劉艷艷，譚晴晴，范陽陽，張全芳，盛清凱，賈 濤，董書光，步 迅*

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，膠類中藥源性DNA分子鑒定實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；3.山東禹城惠民農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東省德州黑驢養(yǎng)殖繁育保種基地，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院地方驢品種資源保護(hù)科研中心，山東禹城 251200；4.山東東阿國膠堂阿膠藥業(yè)有限公司，山東東阿 252201）

烏頭驢和三粉驢微衛(wèi)星遺傳多態(tài)性分析

劉艷艷1，譚晴晴1，范陽陽1，張全芳1，盛清凱2，賈 濤3，董書光4，步 迅1*

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，膠類中藥源性DNA分子鑒定實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；3.山東禹城惠民農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東省德州黑驢養(yǎng)殖繁育保種基地，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院地方驢品種資源保護(hù)科研中心，山東禹城 251200；4.山東東阿國膠堂阿膠藥業(yè)有限公司，山東東阿 252201）

實(shí)驗(yàn)旨在了解德州驢中烏頭驢和三粉驢2個品系的遺傳多態(tài)性。利用13個微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過建立多重多色毛細(xì)管電泳熒光檢測方法，對39頭三粉驢和16頭烏頭驢進(jìn)行遺傳多樣性分析，對等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳雜合度和有效等位基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：13對微衛(wèi)星位點(diǎn)三粉驢PIC指數(shù)平均值為0.47，烏頭驢PIC指數(shù)平均值為0.40，德州驢2個品系PIC總的平均值為0.47。其中烏頭驢品系平均等位基因數(shù)為3.31，平均觀測雜合度為0.27，有效等位基因數(shù)為2.11。三粉驢品系平均等位基因數(shù)為4.46，平均觀測雜合度為0.33，有效等位基因數(shù)為2.61。由此可見,三粉驢比烏頭驢的遺傳多態(tài)性高，但2個驢品系的遺傳雜合度均偏低，遺傳變異程度較小。

微衛(wèi)星；遺傳多樣性；烏頭驢；三粉驢

德州驢是我國優(yōu)秀的地方品種，從表型可分為“三粉驢”和“烏頭驢”2個品系，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)。由于社會的進(jìn)步和運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，驢在我國大部分地方的役用地位明顯降低，主要驢品種面臨著種質(zhì)資源逐步退化，驢種群數(shù)量和質(zhì)量逐漸降低的嚴(yán)峻形勢[1]。

保護(hù)和開發(fā)利用我國驢種資源已成為當(dāng)務(wù)之急。微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)（Microsatellite DNA）具有豐富的多態(tài)性、數(shù)量多且在基因組中分布均勻、易于檢測、呈共顯性遺傳等特點(diǎn)，因此作為對生物性狀進(jìn)行遺傳分析的主要工具已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。在動物遺傳育種領(lǐng)域主要應(yīng)用于鑒定個體親緣關(guān)系或品系間的遺傳結(jié)構(gòu)、構(gòu)建遺傳圖譜等方向[2]。在國外，Aranguren-Méndez 等[3-4]利用15對微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了5個西班牙驢品種的遺傳結(jié)構(gòu)；Jordana 等[5]利用12對馬的微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了加泰羅尼亞驢的遺傳多樣性；Matassino等[7-9]利用16對微衛(wèi)星位點(diǎn)對意大利維特貝塞驢和米亞塔驢進(jìn)行了遺傳多樣性分析。在國內(nèi)，關(guān)于不同地方驢種遺傳多態(tài)性的微衛(wèi)星檢測已有很多相關(guān)報道 。而對于烏頭驢和三粉驢的遺傳多態(tài)性研究還未見報道。本研究采用微衛(wèi)星技術(shù)，通過檢測13對微衛(wèi)星位點(diǎn)，分析了烏頭驢和三粉驢的遺傳多態(tài)性，以此來豐富我國地方驢品種的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫，為我國家驢遺傳資源的保護(hù)利用以及下一步的育種雜交工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 為減少抽血給動物帶來的應(yīng)激反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采集烏頭驢和三粉驢的驢毛（帶有毛囊）作為研究材料。驢的品種、數(shù)量和采集地見表1。所采集的樣本-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 驢毛基因組DNA提取步驟：取風(fēng)干的毛發(fā)5～10根，分別用無水乙醇和滅菌去離子水各洗2遍，每遍浸泡約5 min，并在震蕩器上渦旋充分混勻。自然晾干后，剪成0.3 cm左右的片段，放入1.5 mL的EP管中。加入100 μL的 5% Chelex-100溶液，10 μL的蛋白酶K（20 mg/mL），10 μL的DTT（1 mol/L），震蕩混勻后置56℃水浴消化過夜。100℃沸水浴8 min，劇烈震蕩，使蛋白變性，DNA釋放。4 000 r/m離心3 min，吸取上清至新EP管中。加入等體積的氯仿充分混勻，13 000 r/min離心10 min，吸取上清，加入1/10體積的 3 mol/L乙酸鈉（pH 5.2），2倍體積的無水乙醇，充分混勻，4℃下13 000 r/min離心10 min，棄上清，70%酒精清洗2次，室溫干燥，加入50 μL TE緩沖液，室溫溶解DNA，利用分光光度計(jì)檢測DNA濃度及純度， -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)用驢種、數(shù)量、采集地

