卞如如，范陽陽，劉艷艷，霍勝楠，盛清凱，譚晴晴，張全芳，張 卉，步 迅*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250101；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

一種驢和馬及狐貍源性成分快速檢測方法的研究

卞如如1，范陽陽1，劉艷艷1，霍勝楠2，盛清凱3，譚晴晴1，張全芳1，張 卉2，步 迅1*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250101；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

實(shí)驗(yàn)旨在建立快速檢測驢、馬和狐貍源性成分的方法。以驢、馬和狐貍的線粒體保守序列16S rRNA基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)通用引物和以不同熒光素標(biāo)記的特異Taq Man探針，構(gòu)建與通用引物共用的陽性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)（Internal Amplification Control，IAC）作為PCR監(jiān)控反應(yīng)體系。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和條件，建立能同時(shí)檢測驢、馬和狐貍源性成分的四重實(shí)時(shí)熒光PCR方法。結(jié)果表明：利用驢、馬、狐貍、牛、豬、羊、水貂、狗、雞、鴨、大豆、小麥、玉米等物種檢測沒有交叉反應(yīng)，證明該方法特異性高，準(zhǔn)確性好。該方法模板DNA檢測靈敏度為0.01 ng。本研究建立的驢、馬和狐貍源性四重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR檢測體系靈敏度高、特異性強(qiáng)，能有效鑒別動(dòng)物產(chǎn)品中驢、馬和狐貍的源性成分，也可用作相關(guān)動(dòng)物皮張真?zhèn)蔚蔫b別方法。

16S rRNA基因；多重實(shí)時(shí)熒光PCR法；驢；馬；狐貍；源性成分

驢肉享有“天上龍肉，地下驢肉”的美譽(yù)。近年來，利用廉價(jià)肉類摻假驢肉的現(xiàn)象層出不窮，對(duì)人類的健康造成極大威脅。為了確保食品標(biāo)簽真實(shí)準(zhǔn)確，加強(qiáng)食品標(biāo)識(shí)管理，改進(jìn)食品安全和保護(hù)消費(fèi)者利益，應(yīng)積極開展動(dòng)物源性成分檢測方面的研究。目前，動(dòng)物源性成分鑒別的方法主要包括物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法[1]，其中以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的多重實(shí)時(shí)熒光PCR法成為檢測的重要工具[2]。該技術(shù)可有效地檢測食品中的重要性肉類物種源性成分，包括豬肉、雞肉、牛羊肉等[3-5]。不同物種檢測范圍最廣的也集中于肉類檢測例如對(duì)驢、馬源性成分的檢測[6-7]。目前，對(duì)食品中動(dòng)物源性的熒光定量PCR檢測研究均缺乏陽性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)（Internal Amplification Control，IAC）監(jiān)控反應(yīng)體系，無法避免由反應(yīng)抑制因素而造成假陰性結(jié)果。因此，建立添加有外源擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中驢肉、馬肉和狐貍?cè)獾亩嘀責(zé)晒舛縋CR檢測方法對(duì)食品安全的快速監(jiān)管具有重要的創(chuàng)新實(shí)踐意義。本研究以線粒體16S rRNA基因?yàn)榘谢?，分別設(shè)計(jì)驢、馬和狐貍源性特異性引物和探針，成功建立了能同時(shí)檢測驢、馬和狐貍源性成分的多重實(shí)時(shí)熒光PCR體系，同時(shí)可適用于飼料、肉類、奶類、皮毛類和動(dòng)物油脂類等動(dòng)物產(chǎn)品中的驢、馬和狐貍源性成分的鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 生熟驢肉、馬肉、狐貍?cè)狻⑸Ｈ?、生綿羊肉、生豬肉、生山羊肉、生兔肉、生鴨肉、生雞肉、生鵝肉、生魚肉、玉米、小麥等均購自濟(jì)南市農(nóng)貿(mào)市場。此外，150份驢肉產(chǎn)品，五香驢肉、驢肉火燒、驢肉卷、醬驢肉、驢肉香腸均購自于濟(jì)南市各大超市、農(nóng)貿(mào)市場等。

1.2 試劑與儀器 動(dòng)物組織提取試劑盒為OMEGA品牌。TaqTMHot star Version 熱啟動(dòng)酶、dNTPs、Mg2+、DNA分子量MakerDL 2 000、電泳上樣緩沖液等PCR反應(yīng)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。引物與探針由生工生物工程（上海）有限公司負(fù)責(zé)合成。2×TaqMan Master Mix為DBI Bio science品牌。 DNA測序由山東省農(nóng)科院生物技術(shù)中心測序中心完成。

