曾 慧，吳 丹，王 雪，陳華黎，傅 榮，蔣 維△

(1.四川省人民醫(yī)院感染內(nèi)科,成都 610071；2.四川大學華西醫(yī)院分子醫(yī)學研究中心,成都 610041)

小鼠垂體中葉素對異丙腎上腺素誘導的小鼠心臟肥大的保護作用研究*

曾 慧1,2，吳 丹2，王 雪2，陳華黎2，傅 榮1，蔣 維2△

(1.四川省人民醫(yī)院感染內(nèi)科,成都 610071；2.四川大學華西醫(yī)院分子醫(yī)學研究中心,成都 610041)

目的 利用異丙腎上腺素(ISO)誘導的小鼠心臟肥大模型研究小鼠垂體中葉素(IMD)拮抗心臟肥大的藥理學作用和機制。方法 建立小劑量ISO皮下注射誘導心臟肥大的小鼠模型，研究IMD給藥后的小鼠血流動力學指標和心質(zhì)量/體質(zhì)量比，然后利用心臟組織切片評價心肌細胞橫截面積、凋亡和纖維化。采用熒光實時定量PCR法檢測心臟組織的心鈉素(ANP)、腦鈉肽(BNP)、內(nèi)源性IMD及其受體系統(tǒng)的mRNA表達水平。結果 與ISO誘導的小鼠心臟肥大模型組相比較，腹腔注射IMD治療明顯降低ISO處理所增加的心質(zhì)量/體質(zhì)量比和心肌細胞橫截面積、心臟肥大標志物ANP及BNP的mRNA水平，以及心肌細胞凋亡率和心肌組織纖維化率。同時，改善心臟功能,左室壓力、等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大和下降的最小速率、每搏排血量、心輸出量和射血分數(shù)明顯增加，而左心室舒張末期壓力顯著降低。此外，ISO處理明顯誘導心臟組織內(nèi)源性IMD及其受體的表達。結論 ISO誘導心臟組織內(nèi)源性IMD及其受體的表達，外源性給與IMD治療可能通過ISO活化的IMD受體系統(tǒng)實現(xiàn)其拮抗心臟肥大的藥理學保護作用。

異丙腎上腺素；心臟擴大；垂體；垂體中葉素；Intermedin受體系統(tǒng)

心臟肥大是心臟對各種病理性肥大刺激的代償反應，許多心血管疾病如高血壓、瓣膜病、心肌梗死和先天性心臟病等都伴有心臟肥大，因此心臟肥大是心臟病發(fā)病和死亡的重要危險因素[1-2]。心臟肥大發(fā)生機制極其復雜[1-3]，其中，心肌組織局部旁/自分泌網(wǎng)絡的失衡和內(nèi)源性細胞因子活化是其主要特征，這些活化的心血管活性因子對維持心肌功能具有重要的作用，對肥大刺激具有防御作用[4-5]。目前，研究和開發(fā)這些自分泌/旁分泌因子的藥理激動劑或拮抗劑是當前心臟肥大疾病防治的重要手段和方向[4-6]。

垂體中葉素(intermedin，IMD)是降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)家族新成員，廣泛分布于心血管系統(tǒng)，是外周循環(huán)重要的生理調(diào)節(jié)因子，可舒張體、肺循環(huán)血管，增強心肌收縮力，增加腎血流和鈉鹽排出[7-8]。多種心血管疾病狀態(tài)下，內(nèi)源性IMD及其受體水平明顯增加，以旁/自分泌形式保護器官損傷[7]。CGRP家族成員CGPR和腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)具有明顯拮抗心臟肥大的藥理學效應[7-9]。IMD的生物學效應和ADM相似，并與CGRP和ADM共用相同的受體系統(tǒng)，即由降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor like receptor，CRLR)與受體活化修飾蛋白(receptor activity modifying proteins，RAMPs)共同構成的受體復合體[9]。已有報道表明，IMD可保護心肌細胞拮抗氧化應激[7]和促肥大因子血管緊張素Ⅱ的刺激[8]，提示作為一個內(nèi)源性反應調(diào)節(jié)肽，IMD具有很強的心血管系統(tǒng)保護作用[7-9]。但目前尚不清楚IMD能否拮抗交感神經(jīng)遞質(zhì)活化腎上腺素受體所誘導的心臟肥大疾病[7-8]。

本研究擬利用小劑量鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)持續(xù)給藥建立心臟肥大模型，研究心肌組織的內(nèi)源性IMD及其受體系統(tǒng)在肥大過程中的變化，給予外源性IMD保護心臟肥大的藥理學作用及機制，為臨床心臟肥大疾病的防治提供新的理論依據(jù)和治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性 C57小鼠27只，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自四川大學實驗動物中心，置于符合標準溫度、空氣和照明等條件的清潔級動物房進行飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 小鼠IMD 肽段(IMD8-47)的結構如下：

