劉 逍，滕戰(zhàn)偉，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

蛋氨酸對(duì)70日齡吉林白鵝產(chǎn)絨性能及IGF-Ⅰ基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

劉 逍，滕戰(zhàn)偉，婁玉杰*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

本試驗(yàn)旨在探索日糧中添加蛋氨酸水平對(duì)吉林白鵝產(chǎn)絨性能及IGF-Ⅰ基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。選擇200只健康、體重均勻的28日齡吉林白鵝作為試驗(yàn)對(duì)象，采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分為4個(gè)處理組，包括1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)處理組，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只鵝，在飼糧中分別添加0.25%、0.5%、0.75%的蛋氨酸，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，自由采食飲水，試驗(yàn)期43 d。結(jié)果表明：70日齡時(shí)，各處理組的吉林白鵝的千朵重均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），絨朵長(zhǎng)度和絨枝細(xì)度均差異不顯著（P＞0.05），但是隨著蛋氨酸水平的增加，各組千朵重、絨朵長(zhǎng)度和絨枝細(xì)度有增加的趨勢(shì)，并且Ⅲ組最佳，Ⅳ組略低于Ⅲ組，且高于Ⅱ組和Ⅰ組；70日齡吉林白鵝各個(gè)部位的千朵重、絨朵長(zhǎng)度及絨枝細(xì)度從高到低依次為胸部、腹部、背部；不同蛋氨酸處理組的鵝皮膚中IGF-Ⅰ基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），Ⅲ組最高，Ⅳ組略低于Ⅲ組，但顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05），胸部的相對(duì)表達(dá)量明顯高于背部和腹部。因此，適量的添加蛋氨酸可以提高鵝的產(chǎn)絨性能以及IGF-Ⅰ基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

吉林白鵝；產(chǎn)絨性能；蛋氨酸；IGF-Ⅰ

近年來(lái)，隨著人民生活水平的不斷增高，人們對(duì)羽絨制品的需求量越來(lái)越大。中國(guó)是世界上最大的羽絨生產(chǎn)國(guó)、出口國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1]。鵝羽絨具有保暖性強(qiáng)、柔軟等特點(diǎn)，因此，提高鵝羽絨的產(chǎn)量和質(zhì)量已成為鵝羽絨發(fā)展中的重要問(wèn)題。蛋氨酸是一種含硫氨基酸，它是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位之一，也是禽類的第一限制性氨基酸。含硫氨基酸能夠提高合成角蛋白的強(qiáng)度，改善羽毛的質(zhì)量[2]。類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-I）是一類小分子多肽物質(zhì)，它廣泛分布在毛囊、毛乳頭等部位。有試驗(yàn)表明，它可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的毛囊生長(zhǎng)，適宜的蛋氨酸水平可以提高IGF-I基因的表達(dá)量[3]。本試驗(yàn)擬通過(guò)研究在飼糧中添加不同水平蛋氨酸對(duì)吉林白鵝產(chǎn)絨性能及IGF-I基因表達(dá)的影響，探討蛋氨酸對(duì)羽絨生長(zhǎng)的調(diào)控作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧配方 選擇健康體重均勻的4周齡健康、體重（1156.53±38.37）g、公母各半的吉林白鵝200只作為試驗(yàn)動(dòng)物。飼養(yǎng)試驗(yàn)期為2015年5-7月，試驗(yàn)在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院養(yǎng)殖基地進(jìn)行，試驗(yàn)期為43 d。日糧參照美國(guó)NRC（1994）標(biāo)準(zhǔn)[4]，和實(shí)際生產(chǎn)情況進(jìn)行日糧配制，飼料配方見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只鵝，在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.25%、0.5%、0.75%的蛋氨酸，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，試驗(yàn)期每天飼喂2次，06:00、16:00各1次，自由采食和飲水，每天觀察鵝的表現(xiàn)，及時(shí)記錄采食情況。

1.3 樣品采集 試驗(yàn)鵝飼養(yǎng)到70日齡時(shí)，每個(gè)處理每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只試驗(yàn)鵝屠宰，屠宰后選用干拔羽毛的方法，分別在鵝的背、胸、腹采集羽絨以及羽毛，裝袋，作為試驗(yàn)樣品。采集背、胸、腹部皮膚，裝入凍存管，迅速放入-80℃液氮內(nèi)儲(chǔ)存，為提取皮膚總RNA做準(zhǔn)備。

