劉 光，胡松青，張婷婷，王敬敬，李 琳，侯 軼*

小麥蛋白質二硫鍵異構酶基因的克隆、表達及重組酶性質

劉 光1,2，胡松青1,2，張婷婷1,2，王敬敬1,2，李 琳1,2，侯 軼1,*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，廣東 廣州 510640）

目的：克隆小麥蛋白質二硫鍵異構酶（wheat protein disulfide isomerase，wPDI）基因，實現其在大腸桿菌中的表達并探究其酶學性質。方法：以小麥種子總RNA為模板，逆轉錄并擴增得到wpdi，并以pET-30b為表達載體、大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌進行原核表達，表達產物經金屬螯合層析純化后進行了酶學性質研究。結果：克隆的基因全長1 548 bp，與“Wyuna”品種小麥wpdi基因相似性達99%。構建了pET-30b-wpdi表達載體，獲得wPDI的最佳表達條件為：誘導溫度22 ℃，誘導時間6 h，誘導劑濃度0.5 mmol/L。該酶含4 個硫氧還蛋白結構域，分子質量約為66.2 kD，具有二硫鍵的還原酶和異構酶活性以及分子伴侶活性。結論：對重組wPDI的表達和酶學性質研究，為wPDI在面制品加工及其他方面的應用提供參考依據。

小麥蛋白質二硫鍵異構酶；克??；表達；酶學性質

蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）是一種位于真核生物細胞內質網中的巰基/二硫鍵氧化還原酶，對催化內質網中新生肽鏈氧化折疊、維持蛋白以及細胞功能具有重要作用[1]。PDI主要由4 個硫氧還蛋白結構域組成，以a、b、b′和a′的順序排列。其中，a和a′含有獨立的催化巰基/二硫鍵交換的活性位點，不同物種間活性位點高度保守，皆為CXXC基序[2]。PDI具有酶學活性和分子伴侶活性。酶學活性包括二硫鍵的氧化、還原和異構酶活性；PDI的分子伴侶活性指PDI能幫助新生肽鏈正確折疊并抑制因錯誤折疊引起的蛋白凝沉作用[2-3]。

自從Anfinsen發(fā)現PDI以來，動物和真菌來源PDI的功能和結構得到了較為深入的研究，如人和酵母PDI的立體結構已被解析，相關生理機制已被闡明[4-5]。相比之下，植物來源PDI的研究較局限，主要聚焦于基因序列的克隆、轉錄調控以及細胞定位等方面[6-8]，對功能、性質以及結構的研究較缺乏。

小麥PDI（wheat PDI，wPDI）參與了面筋蛋白中二硫鍵的生物合成，因此，其被認為是一種潛在的面粉改良劑[9]。Watanabe等[10]的研究指出牛來源PDI在面粉改良中的作用類似于溴酸鉀。Every等[11]的研究發(fā)現，小麥PDI在抗壞血酸協同下能夠提高面包質量。因此，鑒于wPDI潛在的面制品工業(yè)應用價值，臧聞等[12]利用大腸桿菌BL21（DE3）表達了重組wPDI，但目的蛋白表達量低且作者未對重組蛋白做進一步研究。

本研究將從小麥幼苗中克隆的wpdi基因連到表達載體pET-30b上，在大腸桿菌BL21（DE3）中實現了重組蛋白的大量可溶表達。酶活性研究發(fā)現，wPDI具有酶學活性和分子伴侶活性。這些結果為wPDI在面制品加工及其他方面的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 宿主菌株與質粒

“中優(yōu)9507”小麥種子，由中國農業(yè)科學院提供；克隆菌株E.coli DH5α、表達菌株E.coli BL21（DE3）、pMD19-T和pET-30b載體 寶生物工程有限公司。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨和酵母提取粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；高保真DNA聚合酶和超螺旋DNA定量Marker寶生物工程有限公司；限制性內切酶XhoⅠ、BamHⅠ和T4連接酶 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；反轉錄酶M-MLV 普洛麥格（北京）生物技術有限公司；通用型RNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒 廣州東盛生物有限公司；DNA小提試劑盒 天根生物科技有限公司；胞苷2’,3’-環(huán)-磷酸單鈉鹽（cytidine 2’,3’-cyclic monophosphate，2’,3’-cCMP） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。β-巰基乙醇、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）等（均為分析純） 健陽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

EDC-80聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Nanovue Plus超微量紫外分光光度計 美國通用電氣公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥總RNA提取