ABI 7500熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品，TaKaRa PCR儀為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。5424 D型高速離心機(jī)為Ependorf公司產(chǎn)品，凝膠成像儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品DNA的提取 取待測樣本50 g研磨充分混勻，取50 mg進(jìn)行DNA提取，可依照動(dòng)物組織提取試劑盒中的操作說明提取DNA。Nanodrop核酸檢測儀檢測DNA樣本濃度和純度，要求在1～ 20 ng/ μL，OD值1.7～1.8。

圖1 驢、馬和狐貍的同源性對(duì)比序列圖

1.3.2 引物與探針的設(shè)計(jì) 從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取包括驢（NC_016061.1）、狐貍（NC_008434.1）和馬（AY584828.1）的線粒體16S rRNA基因序列，利用DNAMan軟件進(jìn)行同源性比對(duì)（圖1），利用Primer5和Primer3軟件分別設(shè)計(jì)引物和探針，在3個(gè)物種的Consensus序列設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為200 bp左右，在差異明顯區(qū)設(shè)計(jì)3條特異性Taq Man探針分別針對(duì)驢、馬和狐貍，以不同的熒光元素標(biāo)記。要求設(shè)計(jì)的引物TM值在55～60℃左右，探針的TM值要高于引物TM值7～10℃，引物和探針序列、擴(kuò)增片段大小見表1。

1.3.3 質(zhì)粒的構(gòu)建 構(gòu)建內(nèi)標(biāo)過程依照參考文獻(xiàn)[2]用Perl隨機(jī)生成一段DNA序列，然后2頭加上通用引物序列，使其在NCBI中BlAST后沒有找到同源的DNA片段，形成針對(duì)驢、馬和狐貍檢測體系的競爭型內(nèi)標(biāo)DNA序列，長度為100 bp。將擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA序列委托上海生工人工基因合成，合成片段連接到PMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藍(lán)白斑篩選，挑取白斑，測序驗(yàn)證，用NanodroP微量分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。用于擴(kuò)增陽性內(nèi)標(biāo)的探針序列及內(nèi)標(biāo)序列見表1。

1.3.4 多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件優(yōu)化 單重PCR反應(yīng)條件的確立：分別以驢、馬和狐貍為研究對(duì)象，反應(yīng)體系設(shè)定為20 μL，10×TaqMan Ma stermix 10 μL，對(duì)PCR反應(yīng)參數(shù)包括引物濃度，探針濃度及PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選。引物濃度為 10 μmol/L，用量梯度分別設(shè)為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 μL，探針濃度設(shè)為0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L。每次實(shí)驗(yàn)采取等量的模板，設(shè)定一個(gè)變量，以Ct值、熒光增量和平臺(tái)期等因素作為參考依據(jù)，每個(gè)成分的濃度重復(fù)3次，若結(jié)果穩(wěn)定，則可確定為最佳的濃度值。根據(jù)引物和探針的退火溫度，對(duì)優(yōu)化好的反應(yīng)體系在“95℃ 10 min；95℃15 s；55～62℃ 35 s 45個(gè)循環(huán)”的范圍內(nèi)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)采取等量DNA模板，每個(gè)反應(yīng)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以Ct值、熒光增量和平臺(tái)期等因素作為參考依據(jù)，以確定最佳的反應(yīng)條件。

多重PCR反應(yīng)條件的建立：按照上述單重PCR優(yōu)化好的引物及探針濃度進(jìn)行組合，以優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件“95℃ 10 min；{95℃ 15 s；60℃35 s} 45個(gè)循環(huán)”進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，以Ct值、熒光增量和平臺(tái)期及各探針的熒光信號(hào)高低等因素作為參考依據(jù)，通過調(diào)整各探針的濃度使其熒光信號(hào)高低及擴(kuò)增效率盡量達(dá)到一致。

1.3.6 多重?zé)晒釶CR方法的特異性 分別從驢肉、馬肉、狐貍?cè)?、牛肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉、兔肉、鴨肉、雞肉、鵝肉、魚肉、玉米、小麥中提取的基因組DNA為模板，按照上述優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR，檢測引物和探針的特異性，每個(gè)樣本設(shè)3次平行實(shí)驗(yàn)。