1.4 產(chǎn)絨性能測(cè)定及方法

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4.1 千朵重的測(cè)定 在每個(gè)部位隨機(jī)選取1 000朵絨羽，用萬(wàn)分之一電子天平稱重[5]。

1.4.2 朵絨長(zhǎng)的測(cè)定 用千分卡尺量取絨朵根部至尖部長(zhǎng)度。

1.4.3 絨朵絨小枝的細(xì)度的測(cè)定 用顯微投影儀測(cè)每根羽枝的直徑，每只鵝每個(gè)部位測(cè)定50根羽小絲。

1.5 IGF-I基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定及方法

1.5.1 主要試劑及儀器 氯仿，異丙醇，無(wú)水酒精，DEpC水，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、SYBRRpremix，Ex TaqTM熒光染料（TaKaRa公司）,PCR Marker DL 2 000和瓊脂糖。Biofuge primo R型低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；StepOneplusTM熒光定量PCR儀；Powerpac Basic型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Nanodrop2 000型分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；Gel Doc 2 000型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.5.2 引物設(shè)計(jì) 參照 GenBank上IGF-I基因相關(guān)序列，序列號(hào)為DQ490222。利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表2。

1.5.3 方法 提取皮膚組織的總RNA[6]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，用核酸定量?jī)x測(cè)定總RNA濃度以及吸光度D260/D280的值，此值在1.8～2.0中間說(shuō)明RNA純度較高，適宜進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定IGF-I的表達(dá)量[7]，反應(yīng)體系：dH2O 6 μL，上下游引物以及樣品各2 μL，ROXReference Dye 0.4 μL，SYBRR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s,變性95℃ 5 s,退火60℃ 30 s,延伸95℃15 s , 60℃ 1 min，95℃15 s，35個(gè)循環(huán)。

1.5.4 相對(duì)定量分析法公式 F=2-△△Ct△△Ct=（待測(cè)目的基因平均Ct值-待測(cè)內(nèi)參基因平均Ct值）-（對(duì)照目的基因平均Ct值-對(duì)照內(nèi)參基因平均Ct值）[8]

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-Way Anova模塊進(jìn)行單因素?cái)?shù)據(jù)分析，顯著性檢驗(yàn)應(yīng)用Duncan′s法，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同蛋氨酸水平對(duì)70日齡吉林白鵝產(chǎn)絨性能的影響

2.1.1 不同蛋氨酸水平對(duì)70日齡吉林白鵝千朵重的影響 如表3所示，與對(duì)照組相比較，各試驗(yàn)組均顯著提高了70日齡吉林白鵝背部、胸部及腹部的千朵重（P＜0.05），Ⅲ組最重，Ⅳ略低于Ⅲ組，但顯著高于Ⅱ組和Ⅰ組。70日齡吉林白鵝各個(gè)部位的千朵重從高到低依次為胸部、腹部、背部。

表2 引物信息

表3 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝千朵重 g

2.1.2 不同蛋氨酸水平對(duì)70日齡吉林白鵝絨朵長(zhǎng)度的影響 如表4顯示，不同蛋氨酸水平對(duì)絨朵長(zhǎng)度的影響均不顯著。但隨著蛋氨酸添加量的逐漸升高，70日齡吉林白鵝的絨朵長(zhǎng)度也逐漸增長(zhǎng)，Ⅲ組最長(zhǎng)，Ⅳ組稍低于Ⅲ組，但是高于Ⅱ組和Ⅰ組，并且70日齡吉林白鵝胸部絨朵長(zhǎng)度高于背部和腹部。

表4 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝絨朵長(zhǎng)度 mm

2.1.3 不同蛋氨酸水平對(duì)70日齡吉林白鵝絨枝細(xì)度的影響 由表5可見(jiàn)，蛋氨酸的添加水平對(duì)70日齡吉林白鵝絨枝細(xì)度影響差異不顯著。但是，與絨朵長(zhǎng)度一樣，隨著蛋氨酸水平的提高，絨枝細(xì)度有增加的趨勢(shì)，并且Ⅲ組最大，Ⅳ組略低于Ⅲ組，但是高于Ⅱ組以及Ⅰ組，70日齡吉林白鵝各個(gè)部位的絨枝細(xì)度從大到小依次為胸部、腹部、背部。