“中優(yōu)9507”小麥種子于30 ℃和相對濕度85%條件下避光培養(yǎng)8～9 d后，取10 cm葉片剪成小段，置于液氮中研磨成粉末，并按照通用型RNA提取試劑盒操作方法，提取小麥黃化苗葉片總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計測定總RNA的濃度與純度后，用于反轉錄擴增基因產物。

1.3.2 wpdi基因克隆

以提取得到的總RNA為模板，在反轉錄酶M-MLV作用下先進行反轉錄，反應條件為：42 ℃反轉錄60 min后，于70 ℃溫育5 min終止反應。反轉錄產物cDNA隨后進行PCR擴增，獲得wpdi基因。PCR擴增引物是根據NCBI上提供的wpdi基因序列為模板，利用Primer Premier 3.0 設計而出，上、下游引物分別為：F1：5’-ATGGCGATCTGCAAGGTCTGG-3’和R1：5’-TCAGAGCTCGTCCTTCAGAGGC-3’。反應條件如下：94 ℃預變性5 min后，按以下的參數進行35 次循環(huán)：98 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸120 s。最后72 ℃延伸5 min擴增結束后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，并用DNA凝膠回收試劑盒回收wpdi基因。純化后的wpdi基因優(yōu)先連接到pMD19-T載體上保存。隨后，從pMD19-T載體上，按照上述相同條件擴增出不含信號肽序列的wpdi基因，擴增引物分別為：F2：5’-CGGATCCAGAGGAAGCCGCAGCCG-3’和R2：5’-CCTCGAGGAGCTCGTCCTTCAGAG-3’。其中，下劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。擴增后的產物，經電泳檢測、回收純化后于－20 ℃保存。

1.3.3 wPDI表達載體構建與鑒定

對wpdi基因回收產物和表達載體pET-30b質粒進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切處理，回收純化后得到wpdi基因和表達載體pET-30b的雙黏性末端DNA片段，加入T4 DNA連接酶，22 ℃連接30 min后，將連接產物轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，并涂布至含有硫酸卡那霉素（kanamycin，Kan）的LB平板培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)過夜。菌落長成后，隨機挑選單克隆菌落進行菌落PCR和重組質粒雙酶切鑒定。將經雙酶切和電泳驗證結果為陽性的重組質粒pET-30b-wpdi送樣測序。測序結果與GenBank上wpdi基因mRNA進行序列比對，確認重組質粒序列信息。

1.3.4 wPDI的誘導表達和可溶性分析

將測試無誤的pET-30b-wpdi重組質粒轉化至BL21（DE3）和C43（DE3）中，涂布在含Kan的LB平板培養(yǎng)基上。培養(yǎng)過夜后，挑取形態(tài)飽滿的單克隆接種到含有Kan的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的菌液以1∶100（V/V）的比例轉接到新的LB培養(yǎng)基中，相同條件下再培養(yǎng)2～3 h，至菌液OD600nm為0.5～0.6后，吸取200 μL菌液，作為0 h非誘導對照樣品，向剩余菌液加入IPTG誘導劑至終濃度為0.3 mmol/L，繼續(xù)誘導培養(yǎng)3 h后吸取200 μL菌液。剩下菌液離心收集菌體細胞，加入0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）重懸樣品，在冰浴中超聲波破碎，超聲條件：功率200 W，占空比0.4∶0.6，超聲時間15 min。菌液破碎后于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析重組蛋白的表達和可溶性形式。

1.3.5 Western-blot分析

將wpdi基因的誘導表達產物經SDS-PAGE分析后，轉移至硝酸纖維素膜上，進行Western-blot分析[13-14]。一抗為鼠抗His單克隆抗體，工作濃度為1∶5 000（V/V）。二抗為羊抗鼠IgG單克隆抗體，工作濃度為1∶10 000（V/V），最后使用二氨基聯苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）顯色。

1.3.6 wPDI的表達條件優(yōu)化

含重組質粒pET-30b-wpdi的工程菌BL21（DE3）接種于含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，優(yōu)化誘導表達時間（4、5、6、7 h）、表達溫度（37、22 ℃）以及IPTG濃度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L）對重組蛋白表達水平的影響。收集200 μL菌液，離心去上清液，對沉淀進行SDS-PAGE分析，確定最適表達條件。

1.3.7 重組wPDI分離純化

大量發(fā)酵后獲得的菌體按照每g菌體加入5 mL平衡緩沖液（20 mmol/L Tris，20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，pH 8.0）重懸，按1.2.4節(jié)所述條件超聲破碎菌體至澄清透明。4 ℃、8 000 r/min離心15 min，獲得的上清液過0.45 μm的微濾膜，進一步去除微小顆粒，防止堵塞色譜柱。

