張佩佩，李苗云*，趙改名，崔文明，高曉平，柳艷霞，趙莉君，王亞飛

熏煮火腿中志賀氏菌的熱失活特性

張佩佩，李苗云*，趙改名，崔文明，高曉平，柳艷霞，趙莉君，王亞飛

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002）

為了研究志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中熱失活規(guī)律，以55、63 ℃對接種108CFU/g志賀氏菌的熏煮火腿進行熱處理，測定處理后樣品中志賀氏菌的殘存菌體濃度。應(yīng)用Logistic模型和3rd degree polynomial模型擬合在兩種溫度下志賀氏菌的動力學(xué)模型，用D值（decimal reduction time）表示志賀氏菌在熏煮火腿中的耐熱情況。結(jié)果表明：11 株志賀氏菌的熱失活曲線運用3rd degree polynomial擬合較好，相關(guān)系數(shù)均在0.98以上。志賀氏菌不同菌株的D值不同，55 ℃條件下志賀氏菌在熏煮火腿中的D值為4.46～10.66 min，63 ℃條件下D值為0.48～3.22 min。不同菌株之間抗熱性存在差異，其中菌株S-5的耐熱性最強，S-6最弱。

志賀氏菌；熏煮火腿；熱失活；動力學(xué)模型；D值

志賀氏菌（Shigella）是一種不形成芽孢的革蘭氏陰性、兼性厭氧桿菌，是腸桿菌科感染的病原菌之一[1]。它能夠通過侵襲大腸引起患者典型菌痢癥狀，如發(fā)熱、腹痛、腹瀉等[2]。據(jù)統(tǒng)計，2005年全球的人類痢疾病例有8 000萬例，導(dǎo)致約70萬人死亡[3]。志賀氏菌屬在我國感染性腹瀉病原菌中居首位，志賀氏菌主要由食用未烹調(diào)的食物引起，如含碳水化合物和蛋白的沙拉[4]。熏煮火腿是以生鮮豬肉或者雞肉為原料，常壓下經(jīng)蒸煮和熏烤的火腿類熟肉制品。它屬于低溫肉制品的范疇，以營養(yǎng)豐富、易消化吸收、食用方便、風(fēng)味獨特以及便于攜帶和保存而深受廣大消費者的青睞[5]。食品殺菌的方法很多，包括物理、化學(xué)和生物法等。熱處理是商業(yè)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)滅活方式，它是食品工業(yè)最經(jīng)濟有效、最簡便和使用最廣泛的殺菌方法[6]。在微生物殺菌研究中，預(yù)測微生物學(xué)結(jié)合化學(xué)、微生物學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、數(shù)學(xué)以及計算機技術(shù)研究和建立不同環(huán)境因素影響下的失活參數(shù)模型，能夠快速評估微生物殘存情況,避免了傳統(tǒng)方法的繁瑣和滯后性，已獲得了廣泛的應(yīng)用[7-8]。

細(xì)菌菌株之間存在耐熱性差異，其熱失活曲線并不嚴(yán)謹(jǐn)遵循對數(shù)線性關(guān)系，在擬合細(xì)菌熱失活規(guī)律時，經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)菌對數(shù)圖凸形、凹形以及S形曲線等一系列非線性的現(xiàn)象[9-12]。多項式擬合模型已經(jīng)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、衛(wèi)生學(xué)等諸多領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用[13]，董慶利等[14]將此模型應(yīng)用于失活模型，發(fā)現(xiàn)可以很好地擬合氣單胞菌的失活曲線。目前，有關(guān)單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等食源性致病菌的熱失活的研究已有報道[15-17]，而有關(guān)志賀氏菌熱失活方面的研究鮮見報道，為了達(dá)到消毒且不損害食品品質(zhì)的目的，工業(yè)上常用的滅菌方法是巴氏殺菌（溫度一般在60～82 ℃），但是巴氏殺菌熱處理程度比較低，殺菌后容易造成微生物的殘存。本實驗研究了2 種溫度熱處理對熏煮火腿中志賀氏菌不同菌株的影響，用3rd degree polynomial擬合熏煮火腿中志賀氏菌不同菌株的非線性失活曲線，建立了熏煮火腿中志賀氏菌不同菌株的熱失活模型，用D值（decimal reduction time）比較了志賀氏菌在熏煮火腿中的耐熱性情況，為熏煮火腿中志賀氏菌的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熏煮火腿 河南漯河雙匯集團。

11 株志賀氏菌，均為河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室從肉中分離并經(jīng)過國標(biāo)法生化鑒定、Vitek測定以及分子鑒定，－80 ℃甘油管保存。