1.2.2 微衛(wèi)星引物篩選 根據(jù)前人研究報道[7,10,12]，篩選出13對微衛(wèi)星引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成，微衛(wèi)星引物序列見表2。

1.2.3 熒光多重PCR組合的建立 對多重PCR組合引物設(shè)計(jì)的具體要求：①要求標(biāo)記相同熒光的同組合引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小范圍沒有交叉；②不同組的引物標(biāo)記不同的熒光；③每套引物間的相互作用盡可能低，△ G＜13；④對擬組合的引物使用Multiple primer design with primer 3在線軟件進(jìn)行評估，排除產(chǎn)生顯著的引物間相互作用的組合。經(jīng)過評估和篩選，將13對微衛(wèi)星引物分2套多重PCR組合（表3）。

經(jīng)過引物濃度、退火溫度、酶的用量等參數(shù)的優(yōu)化，最終確定PCR反應(yīng)體系25 μL，第1套多重PCR體系包括：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL，德泰Taq熱啟動酶0.2 μL，DNA模板2.0 μL，微衛(wèi)星引物對濃度均為1.0μmol/L，加樣量分別為HMS6 2.0 μL，VHl20 0.5 μL，HMS7 1.0 μL，HTG6 3.0 μL，COR092 1.5 μL，HT G7 1.0 μL，HMS5 3.0 μL，補(bǔ)水至25 μL。第2套PCR體系包括：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL，德泰Taq熱啟動酶0.2 μL，DNA模板2.0 μL，微衛(wèi)星引物對濃度均為1.0μmol/L，HT G10 2.0 μL，AHT4 1.0 μL，HT G4 1.0 μL，HT G9 1.0 μL，HT G15 0.8 μL，COR071 2.0 μL。兩套引物的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性1 min，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，15個循環(huán)；95℃變性1 min，52℃退火45 s，72℃延伸45 s，20個循環(huán)；最后60℃延伸45 min。

表2 微衛(wèi)星引物序列、熒光修飾及擴(kuò)增片段大小

取1 μL PCR產(chǎn)物和1 μL ROX500內(nèi)標(biāo)同時加入HiDi去離子甲酰胺，95℃變性，立即放置冰上，冰浴5 min，3 700 r/min離心5 min，在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)ABI 3 730Xl DNA 分析儀（APPlied Biosystems，USA）上機(jī)檢測。采用多重多色熒光電泳檢測的方法，即按照擴(kuò)增片段大小和熒光染料的種類可將13對引物分2套多重PCR體系，在96孔板上同時上機(jī)檢測SSR標(biāo)記等位基因。