過濾后的上清液載入到預平衡的Ni-NTA親和柱中，先用平衡緩沖液洗去未與柱子結合的蛋白，然后再用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris，500 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，pH 8.0）按照梯度洗脫方式洗脫柱子，流速為2 mL/min，收集洗脫峰流出液，分別取10 μL洗脫液作SDS-PAGE分析，并用微量紫外分光光度計測定蛋白濃度（εwPDI＝0.729 mL/（mg·cm））[15]。

1.3.8 重組wPDI活性測定

二硫鍵還原酶活性：wPDI能將以二硫鍵交聯的胰島素還原成A、B單鏈，B鏈隨后發(fā)生聚集沉淀，通過測定特定波長吸光度變化可以反映wPDI的還原酶活性[16]。反應體系為：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，2 mmol/L EDTA，30 μmol/L胰島素，不同質量濃度（25、50、75、100 μg/mL和125 μg/mL）wPDI，加入3.3 mmol/L二硫蘇糖醇啟動反應，測定波長630 nm處吸光度變化。以添加相同濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為陽性對照，無任何蛋白添加為陰性對照。

二硫鍵異構酶活性：wPDI能夠糾正蛋白質因錯誤折疊導致的二硫鍵錯配，恢復其天然配對方式。以錯誤二硫鍵折疊的變性RNA酶（scrambled RNase，sRNase）為底物，探究wPDI的異構活性。sRNase的制備參照Walker等[17]的方法。反應體系如下：0.1 mol/L Tris，1.2 mmol/L還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），8.4 μmol/L sRNase，1.4 μmol/L wPDI，4.5 μmol/L 2’,3’-cCMP。測定296 nm波長處吸光度變化。

分子伴侶活性：wPDI的分子伴侶活性表現為抑制變性蛋白的凝沉，并恢復其天然構象的性質[18]。以鹽酸胍變性的三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）為底物，稀釋作用下，探究不同濃度wPDI（10、20、30 μmol/L和40 μmol/L）對其聚集抑制率的影響。鹽酸胍變性的GAPDH的制備參照Cai等[19]的方法。反應體系如下：2.5 mmol/L EDTA，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），wPDI（10、20、30 μmol/L和40 μmol/L），最后加入2.8 μmol/L變性的GAPDH，于488 nm波長處測定吸光度變化。以添加相同濃度的BSA為陽性對照，無任何蛋白質添加為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取和wpdi基因的擴增

用植物RNA提取試劑盒提取“中優(yōu)9507”小麥黃化苗葉片總RNA，由圖1A可見，小麥總RNA在圖中顯示3個條帶，從上到下分別為28S、18S和5S條帶，其中28S的RNA條帶粗于18S的RNA。5S的RNA條帶輕微彌散，說明總RNA存在少量降解。紫外分光光度計測得總RNA的質量濃度約為525.6 ng/μL，A260nm/A280nm為2.04。該結果表明，總RNA的完整性良好，符合反轉錄實驗要求。

以提取的總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA，并進一步以此為模板，PCR擴增得到wpdi基因產物。經瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 500 bp左右的位置出現一條明亮的條帶，與wpdi基因全長1 548 bp基本一致（圖1B）。

圖1 小麥黃化苗葉片總RNA提?。ˋ）和反轉錄PCR產物（B）Fig. 1 Electrophoresis of total RNA extracted from etiolated wheat leaves (A) and reverse transcription-PCR amplified product (B)

2.2 wpdi基因的克隆載體構建

圖2 菌落PCR分析Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplified products of monoclonal colonies

wpdi基因的PCR產物經純化后連接至克隆載體pMD19-T上，并轉化至E.coli DH5α中。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定。如圖2所示，陽性菌落擴增條帶較亮，且位置正確，在1 500 bp左右，與預計大小基本相同；陰性菌落擴增的條帶則較暗。將3、4和5條帶對應的單克隆送華大基因公司測序。測序結果顯示，3號和4號基因序列不全，存在堿基缺失。5號的基因序列完整，且與NCBI上品種為“Wyuna”（序列號：AF262979.1）的小麥PDI序列相似性最高，達99%，僅一個堿基不同，且這個堿基位于信號肽部位。說明品種“中優(yōu)9507”的小麥與品種為“Wyuna”的小麥編碼PDI的基因無差別。