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（xylose lysine deoxycholate salt agar，XLD） 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（分析純） 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

一次性無菌培養(yǎng)皿 江蘇省泰州市利康醫(yī)療器械有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；拍打式均質(zhì)器 法國AES Chemunex公司；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣計數(shù)有限公司；真空包裝機溫州市大江真空包裝機械有限公司；JA2003N電子天平上海菁海儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-501數(shù)顯超級恒溫水浴 金壇市杰瑞爾電器有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

取同一生產(chǎn)日期的熏煮火腿，紫外線照射30 min后去除外皮，無菌條件下將其絞碎，以每份（25±0.5） g進行真空封裝。－25 ℃條件下保存，使用前置于4 ℃條件下解凍。

1.3.2 菌懸液的制備

無菌操作條件下，將儲存于－80 ℃條件下的志賀氏菌接種到NA平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落至無菌的NB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期（菌體濃度約109CFU/mL）。得到的穩(wěn)定期菌液稀釋至108CFU/mL備用。

1.3.3 人工污染介質(zhì)熏煮火腿

[18]的方法，無菌操作取2.5 mL 1.3.2節(jié)制備的菌懸液，置于1.3.1節(jié)無菌真空袋樣品中并壓成均勻片狀，用真空包裝機0.1 MPa抽真空，并封口并使其袋子厚度小于1 mm，以確保傳熱的統(tǒng)一。放在（37±1） ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后備用。每一組溫度時間的組合重復(fù)3 次。

1.3.4 熱處理

表1 熱處理溫度、時間及時間間隔Table1 Temperature, time and time intervals of heat treatments

接種后的樣品放置在預(yù)熱的恒溫循環(huán)水浴鍋中進行熱處理，水浴鍋的設(shè)定溫度分別為55、63 ℃，加熱時間0.5～80 min（表1）。加熱時將樣品完全浸沒熱水中，按照預(yù)先設(shè)定的時間間隔，定時取出樣品進行測定。熱處理后的樣品應(yīng)立即放入預(yù)先準(zhǔn)備好的冰水中，以阻止其繼續(xù)進行熱失活過程。從設(shè)定溫度冷卻至室溫的時間小于10 s。

1.3.5 志賀氏菌計數(shù)

將熱處理后的樣品在潔凈無菌的環(huán)境條件下，加入225 mL 0.85%無菌NaCl溶液，在均質(zhì)器中拍打2 min，使之與樣品混合均勻，獲得1∶10（m/V）的懸浮液。拍打后進行梯度稀釋，將樣品原液或梯度稀釋液涂布在剛配置的XLD培養(yǎng)基上。然后，放至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后計數(shù)志賀氏菌菌落數(shù)目，計算菌體濃度。

1.3.6 熱失活模型建立及模型驗證

熱失活模型利用CurveExpert軟件建立Logistic模型（式（1））和3rd degree polynomial模型（式（2））擬合，選擇最合適的模型得出志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中熱失活曲線，并得到相應(yīng)的模型參數(shù)。

式中：y為志賀氏菌的殘存菌體濃度（lg（CFU/g））；x為熱處理時間/min；A1、A2、x0、p、a、b、c、d為模型參數(shù)。

應(yīng)用建立的志賀氏菌的熱失活動力學(xué)模型求得72 ℃條件下的預(yù)測值，與在72 ℃條件下熱失活實驗中試劑檢測的志賀氏菌數(shù)量進行比較，采用準(zhǔn)確度（Af）和偏差度（Bf）來評價所建模型的可靠性[19]，分別按式（3）和（4）計算。

式中：N實測為試驗實際測得的志賀氏菌菌體濃度（lg（CFU/g））；N預(yù)測為應(yīng)用熱失活模型預(yù)測得到的同一時間點的志賀氏菌菌體濃度（lg（CFU/g））；n為實驗次數(shù)。

1.3.7 D值的計算

D值是指在某一溫度下，活菌數(shù)死亡90%所需要的時間，即細(xì)菌殘存曲線經(jīng)一個對數(shù)周期所需的時間。D值是細(xì)菌死亡率的倒數(shù)，D值越大死亡速率越小，該菌的耐熱性越強。用Linear模型擬合熱致死曲線式中，t為熱處理時間，x表示加熱時間，y表示細(xì)菌活細(xì)胞的對數(shù)值，可得出該函數(shù)的斜率（k）的負(fù)倒數(shù)為所求的D值，即D＝－1/k。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均為3 個平行樣品分別測定3 次的平均數(shù)，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 志賀氏菌在熏煮火腿中的熱失活效果

