信號線性增強(qiáng)， 直至趨于飽和。然而由圖2可見， 150 μm內(nèi)徑時信號不均。 可能是由于與拍攝方向相切的內(nèi)壁上下沿區(qū)域光程較長， 出現(xiàn)內(nèi)壁上下沿信號較強(qiáng)， 中部信號偏弱的現(xiàn)象?；叶刃盘柌痪鶆虿焕跍?zhǔn)確分析， 且增加了各種試劑和樣品用量。因此， 實(shí)驗(yàn)選擇內(nèi)徑100 μm的毛細(xì)管。

3.2 免疫分析的條件優(yōu)化

3.2.1 捕獲抗體濃度 捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)的固定效果很大程度上決定了檢測的靈敏度。通常捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的密度越高， 檢測靈敏度越高， 但過高濃度的捕獲抗體， 會造成過飽和， 浪費(fèi)抗體試劑。本實(shí)驗(yàn)中， 固定AFP濃度和酶標(biāo)抗體濃度， 對捕獲抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化， 將所購的捕獲抗體稀釋， 稀釋倍數(shù)為25， 50， 100， 150， 200， 250和300倍， 比較檢測的灰度值。當(dāng)捕獲抗體的稀釋倍數(shù)為150， 200， 250和300倍時， 隨稀釋倍數(shù)增大， 溶液濃度降低， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號逐漸減小， 說明溶液中的捕獲抗體濃度偏低， 固定到毛細(xì)管內(nèi)壁的捕獲抗體量較少， 不能充分結(jié)合抗原， 故化學(xué)發(fā)光值隨稀釋倍數(shù)增大而降低， 灰度值減??； 當(dāng)稀釋倍數(shù)為50和25倍時， 捕獲抗體的濃度因稀釋比例小而保持較高的水平， 但其化學(xué)發(fā)光信號卻與捕獲抗體稀釋100倍時相當(dāng)， 并未增強(qiáng)， 說明當(dāng)捕獲抗體稀釋倍數(shù)為100時， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號趨于飽和， 增加濃度不再使抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的分布密度增加， 且當(dāng)稀釋倍數(shù)為100時， 結(jié)合到毛細(xì)管內(nèi)壁上的捕獲抗體能夠完全結(jié)合抗原。因此， 選擇稀釋100倍為捕獲抗體最佳的稀釋比例（圖4）。

3.2.2 酶標(biāo)抗體溶度

酶標(biāo)抗體的濃度也直接影響檢測結(jié)果。如果酶標(biāo)抗體濃度偏低， 不能與抗原充分結(jié)合， 就會造成實(shí)際檢測信號值偏低。如果酶標(biāo)抗體濃度偏高， 雖然反應(yīng)充分， 但是可能浪費(fèi)試劑。實(shí)驗(yàn)中， 固定捕獲抗體稀釋倍數(shù)和AFP抗原濃度， 對檢測抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化。將所購的酶標(biāo)抗體稀釋， 稀釋倍數(shù)為100， 150， 200， 250， 300和350倍， 比較不同稀釋濃度的灰度值。結(jié)果表明， 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為250， 300， 350倍時， 隨稀釋比例增大， 酶標(biāo)抗體濃度降低， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號逐漸減小， 說明酶標(biāo)抗體濃度偏低， 反應(yīng)不充分； 稀釋倍數(shù)為150和100倍時， 酶標(biāo)抗體濃度隨稀釋比例減小而增大， 但灰度值與稀釋倍數(shù)200時相比未見增加。說明稀釋倍數(shù)為200時， 灰度值趨于飽和， 抗原抗體結(jié)合較為充分。因此， 酶標(biāo)抗體最佳的稀釋倍數(shù)為200倍。

3.2.3 孵育時間

孵育時間是免疫檢測的重要參數(shù)。如孵育時間過短， 反應(yīng)進(jìn)行不充分， 影響檢測的靈敏度。若孵育時間過長， 則耗時過長。本實(shí)驗(yàn)對孵育時間進(jìn)行優(yōu)化。室溫下， 將AFP抗原及AFP酶標(biāo)抗體的孵育時間分別設(shè)定為5， 15， 30， 60和90 min， 比較灰度值變化。結(jié)果表明， 孵育15 min 的灰度值即化學(xué)發(fā)光信號比孵育5 min時明顯升高， 說明5和15 min的孵育時間偏短， 反應(yīng)尚不充分； 孵育時間設(shè)為30， 60和90 min時， 灰度值沒有增加。說明孵育時間為30 min時， 灰度值趨于飽和， 免疫反應(yīng)較為充分。因此， 選擇最佳孵育時間30 min（圖5）。