表1 驢、馬和狐貍的引物及探針DNA序列

1.3.7 多重?zé)晒釶CR方法的靈敏度使用試劑盒提取目標(biāo)基因組DNA，用Nanodrop定量到50 ng，按10×梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），每個(gè)梯度均取2.0 μL為模板量（即10、1、0.1、0.01、0.001 ng）進(jìn)行多重?zé)晒釶CR檢測，確定其最低檢出限，每個(gè)樣本設(shè)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的檢測 分別取純驢、馬和狐貍3個(gè)不同樣本DNA為模板，按照上述優(yōu)化好的體系和反應(yīng)條件進(jìn)行多重?zé)晒釶CR檢測，每個(gè)樣品進(jìn)行3次復(fù)孔的獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定該方法的穩(wěn)定性。

1.3.9 多重?zé)晒釶CR檢測方法在市售樣本中的實(shí)際檢測應(yīng)用 利用所建立的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對(duì)150份市售的驢肉制品進(jìn)行實(shí)際樣本檢測，驗(yàn)證此方法的使用價(jià)值和檢測真實(shí)性。

2 結(jié) 果

2.1 單重?zé)晒釶CR檢測方法條件優(yōu)化 單重PCR反應(yīng)條件確立：以驢、馬和狐貍為研究對(duì)象，反應(yīng)體系設(shè)定為20 μL，10×TaqMan Ma ster mix10 μL，對(duì)PCR反應(yīng)參數(shù)包括引物濃度，探針濃度及PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選。最終確立引物終濃度為0.5 μmol/L，各探針終濃度：驢探針MtlP終濃度為0.2 μmol/L，馬特異性探針MtMP終濃度為0.1 μmol/L，狐貍探針MtHP終濃度為0.4 μmol/L，內(nèi)標(biāo)質(zhì)控探針濃度0.1 μmol/L。PCR反應(yīng)最佳反應(yīng)條件為95℃ 10 min；{95℃ 15 s；60℃ 35 s} 45個(gè)循環(huán)。

2.2 多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系建立 通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，選擇優(yōu)先選用20 μ L的PCR擴(kuò)增體系包括：10×TaqMan Master mix 2.0 μ L，HS-Taq酶（5 U/ μL）0.2 μ L, Primer Mix（5 μ mol/L） 2.0 μ L，Probe Mix（2 μmol/L） 2.0 μ L，IAC DNA（1 pg/μ L） 1.0 μL，DNA模板（1～20 ng/ μ L）2.0 μ L，補(bǔ)水至20 μ L。多重?zé)晒釶CR體系可成功的檢測驢、馬和狐貍3種源性成分及內(nèi)標(biāo)質(zhì)控，均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線（圖2）。

圖2 引物和探針特異性結(jié)果

2.3 多重?zé)晒釶CR方法的特異性實(shí)驗(yàn) 通過建立的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系分別對(duì)14種不同物種進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果顯示，驢Ct值為26.32 ± 0.05，馬Ct值為27.75 ± 0.02，狐貍Ct值為22.31 ±0.04，驢、馬和狐貍均有擴(kuò)增曲線，而其他樣本均無Ct值，判定為陰性（表2）。結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的引物和探針只對(duì)含驢、馬和狐貍源性成分的物種表現(xiàn)出特異性，與其他檢測對(duì)象無交叉反應(yīng)。

表2 多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性檢測（Ct值±SD）

2.4 多重?zé)晒釶CR方法的靈敏度實(shí)驗(yàn) 將已測定的驢、馬和狐貍基因組DNA進(jìn)行10×梯度稀釋后進(jìn)行多重?zé)晒釶CR檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)驢、馬和狐貍基因組DNA模板量為0.01 ng時(shí)，均能檢出擴(kuò)增曲線，且擴(kuò)增閾值Ct值≤35；當(dāng)模板用量達(dá)到0.001ng時(shí)擴(kuò)增曲線極低，因此，本研究中驢、馬和狐貍源性成分檢出限均為0.01 ng（圖3A- C）。

圖3 馬、驢和狐貍DNA靈敏度檢測

2.5 多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)純馬，驢和狐貍樣品進(jìn)行源性成分的重復(fù)性檢測，每個(gè)物種取3個(gè)DNA樣品，每個(gè)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個(gè)樣品的3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值的標(biāo)準(zhǔn)方差均小于0.05。說明檢測結(jié)果重復(fù)性好，檢測穩(wěn)定性高（表3）。

2.6 市售肉類樣品的檢測 根據(jù)優(yōu)化的多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對(duì)市售的驢肉類樣品進(jìn)行實(shí)際的檢測，發(fā)現(xiàn)市售驢肉產(chǎn)品檢出狐貍?cè)夂婉R肉成分。在30份鮮驢肉中5份檢測出馬源性成分，40份五香驢肉中檢測出10份馬源性成分和29份狐貍源性成分，20份五香驢肉火燒中檢測出8份馬源性成分和7份狐貍源性成分，醬驢肉中檢測出7份馬源性成分和9份狐貍源性成分，驢肉香腸中檢測出5份馬源性成分和9份狐貍源性成分，而20份驢肉卷中均未檢出驢源性成分（表4）。綜上可以證明此種檢測方法有一定的使用價(jià)值。