圖1 志賀氏菌不同菌株熏煮火腿中的熱失活曲線Fig. 1 Survival curves of different Shigella strains in smoked cooked ham

為了研究志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活情況，本實驗選擇了55 ℃和63 ℃ 2 個溫度熱處理熏煮火腿。如圖1所示，志賀氏菌不同菌株的熱失活情況有所不同，但是樣品進行熱處理4 min時，志賀氏菌的熱殺菌效果顯著，這與志賀氏菌剛進入熱刺激環(huán)境不適應(yīng)有關(guān)，隨著熱處理時間的延長，殘菌量慢慢減少直至全部死亡。

2.2 志賀氏菌在熏煮火腿中熱失活模型的選擇

表2 志賀氏菌不同菌株的3rd degree polynomial型和Logistic模型在兩種溫度下的相關(guān)系數(shù)Table2 Correlation coefficients of the 3rd degree polynomial model and the logistic model for differentShiggeellllaa strains at two temperatures

志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿的3rd degree polynomial模型在不同溫度條件下的擬合很好，相關(guān)系數(shù)均在0.98以上；Logistic模型擬合也較好，相關(guān)系數(shù)均在0.88以上。由表2可知，志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活情況用3rd degree polynomial模型描述比Logistic模型擬合相關(guān)性更好，因此選用了3rd degree polynomial模型建立熱失活模型。

圖2 多項式擬合志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活規(guī)律Fig. 2 Survival curves of different Shigella strains in the smoked cooked ham at 55 and 63 ℃ as modeled by regression for 3rd degree polynomial fitting models

將22 組實驗數(shù)據(jù)進行3rd degree polynomial模型擬合，擬合的熱失活曲線如圖2所示。通常來說，殘存菌體濃度的對數(shù)值隨著加熱時間的延長而減少。同時，細(xì)菌死亡速率隨著溫度的升高加快，溫度越高，殺死細(xì)菌所需的時間越短。由圖2可知，熱失活曲線并不是直線，而是普遍向下凹，這說明隨著加熱時間的延長，志賀氏菌失活速率也跟著加快。此外從圖2還可看出，早期志賀氏菌菌體濃度變化不明顯，當(dāng)加熱時間超過一定閾值時，志賀氏菌的失活速率才隨時間變化開始加快。這說明志賀氏菌的菌體濃度在剛開始加熱時并沒有馬上減少，這種現(xiàn)象可能與樣品的形狀大小有關(guān)[20]。在初始加熱時間，溫度對于中心位置存在的志賀氏菌并沒有很大影響。而且本實驗的進行過程中已經(jīng)盡量地減少樣品的厚度（＜1 mm），且在較低溫度條件下（55 ℃和63 ℃），樣品檢測時間明顯高于升溫時間。所以本實驗結(jié)果中出現(xiàn)“肩效應(yīng)”可能是由于在明顯觀察到熱致死效應(yīng)前，加熱過程需要克服一些起初的能量障礙，志賀氏菌做出一定的抵抗，而在熱傳遞過程中會引發(fā)一些生化反應(yīng)[11]。

2.3 志賀氏菌熱失活模型的驗證

為了定量評價建立的3rd degree polynomial模型的可靠性，本實驗采用了Ross提出的并且已經(jīng)被許多學(xué)者所接受的準(zhǔn)確度和偏差度[21]。Af是用來衡量預(yù)測值和實測值之間的差異，Bf是用來檢查預(yù)測值上下波動的幅度。在72 ℃條件下隨機選擇2 株志賀氏菌在熏煮火腿中存活的真實值與應(yīng)用預(yù)測模型計算得到的志賀氏菌存活的預(yù)測值來計算準(zhǔn)確度和偏差度，以比較、評價和驗證模型的可靠性（表3）。

表3 72℃條件下熏煮火腿中志賀氏菌失活預(yù)測值的準(zhǔn)確度和偏差度Table3 Accuracy and bias factor of the predicted values of Shiggeellllaa strains in the smoked cooked ham exposed to 72 ℃

由表3可知，本研究中預(yù)測值和實測值之間的Af在1.166～1.172之間，預(yù)測值上下波動的Bf為10%左右。驗證結(jié)果表明，本研究中建立的志賀氏菌的熱失活模型能很好的預(yù)測不同溫度處理對志賀氏菌的影響。

2.4 志賀氏菌在熏煮火腿中耐熱性分析

表4 志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的耐熱性Table4 Heat resistance (expressed as D-values in min) forr Shiggeellllaa strains in the smoked cooked ham at 55 and 63 ℃