2.3 wpdi基因的生物信息學分析

利用DNAstar軟件分析，wpdi基因編碼蛋白質全長515 個氨基酸，理論蛋白分子質量為56.7 kD，理論等電點為4.9。NCBI顯示wPDI的4 個結構域分布如下：第42～145位氨基酸為a結構域，第153～246位氨基酸為b結構域，第263～363位氨基酸為b’結構域，第383～484位氨基酸為a’結構域。

wPDI氨基酸序列和已公開報道物種（包括大麥、檸檬、甘薯、酵母和人）的PDI氨基酸序列進行比對，結果如圖3所示。4 種植物來源的PDI高度同源，小麥與大麥、檸檬和甘薯的相似性分別達96.7%、60.9%和58.6%。而wPDI與人和酵母來源的PDI相比，相似性較低，只有30%左右。通過NetNGlyc 1.0 Server在線軟件（http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測N-糖基化位點發(fā)現，4 種植物PDI上只有一個N-糖基化位點，且位置相同（綠色陰影標示），酵母PDI有5 處（橙色陰影標示），人PDI有2 處（紫色陰影標示）。對不同來源wPDI保守區(qū)預測發(fā)現，催化活性位點和內質網駐留信號肽仍是高度保守的。6 個物種的活性位點都含CGHC序列，而人PDI a′結構域活性位點（CTHC）除外（紅色框標示）。4 種植物PDI的內質網駐留信號肽都為KDEL，酵母PDI為HDEL，人PDI的為KEEL（淺藍色陰影標示）。

圖3 PDI氨基酸序列比對Fig. 3 Alignment of the deduced amino acid sequences of PDI from different species

2.4 wpdi基因的表達載體構建

圖4 菌落PCR（A）和雙酶切鑒定（B）Fig. 4 PCR Analysis of positive monoclonal colonies (A) and identification of recombinant plasmid (B) by double restriction enzyme digestion

從pMD19-T-wpdi上亞克隆不含信號肽序列的wpdi基因，連接至pET-30b表達載體上。所選酶切位點分別為BamHⅠ和XhoⅠ。轉化至大腸桿菌DH5α中，菌落長成后進行菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定。由圖4A可見，挑取的單克隆皆為陽性，雖然有拖帶和非特異性擴增，但目的基因位置明確。雙酶切結果表明，外源基因已正確插入到pET-30b載體內，成功構建重組表達載體pET-30b-wpdi（圖4B）。

2.5 wPDI的重組表達和Western-blot分析

圖5 wPDI表達檢測（A）、可溶性（B）和Western-blot分析（C）Fig. 5 SDS-PAGE (A), soluble expression (B) and Western-blot (C) analysis of recombinant wPDI protein

將構建好的重組表達質粒pET-30b-wpdi分別轉入到大腸桿菌BL21（DE3）和C43（DE3）中，進行小量誘導表達，結果如圖5A所示。wPDI在兩種表達菌中都有表達，表達產物在凝膠上的分子質量約為66.2 kD，比理論值60.5 kD（含表達標簽）偏高。有研究報道，重組蛋白所帶的His融合標簽可能是引起這種偏差的原因[20]。wPDI的C-和N-端都帶有His融合標簽，該標簽中的堿性氨基酸能夠造成重組蛋白在SDS-PAGE中遷移變慢，從而引起測定分子質量比理論分子質量偏大。相比于大腸桿菌C43（DE3），BL21（DE3）表達菌株表達目的蛋白水平更高，且呈可溶表達（圖5B），因此后續(xù)實驗選擇BL21（DE3）為表達宿主菌。

為驗證誘導表達的蛋白為帶His標簽的目的蛋白，采用Western-blot實驗進行分析。由圖5B所示，Western-blot采用DAB顯影，背景顏色深，顯色雖不明顯但仍能看到相關的特異性條帶，表明BL21（DE3）和C43（DE3）這兩種宿主菌所表達的蛋白確為帶His標簽的目的蛋白，能夠用于鎳離子螯合層析進行分離純化。

2.6 wPDI的表達條件優(yōu)化

圖6 wPDI的表達條件優(yōu)化Fig. 6 Optimization of expression conditions for wPDI

2.6.1 誘導劑濃度

在確定了最佳表達宿主菌為BL21（DE3）后，優(yōu)先考察誘導劑IPTG濃度對重組wPDI表達量的影響。在相同誘導溫度（37 ℃）和時間（6 h）條件下，0.5 mmol/L的IPTG濃度能夠誘導表達最大量的wPDI，提高IPTG濃度對表達量影響不明顯（圖6A），但是過高的IPTG濃度容易殺死大腸桿菌細胞以及導致包涵體的產生[21]。因此，選擇0.5 mmol/L IPTG為最適誘導劑濃度。

