毛寧，孫蕾，梁佳元，楊立軍，王毳

（遼寧省疾病預防控制中心結(jié)核病防制所，遼寧沈陽110005）

論著

遼寧地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性及其與基因型的關系

毛寧，孫蕾，梁佳元，楊立軍，王毳

（遼寧省疾病預防控制中心結(jié)核病防制所，遼寧沈陽110005）

目的探討遼寧省結(jié)核分枝桿菌耐藥性與北京基因型的關聯(lián)，為遼寧省耐藥結(jié)核病的防治提供科學依據(jù)。方法選取2009～2010年遼寧省收集的結(jié)核分枝桿菌菌株，采用比例法測定其耐藥性，耐藥結(jié)核菌中隨機選取119株，敏感結(jié)核菌中隨機選取49株作為對照，采用聚合酶鏈反應對其進行基因分型。結(jié)果49株敏感株中，北京基因型為43株，119株耐藥菌中單耐藥株47株、多耐藥株29株、耐多藥株39株、廣泛耐藥株4株；敏感與各種耐藥結(jié)核分枝桿菌中北京基因型結(jié)核分枝桿菌所占比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論遼寧省結(jié)核分枝桿菌以北京基因型家族為主要流行的菌株，且與耐藥性無關

結(jié)核分枝桿菌；北京基因型；耐藥性；基因分型

結(jié)核是一種慢性傳染病，每年造成全球約200萬人死亡，我國結(jié)核患者人數(shù)居世界第3位[1]。遼寧省是高耐藥結(jié)核的省份，高比例的耐藥結(jié)核，尤其耐多藥結(jié)核的增加成為結(jié)核防控的障礙，了解遼寧省結(jié)核分枝桿菌，尤其耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學特點對于有效防控結(jié)核具有流行病學意義。

中國的東北部、俄羅斯、日本等許多國家和地區(qū)以北京基因型結(jié)核分枝桿菌流行為主。隨著對“北京家族”菌株研究的深入，專家學者研制一些鑒定“北京家族”菌株的方法。其中，間隙寡核苷酸分型（Spoligotyping）是公認的鑒定“北京家族”菌株的金標準[2]，但實驗費用高，操作繁瑣。WARREN等[3]采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）特異地鑒定非洲流行的結(jié)核分枝桿菌為“北京家族”結(jié)核分枝桿菌和非“北京家族”結(jié)核分枝桿菌。并與Spoligotyping方法相比較，該法的特異性、敏感性達100％。本研究采用該法鑒定遼寧省流行的結(jié)核分枝桿菌，隨機選取119株耐藥結(jié)核分枝桿菌，另隨機選取49株敏感結(jié)核分枝桿菌作為對照，探討遼寧地區(qū)結(jié)核菌北京家族基因型與耐藥性是否相關。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株來源168株臨床分離株于2009～2010年分離自遼寧省各市結(jié)核病防制所。按《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》進行分枝桿菌分離培養(yǎng)，并已鑒定為結(jié)核分枝桿菌，耐藥結(jié)核分枝桿菌中隨機選取119株，敏感結(jié)核分枝桿菌中隨機選取49株。標準菌株H37Rv來自中國疾病預防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室，作為本實驗的對照菌株。

1.1.2 主要試劑100 bp DNA分子標記物（DNA Marker）購自法國Transgen股份有限公司，PCR反應試劑盒購自北京普洛麥格生物技術有限公司，北京基因型結(jié)核分枝桿菌引物由沈陽匯佰生物科技有限公司合成。

1.1.3 PCR引物序列沈陽匯佰生物科技有限公司合成北京基因型結(jié)核分枝桿菌引物1，擴增片段長度為393 bp，正向引物：5'-TTCAACCATCGCCGCCT CTAC-3'，反向引物：5'-CACCCTCTACTCTGCGCTTT G-3'。非北京基因型結(jié)核分枝桿菌引物3，擴增片段長度為569 bp，正向引物：5'-GATCGCTTGTTCTCAG TGCAG-3'，反向引物：5'-CGAAGGAGTACCACGTGG AG-3'。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐藥性檢測按《結(jié)核分支桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》中的比例法進行結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測，菌種鑒定。

1.2.2 基因型鑒定①細菌DNA的制備：取一環(huán)常規(guī)L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)生長良好的結(jié)核菌溶于300μl蒸餾水，95℃金屬浴滅活20 min，超聲裂解15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清備用；②PCR檢測：采用25μl PCR反應體系，模板DNA 2μl，PCR MIX 14.625 μl，正反向引物各1 μl，無核酸水6.375 μl；PCR反應條件：95℃預變性15 min，94℃變性1 min， 62℃退火1 min，72℃延伸1 min，共45個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。2％瓊脂糖凝膠，100 V電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，定性資料的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

附圖引物1和引物3分別擴增1～11遼寧省流行結(jié)核分枝桿菌PCR反應

2.1 藥物敏感性

119株耐藥結(jié)核分枝桿菌中單耐藥株47株（39.50％），多耐藥株29株（25.00％），耐多藥株39株（32.77％），廣泛耐藥株4株（3.36％）。