表3 2套多重PCR體系微衛(wèi)星引物分組

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用 GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和校正，獲得不同樣品13對引物的原始數(shù)據(jù)表。根據(jù)PowerMarker v3.25軟件，對等位基因數(shù)（Na）、等位基因頻率（Allele Frequency）、多態(tài)信息含量（PIC）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Hobs）和有效等位基因數(shù)（Ne）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Pop Gene32軟件進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三粉驢和烏頭驢微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性分析 本實(shí)驗(yàn)所用的13個微衛(wèi)星位點(diǎn)，在三粉驢和烏頭驢樣品中均擴(kuò)增出良好的帶型，峰型特異。其中HT G7、HT G6、COR092、HT G10、AHT4、HT G15和COR071為高度多態(tài)性（PIC ＞0.5），HMS6和HT G9為中度多態(tài)性，而HMS7、HMS5和HT G4為低度多態(tài)性，其中烏頭驢在HT G4位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)性，三粉驢在所研究的位點(diǎn)中均表現(xiàn)出多態(tài)性。微衛(wèi)星位點(diǎn)多重組合毛細(xì)管電泳的代表性圖譜見圖1，微衛(wèi)星引物擴(kuò)增峰型清晰，多態(tài)性豐富。

2.2 13對微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因遺傳變異分析 本實(shí)驗(yàn)中烏頭驢和三粉驢在13對微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測到61個等位基因，其中烏頭驢中檢測到43個，三粉驢中檢測到等位基因58個。另外，烏頭驢中等位基因數(shù)范圍在2～7之間，三粉驢中為2～12之間。烏頭驢中有效等位基因的平均值為2.11，三粉驢為2.61，兩種驢品系中等位基因數(shù)平均值為4.69，有效等位基因數(shù)平均值為2.64（表4）。

2.3 烏頭驢和三粉驢的遺傳多樣性分析 通過對13對微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC、Na及雜合度值大小進(jìn)行比較看出，HT G7 位點(diǎn)的值最大，依次為0.78、5.07、0.73，而位點(diǎn) HT G4的值最小分別為0.05、1.06、0.05。根據(jù) Botstein確定的位點(diǎn)多態(tài)性標(biāo)準(zhǔn)：PIC＞0.5 為高度多態(tài)性，0.5＞PIC＞0.25 時為中度多態(tài)性，PIC＜0.25為低度多態(tài)位點(diǎn)[10]。從表4可以看出，三粉驢PIC指數(shù)平均值為0.47，烏頭驢PIC指數(shù)平均值為0.40 ，德州驢兩大品系PIC總的平均值為0.47，因此均屬中度多態(tài)性。其中VHl20、HTG7、HTG6、COR092、HTG10、AHT4、HTG15和COR071為高度多態(tài)性，HMS6和HTG9為中度多態(tài)性，而HMS7、HMS5和HTG4為低度多態(tài)性。本實(shí)驗(yàn)中13對微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均觀測雜合度為0.31，其中烏頭驢中位點(diǎn)HMS7、HMS5、HTG10、HTG4的觀測雜合度均為0，表明4對位點(diǎn)在樣本中均為純合子?？偟挠^測雜合度為0.02～0.73，平均觀測雜合度為0.31。通過哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了HMS6、HTG4和HTG9外，其余微衛(wèi)星位點(diǎn)均處于哈迪-溫伯格不平衡（表4）。

表4 三粉驢和烏頭驢各個位點(diǎn)的等位基因數(shù)、遺傳雜合度、多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù)