2.6.2 誘導溫度

在IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導時間6 h條件下，考察誘導溫度（37、22 ℃）對wPDI表達量的影響。結果如圖6B所示，在相同誘導條件下，選擇的兩個誘導溫度對目的蛋白wPDI的表達量無顯著差別，但是在后續(xù)的純化實驗中發(fā)現，低溫22 ℃誘導產生的目的蛋白，對親和層析柱的結合能力較強，易于分離出較高純度的目的蛋白，因此選擇溫度22 ℃進行誘導。究其原因可能是低溫誘導下降低了大腸桿菌生長速率和重組蛋白的合成速率，有利于重組蛋白的正確折疊，減少因蛋白錯誤折疊引起的His標簽包埋，從而提高了分離純化效率[22]。因此，本實驗選擇溫度22 ℃進行重組蛋白的誘導。

2.6.3 誘導時間

在IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導溫度37 ℃或22 ℃條件下，考察誘導時間對重組wPDI表達量的影響。如圖6C、D所示，兩個溫度條件下，目的蛋白的表達量在誘導時間6 h時最高，在7 h時有所下降，可能是由于過高的IPTG濃度對大腸桿菌產生了一定的毒性，抑制了大腸桿菌的生長。因此，確定IPTG最適誘導時間為6 h。

2.7 wPDI的親和純化

圖7 wPDI親和純化電泳分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of wPDI after affini ty chromatography

重組蛋白wPDI的C-和N-端都帶有His標簽，容易與Ni2+螯合，利用金屬螯合層析可以較方便地分離純化蛋白。如圖7所示，在所選的層析條件下，依靠鎳離子與重組蛋白His標簽的特異性螯合作用，一步純化即得到電泳純目的蛋白。在咪唑濃度為150 mmol/L的洗脫液洗脫下，雖有少量目的蛋白開始流出，但是該洗脫峰中雜蛋白含量高；在咪唑濃度為200 mmol/L的洗脫液洗脫下，大部分目的蛋白流出，且雜蛋白含量較少，達到了電泳純，可用于wPDI酶學性質的研究。

2.8 wPDI的酶學性質研究

2.8.1 wPDI的二硫鍵還原酶活性

圖8 不同重組wPDI添加量對胰島素還原的影響Fig. 8 Effect of different amounts of recombinant wPDI on reduction of insulin

wPDI能夠還原胰島素A-B兩條鏈間的二硫鍵，引起B(yǎng)鏈的聚集。如圖8所示，以30 μmol/L胰島素為底物，考察了不同質量濃度wPDI對胰島素還原的最佳比例。結果顯示，隨著重組wPDI添加量的增大，吸光度顯著增加，表明胰島 素被還原的量增大。當wPDI添加量達到100 μg/mL時，吸光度不再增加，表明酶反應趨于平衡。因此，在實驗所選條件下，wPDI還原胰島素的質量比為1∶1.73。

2.8.2 wPDI的異構酶活性

圖9 重組wPDI異構酶活性測定Fig.9 Isomerase assay of recombinant wPDI

在真核細胞內質網腔中，wPDI參與了新生肽鏈的折疊以及二硫鍵的形成。因錯誤折疊誤配的二硫鍵能夠通過wPDI的二硫鍵異構酶活性恢復成天然二硫鍵配對形式。體外考察wPDI的異構酶活性所用底物為sRNase。如圖9所示，相比于未變性的RNase，wPDI能夠使部分sRNase復性，從而具有催化底物2′,3′-cCMP水解的能力。25 min時，等量未變性RNase組在296 nm波長處的吸光度變化值為0.21，重組wPDI催化sRNase復性后，吸光度變化值為0.13。因此，wPDI能使sRNase恢復約60%的活性，表明重組wPDI具有良好的異構酶活性。