2.2 北京基因型鑒定實驗

11株遼寧省流行結(jié)核分枝桿菌北京基因型鑒定實驗結(jié)果見附圖。

2.3 北京家族基因型與耐藥性的相關性

168株結(jié)核分枝桿菌菌株中，隨機選取敏感株49株，其中北京基因型為43株（87.74％），非北京基因型混合感染2株（4.08％），北京基因型和非北京基因型混合感染4株（8.16％）。隨機選取耐藥株119株，有單耐藥株47株，其中北京基因型為41株（87.24％），非北京基因型混合感染3株（6.38％），北京基因型和非北京基因型混合感染3株（6.38％）；多耐藥株29株，其中北京基因型為27株（93.10％），非北京基因型混合感染2株（6.90％）；耐多藥株39株，其中北京基因型為37株（94.86％），非北京基因型混合感染1株（2.57％），北京基因型和非北京基因型混合感染1株（2.57％）；廣泛耐藥株4株，均為北京基因型結(jié)核分枝桿菌。

將敏感菌株與各種耐藥結(jié)核分枝桿菌中北京基因型結(jié)核分枝桿菌所占比例進行χ2檢驗，結(jié)果顯示，敏感與各種耐藥結(jié)核分枝桿菌中北京基因型結(jié)核分枝桿菌所占比例差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.594，P=0.441），敏感與各種耐藥結(jié)核分枝桿菌中北京基因型結(jié)核分枝桿菌所占比例差異無統(tǒng)計學意義。見附表。

附表耐藥性與北京家族基因型的相關性

3 討論

耐藥結(jié)核菌分為單耐藥、多耐藥、耐多藥（multidrug-resistance，MDR）及廣泛耐藥（extensive drugresistance，XDR）4類。單耐藥是僅對1種一線抗結(jié)核藥物耐藥；多耐藥（poly-resistance）指對＞1種一線抗結(jié)核藥物耐藥（不包括同時對異煙肼和利福平耐藥）；耐多藥指至少同時對異煙肼和利福平耐藥；廣泛耐藥指在同時對異煙肼和利福平耐藥基礎上，還對任意一種喹諾酮類藥物和3種二線抗結(jié)核藥物注射劑（卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星）中≥1種耐藥[4]。

我國是北京基因型結(jié)核分枝桿菌的高流行區(qū)域[5]。東北部區(qū)域感染北京基因型菌株患者的比例高于中西部區(qū)域，吉林、河南等省北京基因型菌株患者比例高達90％左右[6-7]。國內(nèi)北京基因型結(jié)核分枝桿菌的高流行多與耐藥相關[8-9]。而國外研究發(fā)現(xiàn)，北京基因型結(jié)核分枝桿菌與耐多藥密切相關，且傳播迅速[10]。此外，北京基因型本身也有許多亞型。有研究表明，不同人群中北京基因型MTB亞型分布不同，與耐藥的關系也不同[11-12]。遼寧省是東北的重要省份，結(jié)核的耐藥率偏高，了解遼寧省北京基因型結(jié)核分枝桿菌的流行情況及其與耐藥的相關性，對探討遼寧省結(jié)核分子流行病學狀況和北京基因型結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核耐藥性中的作用有重要意義。本研究結(jié)果顯示，在遼寧省168株結(jié)核菌中，北京基因型結(jié)核分枝桿菌占90.48％。說明遼寧省以北京基因型結(jié)核分枝桿菌流行為主，與全國流行病學調(diào)查結(jié)果相同[13]。

本研究采用北京基因型結(jié)核分枝桿菌檢測方法，能同時檢測出北京基因型結(jié)核分枝桿菌和非北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染，結(jié)果顯示，168株結(jié)核菌中有8株（4.76％）為北京基因型結(jié)核分枝桿菌和非北京基因型結(jié)核分枝桿菌混合感染，由于樣本量較小，該比例不能代表遼寧省結(jié)核菌混合感染的狀況，但說明遼寧省內(nèi)存在著北京基因型結(jié)核分枝桿菌和非北京基因型結(jié)核分枝桿菌混合感染，這也增加遼寧省結(jié)核防治工作的復雜性和難度。

將119株耐藥結(jié)核菌分成單耐藥、多耐藥、耐多藥和廣泛耐藥。這4種耐藥結(jié)核菌北京基因型所占比例，以及分別與敏感結(jié)核菌北京基因型所占的比例進行比較，差異無統(tǒng)計學意義，表明遼寧省北京基因型結(jié)核分枝桿菌與耐藥性無關。

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（童穎丹 編輯）

Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in Liaoning province and its relation with genotype

Ning Mao,Lei Sun,Jia-yuan Liang,Li-jun Yang,Cui Wang
(Tuberculosis Prevention and Control Institute,Disease Prevention and Control Center of Liaoning Province,Shenyang,Liaoning 110005,China)

ObjectiveTo discuss drug resistance of Mycobacterium tuberculosisin Liaoning province and its correlation with Beijing genotype,so as to provide a scientific basis for the prevention and treatment of drug-resistant TB in Liaoningprovince.MethodsThe drug resistance was determinated with the proportional method.A total of 119 strains were chosen from the drug-resistant Mycobacterium tuberculosis and 49 strains from the sensitive Mycobacterium tuberculosisas control.Genotyping was performed by PCR.ResultsAmong the 49 sensitive strains,43 were Beijing genotype.Among the 119 drug-resistance strains,there were 47 monoresistance strains,29 poly-resistance strains,39 multidrug-resistance strains and 4 extensive drug-resistance strains.There was no significant difference in the proportion of the Beijing genotype between the sensitive and drug-resistant Mycobacterium tuberculosis(P＞0.05).ConclusionsBeijing genotype family of Mycobacterium tuberculosisis the major epidemic strain in Liaoning province.There is no significant correlation between Beijing genotype and drug resistance.

Mycobacterium tuberculosis;Beijing genotype;drug resistance;genotyping

R52

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.008

1005-8982（2017）01-0042-04

2016-05-25

王毳，E-mail：wangcuilncdc@163.com