表5 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝絨枝細(xì)度 μm

2.2 不同蛋氨酸水平對(duì)70日齡吉林白鵝皮膚IGF-I基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 由圖1可見(jiàn)，3條RNA條帶清晰，無(wú)RNA降解，純度較高，可以進(jìn)行熒光定量PCR。如圖2顯示，IGF-I基因擴(kuò)增曲線表明擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，符合試驗(yàn)要求。如表6顯示，各處理組的鵝皮膚中IGF-I基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且Ⅲ組最高，Ⅳ組略低于Ⅲ組，但顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05）。胸部的相對(duì)表達(dá)量明顯高于背部和腹部。

表6 不同蛋氨酸水平的70日齡吉林白鵝皮膚中IGF-I基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖1 RNA鑒定圖譜

圖2 擴(kuò)增曲線

3 討 論

3.1 不同蛋氨酸水平對(duì)70日齡吉林白鵝產(chǎn)絨性能的影響 本試驗(yàn)對(duì)70日齡吉林白鵝不同蛋氨酸添加水平的產(chǎn)絨性能影響做了研究，主要測(cè)定了鵝背部、胸部以及腹部皮膚千朵重、絨朵長(zhǎng)度以及絨枝細(xì)度3個(gè)指標(biāo)，能充分的衡量羽絨的性能。而影響產(chǎn)絨性能主要有環(huán)境作用，營(yíng)養(yǎng)代謝和遺傳差異3個(gè)方面[9]。本研究結(jié)果顯示，不同的蛋氨酸添加水平顯著提高了70日齡吉林白鵝的千朵重，而絨朵長(zhǎng)度和絨枝細(xì)度也有增加的趨勢(shì)，并且都為Ⅲ組最高。Qi等[10]分析了含硫氨基酸對(duì)動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)的作用，指出因?yàn)榱蚩梢源碳ず铣纱x，從而增加了合成角蛋白所需要的底物，因此含硫氨基酸對(duì)動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)有益。陳伯友等[11]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加蛋氨酸安哥拉兔的產(chǎn)毛量明顯增高。袁紹有等[12]研究表明，在皖西白鵝活拔鵝毛后的精料補(bǔ)充料中添加適量的蛋氨酸有利于鵝新生羽毛、羽絨的生長(zhǎng)。這為證明蛋氨酸可以提高鵝的產(chǎn)絨性能提供依據(jù)。但是0.75%蛋氨酸添加組雖高于0.25%添加組以及對(duì)照組，卻略低于0.5%添加組,可能是因?yàn)榈鞍彼岷卸拘訹10]如果過(guò)量，則會(huì)抑制羽毛的發(fā)育。而且在其他水禽中，不同著生部位之間也存在差異[13]。并且多項(xiàng)研究表明[5,14-16]，胸部的產(chǎn)絨性能高于腹部和背部。本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致，70日齡吉林白鵝的千朵重、絨朵長(zhǎng)以及絨枝細(xì)度，均表現(xiàn)為胸部最好，腹部其次，背部最低，這是因?yàn)樾馗共繛橹饕漠a(chǎn)絨部位。

3.2 不同蛋氨酸水平對(duì)70日齡吉林白鵝皮膚IGF-I基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 在本試驗(yàn)條件下，提高日糧中蛋氨酸的添加水平，可以提高鵝皮膚中IGF-I的表達(dá)量，但是Ⅳ組略低于Ⅲ組，高于Ⅱ組和Ⅰ組。毛囊是鵝羽毛生長(zhǎng)發(fā)育的基石，而毛囊的發(fā)生起源于皮膚上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用[17]。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，給懷孕的母兔日糧中添加適宜蛋氨酸，可以對(duì)仔兔的毛囊發(fā)育有刺激作用，能增加毛發(fā)纖維直徑。Hamideh[19]研究表明，胚蛋注射蛋氨酸，可以增加雞胚毛囊密度和直徑。由此可以證明，適量的添加蛋氨酸對(duì)毛囊的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。孫永峰等[20]認(rèn)為，IGF-I參與調(diào)控了皮膚組織中毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，并且不同產(chǎn)絨形狀的鵝種IGF-I時(shí)空表達(dá)特異性不同。張海華[3]表示，適宜的蛋氨酸水平對(duì)IGF-I的表達(dá)量有顯著提高的效果。以上與本研究一致，適宜的蛋氨酸水平可以顯著提高IGF-I基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。而Ⅳ組略低于Ⅲ組，同樣也可能因?yàn)榈鞍彼峋哂卸拘訹10]，過(guò)量的蛋氨酸會(huì)抑制毛囊的發(fā)育。由于本試驗(yàn)的產(chǎn)絨性能趨勢(shì)和IGF-I基因mRNA表達(dá)量趨勢(shì)一致，因此，蛋氨酸是否通過(guò)IGF-I對(duì)鵝毛囊的調(diào)控從而改善其產(chǎn)絨性能有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為0.73%時(shí)，70日齡吉林白鵝的產(chǎn)絨性能最佳。70日齡吉林白鵝各個(gè)部位的產(chǎn)絨性能從高到低依次為胸部、腹部、背部。隨著蛋氨酸水平的增加，70日齡吉林白鵝皮膚中IGF-I基因的mRNA表達(dá)量趨勢(shì)與產(chǎn)絨性能相同，飼糧蛋氨酸水平為0.73%時(shí)最佳。