2.8.3 wPDI的分子伴侶活性

圖10 重組wPDI的分子伴侶活性Fig. 10 Chaperone activity of recombinant wPDI

分子伴侶是細胞中一大類蛋白質，它們氨基酸序列沒有相關性但具有相同功能，能夠介導其他蛋白質的正確裝配，但自身不會成為功能結構中的組分[23]。熱休克蛋白是最常見的一大類分子伴侶蛋白。PDI的分子伴侶假說最早由王志珍[24]通過復性不含二硫鍵的GAPDH和硫氰酸酶提出的，現已被廣泛接受。PDI的伴侶活性指PDI能幫助新生肽鏈正確折疊并抑制因錯誤折疊引起的蛋白凝沉作用[2-3]。測定PDI伴侶活性的常用底物為鹽酸胍變性的GAPDH，稀釋后的變性GAPDH易發(fā)生沉淀，通過測定GAPDH的聚集程度來衡量其伴侶活性的大小[25]。圖10顯示了不同濃度的重組wPDI對變性GAPDH聚集的抑制率影響。結果表明，隨著wPDI濃度的增加，對變性GAPDH聚集的抑制率顯著提高，30 μmol/L的wPDI對聚集的抑制率最高，達到35%左右。Cai等[19]研究發(fā)現，在一定范圍內，wPDI對變性GAPDH的聚集抑制率越高，其酶學活性恢復的比例越大。因此說明，本研究獲得的重組wPDI也具有分子伴侶活性。

3 結 論

從品種為“中優(yōu)9507”小麥葉片中克隆了蛋白質二硫鍵異構酶wpdi基因，全長1 548 bp，與“Wyuna”小麥編碼PDI的基因相似性達99%；多重序列分析發(fā)現，wPDI與植物來源PDI親緣關系近，與人或酵母來源PDI關系遠。但不同物種PDI的催化活性位點和內質網駐留信號序列仍高度保守；構建了pET-30b-wpdi表達載體，并在最佳表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）得到了大量可溶表達，最適表達條件為：誘導溫度22 ℃、誘導時間6 h，誘導劑濃度0.5 mmol/L。Western-blot結果證實了表達產物帶有重組His標簽。經鎳離子螯合層析，一步純化得到電泳純重組wPDI；酶學性質表明，重組wPDI具有二硫鍵的還原酶和異構酶活性以及分子伴侶活性。該研究結果為wPDI在面制品加工以及其他方面的應用提供參考依據。

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Gene Cloning, Expression and Characterization of Protein Disulfide Isomerase from Wheat (Triticum aestivum L.)

LIU Guang1,2, HU Songqing1,2, ZHANG Tingting1,2, WANG Jingjing1,2, LI Lin1,2, HOU Yi1,*
(1. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, Guangzhou 510640, China)

Purpose: The gene encoding wheat protein disulf de isomerase (wPDI) was cloned and expressed in Escherichia coli, and its enzymatic properties were investigated. Methods: The wpdi gene was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction amplif cation using the total RNA from wheat seeds as template. The recombinant plasmid pET-30b-wpdi was constructed and transformed into E. coli BL21 (DE3). After metal chelating chromatography, the enzymatic properties of the purif ed wPDI were determined. Results: A 1 548 bp gene fragment was amplif ed and sequenced as wpdi gene that had 99% identity with that of the wheat cultivar Wyuna. The optimized conditions for wPDI expression were determined as follows: induction at 22 ℃ using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside at a concentration of 0.5 mmol/L for 6 h. The recombinant wPDI consisted of four thioredoxin-like domains and had a molecular weight of 66.2 kD. The enzyme exhibited enzymatic activities (including reductase activity and isomerase activity of disulf de bonds) and chaperone activity. Conclusions: The expression of wPDI and its enzymatic properties can provide the foundation for its application in the f our processing industry.

wheat protein disulf de isomerase; cloning; expression; enzymatic activities

10.7506/spkx1002-6630-201702002

Q816

A

1002-6630（2017）02-0007-08

劉光, 胡松青, 張婷婷, 等. 小麥蛋白質二硫鍵異構酶基因的克隆、表達及重組酶性質[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 7-14. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702002. http://www.spkx.net.cn

LIU Guang, HU Songqing, ZHANG Tingting, et al. Gene cloning, expression and characterization of protein disulfide isomerase from wheat (Triticum aestivum L.)[J]. Food Science, 2017, 38(2): 7-14. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702002. http://www.spkx.net.cn

2016-03-04

國家自然科學基金面上項目（31471691；31130042）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20130172110018）；廣東省科技計劃項目（2014A010107002）；佛山市科技計劃項目（2015AG10011）

劉光（1988—），男，博士研究生，研究方向為谷物化學與蛋白質工程。E-mail：liuguang033@126.com

*通信作者：侯軼（1973—），女，高級工程師，博士，研究方向為工業(yè)廢水的生物處理。E-mail：ceyhou@scut.edu.cn