3 討 論

利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測目標(biāo)主要包括常見畜禽類源性成分[8-9]。我國食用驢肉的傳統(tǒng)集中在北方地區(qū)，肉驢養(yǎng)殖業(yè)是我國近年來扶持的熱興養(yǎng)殖項(xiàng)目之一。截止目前，驢源性成分檢測方法的研究報(bào)道較少，而利用多重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測驢、馬和狐貍3種動(dòng)物源性成分的未見報(bào)道。本研究在參考前人研究的基礎(chǔ)上[10-12]，分別基于線粒體16SrRNA基因設(shè)計(jì)驢、馬和狐貍共用的1對(duì)通用引物和各自特異性探針，同時(shí)構(gòu)建能夠有效指示體系中抑制劑存在的競爭性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，建立了含有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中驢肉、馬肉和狐貍?cè)獬煞值腡aqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。

目前，多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)鑒定動(dòng)物源性成分關(guān)鍵技術(shù)為靶基因的正確選擇。鑒于線粒體基因組結(jié)構(gòu)比較簡單、穩(wěn)定、分子量小，每個(gè)細(xì)胞中有1 000～10 000個(gè)拷貝，容易從組織中分離提取。現(xiàn)在很多學(xué)者研究了mtDNA在動(dòng)物種屬鑒定中的應(yīng)用，與核DNA分子標(biāo)記相比，具有靈敏度高、精確度好、快速、降解?。庸み^程中mtDNA保持較完整）、穩(wěn)定容易操作等優(yōu)勢(shì)。在線粒體DNA中，16SrRNA基因是線粒體基因組中研究較多的基因，為生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可變序列其序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，被稱為進(jìn)化分子鐘[13]。基于動(dòng)物mtDNA的PCR分子標(biāo)記技術(shù)的上述特點(diǎn)，加之多重?zé)晒釶CR的快速、靈敏、高通量等特點(diǎn)，因此在動(dòng)物源性成分鑒別檢測中的應(yīng)用具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究基于線粒體加工過程中保持較完整和進(jìn)化保守性的優(yōu)勢(shì)，作為目標(biāo)靶基因，設(shè)計(jì)驢、馬和狐貍特異引物和探針本研究結(jié)果顯示多重?zé)晒釶CR體系，通過對(duì)其引物和探針特異性檢測發(fā)現(xiàn)，該方法特異性強(qiáng)，與其他物種之間無交叉反應(yīng)。重復(fù)性好，對(duì)鮮肉、熟肉均能得到很好的檢測結(jié)果。本研究方法的建立可以實(shí)現(xiàn)驢、馬和狐貍3種動(dòng)物源性成分的快速鑒定，檢出限均達(dá)到0.01 ng，具有較高的靈敏度；進(jìn)一步通過對(duì)市售產(chǎn)品的實(shí)際檢測，證明其實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，表明該檢測體系可作為市場驢源性產(chǎn)品有效的檢測方法。

表3 多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表4 市售驢肉類產(chǎn)品檢測結(jié)果

4 結(jié) 論

本研究以驢、馬和狐貍的線粒體基因?yàn)榘行蛄校ㄟ^添加競爭型擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)使其在不影響體系擴(kuò)增靈敏度的同時(shí)，起到有效指示假陰性的效果，從而建立的驢、馬和狐貍源性四重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR檢測體系能有效鑒別動(dòng)物產(chǎn)品中驢、馬和狐貍的源性成分，與常規(guī)PCR相比大大節(jié)約時(shí)間，操作方便，安全可靠，為其保障相關(guān)肉類、飼料、食品等產(chǎn)品摻假的鑒定與控制提供可靠的技術(shù)支撐。

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2016-07-21；

2016-09-01

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題（魯財(cái)農(nóng)指[2014] 38號(hào)）；山東省科技廳山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金計(jì)劃項(xiàng)目 （BS2010SW024 ）；濟(jì)南市高校院所自主創(chuàng)新項(xiàng)目（201401264）

卞如如（1992-），山東濟(jì)寧人，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳學(xué)，E-mail: brr1992@163.com

*通訊作者：步迅（1964-），上海人，副研究員，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，E-mail:sherry6423@126.com