[1] 陳宏權(quán), 周莉, 劉武藝.羽絨生長(zhǎng)發(fā)育及其特性的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) , 2004, 31 (2): 236-241.

[2] 易先國(guó), 何書(shū)海, 梁存軍, 等. 蛋氨酸對(duì)皖系長(zhǎng)毛兔毛囊發(fā)育的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2012, (3): 39-41.

[3] 張海華. 日糧蛋白質(zhì)和蛋氨酸水平對(duì)水貂生產(chǎn)性能及毛皮發(fā)育的影響[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.

[4] National Research Council. Nutrient Requirement of Poultry[M]. 9th Revised ED. Washington DC: National Academy Press, 1994.

[5] 張文慧. 吉林農(nóng)大白鵝羽絨品質(zhì)及特性的研究[D]. 長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2003.

[6] 田月珍, 狄江, 吳偉偉, 等. 角蛋白26基因在超細(xì)型和細(xì)型細(xì)毛羊皮膚組織中的表達(dá)差異[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2012, (6): 31-37.

[7] Hugger J, Dheda B S. Realtime RT-PCR normalisation strategies and considerations[J]. J Genes Ⅰmmun, 2005, 6 (4): 279-284.

[8] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTCT method[J]. Methods, 2001, 25: 402-408.

[9] 徐日福, 吳偉, 徐慧, 等. 鵝羽絨生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)家禽, 2006, 28 (20): 70-74.

[10] 堵光瑩. 蛋氨酸對(duì)獺兔毛皮品質(zhì)及β-胱硫醚合酶的影響[D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2014.

[11] 陳伯友, 馬茂高, 王賢勇, 等. 飼糧含硫氨基酸水平對(duì)長(zhǎng)毛兔產(chǎn)毛性能的影響[J]. 飼料博覽, 1994, (4): 5-6.

[12] 袁紹有, 左瑞華. 日糧蛋氨酸水平對(duì)皖西白鵝拔毛后產(chǎn)毛性能的影響[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物, 2007, (4): 36-37.

[13] Hopps E C. Ⅰnformation on waterfowl feather characterist -ics[J]. Trans Ⅰllinois State Acad Sci, 2002, 95 (3): 229-237.

[14] 劉桂瓊, 曾凡同, 邱祥聘. 四川白鵝羽絨生長(zhǎng)及其影響因素的研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) , 1998, 16(4): 456-458.

[15] 牟玉婷, 吳偉, 孫永峰, 等. BMP2基因在鵝胸,腹,背部皮膚中的定位定量表達(dá)研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35 (2): 241-249.

[16] 趙洋, 王志躍, 楊海明,等. 噴淋對(duì)仔鵝產(chǎn)絨性能和絨羽理化性質(zhì)的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, (5): 781-788.

[17] Yu M K, Wu P, Widelitz Randall B, et al. The morphogenesis of feathers[J]. Nature, 2002, 420(6913):308-312.

[18] Zhou Q F, Tao K, Wang Y C, et al. Methionine levels in the diet for pregnant female rabbits affects hair follicles development of baby rabbits[J]. Anim Husband Feed Sci, 2012, 4 (5): 193-196.

[19] Mohammadrezaei H, Nazem M, Mohammadrezaei M. Effect of in ovo injection of Methionine on the histomorphometry of Jejunum of chicken embryo[J]. Biolog Forum-An Ⅰnt J , 2015, (Special Ⅰssue) 7 (2): 23-26 .

[20] 孫永峰, 史旭升, 隋玉健, 等. 胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ基因在鵝不同發(fā)育時(shí)期皮膚及毛囊組織中的表達(dá)[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, (1): 60-63+68.

S835.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-075

2016-06-13；

2016-07-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372331）

劉逍（1992-），女，吉林松原人，碩士，E-mail: 444077553@qq.com

*通訊作者：婁玉杰，E-mail: lyjjlau@163.com