圖1 13對微衛(wèi)星位點(diǎn)多重組合毛細(xì)管電泳的代表性圖譜

圖2 烏頭驢和三粉驢中單個微衛(wèi)星引物的等位基因頻率和等位基因關(guān)系圖

通過對比烏頭驢和三粉驢中單個微衛(wèi)星位點(diǎn)引物的等位基因頻率和等位基因的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在三粉驢中位點(diǎn)片段較多為HMS6、HTG7、HTG10、HTG4和COR071，而烏頭驢中位點(diǎn)片段較多為VHl20。所研究的13個微衛(wèi)星位點(diǎn)中特有等位基因有21個，其中VHl20中126 bp，HMS5 167 bp，COR071中226 bp為烏頭驢所特有的3個等位基因；三粉驢18個特有等位基因?yàn)镠MS6 208 bp，HMS7 215 bp， HTG7中 165 、171 、175 、177 、189bp ，HTG10中 128 、140 、142 、154 bp，HMS5中 143 bp，HTG4中 200 bp，COR071中 224 、230 、232 、236、240 bp（圖2）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中烏頭驢和三粉驢的等位基因之間存在差異性。在所研究的13對微衛(wèi)星位點(diǎn)引物中共有21個等基因位點(diǎn)是2種驢所特有的。其中烏頭驢有3個特有等位基因，三粉驢具有18個特有等位基因，本研究為德州驢的遺傳多樣性檢測和資源保存提供一定的參考。

多態(tài)信息含量是衡量群體基因多態(tài)性的重要指標(biāo)，最早由Botstein等[11]提出，一般PIC值越高，位點(diǎn)的基因多態(tài)性越高。PIC＞0.5 為高度多態(tài)位點(diǎn)，當(dāng)0.5＞PIC＞0.25 時為中度多態(tài)位點(diǎn)， PIC＜0.25為低度多態(tài)位點(diǎn) 。本研究中，烏頭驢和三粉驢中最高的多態(tài)位點(diǎn)均為HT G7，其PIC值分別為0.71、0.80；最低的位點(diǎn)分別為HT G4、HMS5，其PIC分別為0.00、0.03。13對位點(diǎn)引物中有8對為多態(tài)性，2對為中態(tài)性，3對為低態(tài)性。本研究中德州驢2個品系13對位點(diǎn)的PIC值在0.05～0.78之間，平均值為0.47。遺傳多樣性PIC值均低于朱進(jìn)文等[12]利用24對微衛(wèi)星位點(diǎn)對德州驢遺傳多樣性研究結(jié)果PIC平均值0.7219，李建國[13]發(fā)現(xiàn)德州驢6個微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC平均值0.5633。這可能與檢測的品系群體及選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)不同有關(guān)。但通過對德州驢2個品系的分別檢測發(fā)現(xiàn)，在烏頭驢中，除HT G4為單態(tài)外，其余12對微衛(wèi)星位點(diǎn)引物的基因遺傳多態(tài)性較高。三粉驢中13對微衛(wèi)星位點(diǎn)均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。這說明，德州驢品種在多數(shù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多態(tài)性較高，可作為有效的遺傳分子標(biāo)記用于烏頭驢和三粉驢遺傳多樣性的分析。

遺傳雜合度又稱基因多樣性，表示群體在某微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合子的比例，它反映群體在微衛(wèi)星座位上的遺傳變異，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個最適參數(shù)[14]。一般認(rèn)為一個群體的雜合度大于0.5，則意味著它沒有受到高強(qiáng)度的選擇，遺傳多樣性比較豐富[15]。本研究中，樣本烏頭驢中觀測雜合度大于0.5的微衛(wèi)星位點(diǎn)有VHl20、HT G7、HT G9；三粉驢中為VHl20、COR092、HT G7、AHT4。以上位點(diǎn)雜合度較高，說明該位點(diǎn)可以為檢測品種提供較大的遺傳多樣性信息，利于對烏頭驢和三粉驢品種進(jìn)行研究分析。而13個微衛(wèi)星位點(diǎn)中烏頭驢平均觀測雜合度為0.27，三粉驢為0.33，品種的純合度較高，因此反映出德州黑驢品種的雜合度較低，遺傳變異程度較小。因此，為了保護(hù)這一重要的地方驢種，在繁殖雜交的過程中應(yīng)盡量避免近親繁殖或者自然選擇，以便保護(hù)德州黑驢品種的優(yōu)良基因，防止品種退化。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，三粉驢的遺傳多態(tài)性高于烏頭驢，但是2個品系的遺傳雜合度均較低，遺傳變異程度較小。