細(xì)菌的耐熱性常以D值來表示，由表4可知，在熏煮火腿中，55 ℃條件下D值為4.46～10.66 min，63 ℃條件下D值為0.48～3.22 min。志賀氏菌不同菌株D值不同，其中菌株S-5的D值最大，S-6的最小。說明不同來源的耐熱能力是有所差異的，這和其他學(xué)者報道的結(jié)果是一致的。Osaili等[22]報道的甲型副傷寒沙門氏菌在雞肉制品中的D60℃為0.46 min，Bucher等[23]報道的腸炎沙門氏菌在雞肉制品中的D60℃為0.39 min，而Juneja等[24]報道的湯普森氏沙門氏菌在雞胸肉中的D60℃為5.20 min。不同血清同一菌屬的細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)有所差異，從而導(dǎo)致他們對刺激環(huán)境的適應(yīng)能力不同。S-5在11 株志賀氏菌中耐熱能力較強可能是由于其本身含有耐熱基因rpoS、rpoE、rpoH或者含有耐熱蛋白，當(dāng)菌株S-5受到熱刺激時，導(dǎo)致這些耐熱基因的激活發(fā)揮抵抗作用[25]。此外，細(xì)菌所在的介質(zhì)會影響其耐熱性，實驗中用的熏煮火腿盡量保持同一批，但是因生產(chǎn)等原因不可能保證所含的營養(yǎng)成分完全一致。熏煮火腿中含有的蛋白質(zhì)對細(xì)菌具有緩沖作用，同時也會加速細(xì)菌的自我修復(fù)和生長繁殖[26]。脂肪的導(dǎo)熱性差，水分活度低使脂肪同樣具有緩沖保護作用[27]，高脂肪含量的熏煮火腿導(dǎo)致志賀氏菌更高的耐熱性。

3 結(jié) 論

本實驗應(yīng)用多項式模型擬合了志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活曲線，相關(guān)系數(shù)均在0.989～0.999，并用72 ℃條件下實際的志賀氏菌存活數(shù)對模型進行驗證，得到預(yù)測值和實測值之間的Af在1.166～1.172之間，預(yù)測值上下波動的Bf為10%左右，表明多項式模型能很好的預(yù)測不同溫度處理對志賀氏菌的熱失活動態(tài)。采用D值比較了志賀氏菌在熏煮火腿中的耐熱性情況，結(jié)果表明志賀氏菌不同菌株的耐熱性存在差異，菌株S-5耐熱性最強。本研究結(jié)果為熱處理殺滅熏煮火腿中志賀氏菌提供理論參考，同時為進一步研究志賀氏菌的熱失活機制提供了參考依據(jù)。

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Thermal Inactivation Properties of Shigella in Smoked Cooked Ham

ZHANG Peipei, LI Miaoyun*, ZHAO Gaiming, CUI Wenming, GAO Xiaoping, LIU Yanxia, ZHAO Lijun, WANG Yafei
(Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control, College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

This study aimed to examine the thermal inactivation pattern of Shigella in smoked cooked ham. Shigella (108CFU/g) were inoculated into smoked cooked ham, cultured at constant temperature and constant humidity and then subjected to thermal treatment at 55 or 63 ℃. The number of surviving cells was counted on selective media. A Logistic model and a 3rd degree polynomial model were separately used to fit the thermal inactivation curve by CurveExpert software. Decimal reduction time (D values) represented the heat resistance of Shigella. The results showed that the curves for 11 Shigella strains f tted by the 3rd degree polynomial model were better, with correlation coeff cients (R2) above 0.98. The D values of different Shigella strains were different, ranging from 4.46 to 10.66 min at 55 ℃ and from 0.48 to 3.22 min at 63 ℃ in the inoculated smoked cooked ham. The heat resistance of different Shigella strains were different, and strain S-5 had the strongest heat resistance while S-6 was the weakest.

Shigella; smoked cooked ham; thermal inactivation; kinetic model; decimal reduction time (D value)

10.7506/spkx1002-6630-201702007

TS251.5

A

1002-6630（2017）02-0040-06

張佩佩, 李苗云, 趙改名, 等. 熏煮火腿中志賀氏菌的熱失活特性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 40-45. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702007. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Peipei, LI Miaoyun, ZHAO Gaiming, et al. Thermal inactivation properties of Shigella in smoked cooked ham[J]. Food Science, 2017, 38(2): 40-45. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702007. http://www.spkx.net.cn

2016-03-02

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31401511）

張佩佩（1991—），女，碩士研究生，研究方向為肉品安全與質(zhì)量控制。E-mail：zhangpeipeii@163.com

*通信作者：李苗云（1976—），女，教授，博士，研究方向為肉品安全與質(zhì)量控制。E-mail：limy7476@126.com