3.2.4 曝光時間優(yōu)化 曝光時間是化學(xué)發(fā)光免疫檢測的重要參數(shù)。曝光時間過長， 會造成高濃度AFP檢測信號過飽和； 曝光時間過短， 會造成低濃度AFP檢測信號微弱， 都不利于圖像分析， 因此有必要對曝光時間進(jìn)行優(yōu)化。固定捕獲抗體及酶標(biāo)抗體濃度， 對高濃度（100 ng/mL）和低濃度（3 ng/mL）的AFP分別進(jìn)行檢測， 曝光時間為5， 10， 15， 20 和25 s， 選擇同時滿足高濃度和低濃度AFP抗原檢測的合適曝光時間。當(dāng)曝光時間為15 s時， 3 ng/mL AFP抗原灰度值較弱， 無法進(jìn)行圖像分析， 增加曝光時間， 灰度值增加。當(dāng)曝光時間為25 s時， 100 ng/mL AFP抗原灰度值出現(xiàn)過飽和， 不利于分析。因此， 20 s為最佳曝光時間， 能夠滿足檢測需求。

3.3 灰度分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線

選擇3.1～50 ng/mL濃度范圍的AFP樣品溶液， 測定其灰度值。 灰度值Y與AFP濃度X的關(guān)系為：

Y=

42.9328+53.8242log（X1.5625 ng/mL）2

式中， X的單位為ng/mL。Y與X二者呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（圖6）， R=0.992。稀釋AFP樣品， 通過灰度分析， 測定方法的檢出限為2.7 ng/mL。

在目前的臨床檢驗(yàn)中， 只有當(dāng)AFP濃度超過20 ng/mL時， 該結(jié)果才具有一定的臨床診斷意義[17，18]。本方法對AFP的檢測范圍在3.1～50 ng/mL之間， 為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3.4 檢測特異性

特異性是評價免疫檢測的重要指標(biāo)之一， 通常用交叉反應(yīng)率表示。實(shí)驗(yàn)中， 分別在血清加入中可能存在的干擾物CEA、 PSA、 CA125和CA199， 在最佳條件下測定。結(jié)果表明， 交叉反應(yīng)率均小于0.5%， 說明上述潛在的干擾組分對檢測結(jié)果影響小， 方法的檢測特異性好[19]， 抗干擾能力強(qiáng)。

3.5 檢測準(zhǔn)確性

評估體外診斷試劑準(zhǔn)確性的方法主要有方法學(xué)比對和回收實(shí)驗(yàn)兩種。方法學(xué)比對是將兩種不同的檢測體系所得結(jié)果進(jìn)行比較， 在臨床化學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道中較為常見[20～22]。將本方法與目前大型醫(yī)院廣泛使用的Roche電化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行方法學(xué)比對。實(shí)際臨床樣本來源于解放軍總醫(yī)院， 使用采血管收集人全血， 在室溫中沉降30 min后， 3000 r/min離心5 min， 收集上層血清， 4℃儲存?zhèn)溆?。獲取的20例血清樣本分別采用兩種方法進(jìn)行分析檢測， 結(jié)果見圖7。兩種方法的線性回歸方程為y=0.148+11095x， R=0.980， 說明兩種方法的相關(guān)性良好， 本方法具有較高準(zhǔn)確性， 能夠滿足臨床檢測要求。通過回收實(shí)驗(yàn)評價本方法的準(zhǔn)確性。選用3份人血清， 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測定其AFP濃度， 然后分別向血清中加入AFP標(biāo)準(zhǔn)液， 再次測定其AFP濃度。重復(fù)5次， 計(jì)算得回收率在96.0%～106.7%之間（表1）， 說明本檢測方法的準(zhǔn)確性較好[20]。

4 結(jié) 論

以熔融石英毛細(xì)管為免疫分析載體材料， 通過化學(xué)發(fā)光成像和灰度分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析檢測方法。本方法可在3.1～50 ng/mL 濃度范圍實(shí)現(xiàn)甲胎蛋白檢測， 覆蓋了臨床應(yīng)用的關(guān)鍵濃度， 為本方法的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?；诿?xì)管為載體的灰度分析免疫檢測方法的樣本消耗少、載體材料簡單、檢測成本低廉， 且不依賴大型儀器， 適用化學(xué)發(fā)光免疫分析， 具有普適性和較好的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用前景。

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Abstract A fused quartz capillary was taken as the carrier for the immunoassay of the tumor marker alpha fetal protein （AFP） as a model protein. The capture antibody of AFP was immobilized in capillary. Based on a sandwich immunoassay format， the antigen and corresponding horseradish peroxidase （HRP） labeled antibodies were introduced into the capillary for online incubation. After the injection of the chemiluminescence substrate， the chemiluminescence signals were captured by the CCD camera and changed into figures. The results could be read by gray level analysis of the figures. When the capture antibody was diluted 100 times， the enzyme labeled antibody was diluted 200 times， and the exposure time was 20 s， the detection range of AFP was 3.1-50 ng/mL and the critical concentrations of 20 ng/mL clinical applications were covered. The limit of detection was 2.7 ng/mL. Twenty clinical samples were tested with fine accuracy. The recoveries of the spiked samples were between 96.0% and 106.7%. In the assay， the sample consumption was low and the experimental material was simple and cheap. The method does not require large instruments， and is appropriate for clinical application

Keywords Quartz capillary； Alpha fetal protein； Immunoassay； Gray level analysis