本研究初步揭示了烏頭驢和三粉驢的遺傳多樣性、遺傳變異程度等信息，為了更好地保護(hù)我國地方驢種的品種資源和選擇育種，還需要更進(jìn)一步了解各地方驢群體的遺傳信息。

[1] 孫玉江, 徐紀(jì)尊, 蔣濤, 等.中國驢種遺傳資源保護(hù)利用研究[J] .中國草食動物, 2006, 26(6): 32-34.

[2] 徐興莉, 楊虎. 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)及其在動物研究中的應(yīng)用[J] . 畜禽業(yè), 2011, (12): 34-35.

[3] Aranguren M J, Jordana J, Gomez M. Genetic conservation of fve endangered Spanish donkey breeds[J] . J Anim Breed Genet,2002, 119(4): 256-263.

[4] Aranguren M J, Gomez M, Jordana J. Hierarchical analysis of genetic structure in Spanish donkey breeds using microsatellite markers[J] . Heredity, 2002, 89(3): 207-211.

[5] Jordana J, Folch P, Aranguren J A. Microsatellite analysis of genetic diversity in the Catalonian donkey breed[J] . J Anim Breed Genet, 2001, 118(1): 57-63.

[6] Matassino D, Cecchi F, Ciani F, et al. Genetic diversity and variability in two Ⅰtalian autochthonous donkey genetic types assessed by microsatellite markers[J] . Ⅰtal J Anim Sci, 2014, 13(1): 53-60.

[7] 朱文進(jìn), 蘇詠梅, 關(guān)學(xué)敏, 等.陽原驢微衛(wèi)星多態(tài)性分析[A] . “第四屆京津冀一體化畜牧獸醫(yī)科技創(chuàng)新研討會暨“瑞普杯”新思想,新方法,新觀點(diǎn)論壇”論文集[C] . 石家莊:河北省畜牧獸醫(yī)學(xué)會, 2014: 29-31.

[8] 蔣永青, 鄭惠玲, 雷初朝, 等.蒙古驢微衛(wèi)星多態(tài)性分析[J] . 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 17(1): 50-52.

[9] 楊虎, 阿吉, 王金富, 等. 新疆3個地方品種驢微衛(wèi)星遺傳分析[J] .遺傳育種, 2008, 44(1): 8-10.

[10] Marklund S, Ellegren H, Eriksson S, et al. Parentage testing and linkage analysis in the horse using a set of highly polymorphic microsatellites[J]. Anim Genet, 1994, 25(1): 19-23.

[11] Botstein D, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet, 1980, 32(3): 314-331.

[12] 朱文進(jìn), 張美俊, 葛慕湘, 等.中國8個地方驢種遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的微衛(wèi)星分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 39(2): 398-405.

[13] 李建國. 四個驢品種微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳分析[D]. 太谷:山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[14] 楊虎. 新疆驢三個地方類群的微衛(wèi)星遺傳分析及與體尺性狀的關(guān)系[D].石河子,石河子大學(xué), 2007.

[15] 湯存?zhèn)? 余雄, 劉武軍, 等.新疆13個綿羊群體遺傳多樣性及遺傳分化的研究[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報, 2011, 32(1): 13-19.

S822.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-044

2016-06-07；

2016-07-18

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題（魯財(cái)農(nóng)指[2014] 38號）；2015山東省高效特色畜牧養(yǎng)殖項(xiàng)目；2015年度禹城市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展基金高效特色畜牧業(yè)示范縣項(xiàng)目；濟(jì)南市高校院所自主創(chuàng)新項(xiàng)目（201401264）

劉艷艷（1982-），女，山東泰安人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，E-mail: 307982070@qq.com

*通訊作者：步訊（1964-），上海人，副研究員，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，E-mail: sherrv423@126.com