其中，N-末端的第3和第8位半胱氨酸殘基之間由二硫鍵連接，C-末端為酰胺化的酪氨酸。實驗用IMD8-47由上海閃晶生物技術公司采用Fmoc/PyBOP固相合成方法，使用同時性多重固相肽合成儀(PSSM-8型多肽合成儀，島津，日本東京)合成。

DMEM細胞培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM)購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；ISO、胰蛋白酶購自Sigma公司；總RNA抽提試劑TRIZOL購自Invitrogen公司；M-MLV 逆轉錄酶(M-MLV reverse transcriptase)購自Promega公司;實時熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒購自Takara公司。兔抗小鼠IMD抗血清購自北京愛迪博生物科技有限公司；辣根過氧化物標記二抗(山羊抗兔)購自北京中杉公司；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記凋亡測定[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]試劑盒購自羅氏公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 方法

1.2.1 ISO誘導的心臟肥大小鼠模型的建立及藥物處理 雄性C57小鼠分為3組，每組9只：對照組、ISO造模組(ISO組)及IMD治療組(IMD-ISO組，腹腔注射IMD治療的ISO模型小鼠)。小鼠正常進食，ISO組每天背部皮下注射5 mg/kg ISO 1次，連續(xù)7 d；IMD-ISO組在每次背部皮下注射5 mg/kg ISO前2 h及給予ISO后2、4、8 h分別腹腔注射200 nmol/kg IMD，連續(xù)7 d；對照組背部皮下注射等容積的生理鹽水，連續(xù)7 d。正常飼養(yǎng)1周，每天記錄小鼠體質(zhì)量。

1.2.2 PV-LOOP檢測心臟功能 小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)進行麻醉，固定于37 ℃恒溫電熱板上；行氣管插管，連接小動物呼吸機(Harvard)，保持呼吸頻率120次/分鐘，通氣體積每次0.5 mL；于2～3肋間剪開肋間肌肉，暴露心尖，左心室插入壓力-容積感受器探頭(加拿大Scisense.公司)，以iWorx型生理多導儀(美國iWorx/CB Sciences.公司)記錄左心室壓力(left ventricle pressure，LVP)-容積曲線及相關參數(shù)，包括小鼠LVP、左心室容積(left ventricle volume，LVV)、左心室收縮(left ventricle end-systolic pressure，LVESP)和舒張末期壓力(Left ventricle end-diastolic pressure，LVEDP)、等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大/最小速率(maximal and minimal value of the first derivative of LV pressure，dP/dtmax and dp/dtmin)、左心室收縮(end-systolic volume，ESV)和舒張末期容積(end-diastolic volume，EDV)、每搏排血量 (stroke volume， SV)、心輸出量(cardiac output，CO)、射血分數(shù)(ejection fraction，EF)、每搏功(stroke work，SW)、動脈彈回性(arterial elasticity，AE)和心率(heart rate，HR)。心功能測定完成后，肝素抗凝，小鼠腹腔下腔靜脈取血，離心后分離血漿置-80 ℃低溫冰箱待測，心臟取出后分為3個部分，心尖部分提取mRNA，中間部分置于Carnoy′s液固定約6～8 h，進一步進行組織學檢查。

1.2.3 心臟組織蘇木素-伊紅(HE)染色及心肌細胞橫截面積的測量 心臟組織經(jīng)固定、脫水和石蠟包埋，切成4 μmol/L的切片，脫蠟后進行HE染色。每個心臟切片拍攝3～5張高倍鏡照片，選取核圓位于中央的心肌纖維橫截面約30個，測量面積，計算平均值。每個處理組檢測9例。

1.2.4 心臟組織細胞凋亡染色(TUNEL染色法) 取4 μmol/L心肌組織石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蛋白酶K孵育后按照試劑說明書進行TUNEL染色，4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽 (4′,6-diamidino-2-phenylindole， DAPI)負染細胞核，呈藍色。熒光顯微鏡下照相，染為紅色的細胞核即指示凋亡的心肌細胞。選取至少5個非重疊的400倍高倍鏡視野，計數(shù)凋亡心肌細胞數(shù)量和視野里的心肌細胞總數(shù)，心肌細胞凋亡率=凋亡心肌細胞數(shù)量/心肌細胞總數(shù)×100%。

1.2.5 心臟組織纖維化染色(Masson染色) 取4 μmol/L心臟組織石蠟切片脫蠟至水，按照Masson染色試劑盒說明書，用麗春紅酸性品紅染液染色，磷鉬酸水溶液分化，苯胺藍染色后再用磷鉬酸水溶液分化，最后二甲苯透明、封片。取不同處理組心臟的同一部位進行普通光鏡鏡檢，400倍高倍鏡下照相，利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算染成藍色的膠原纖維面積占整個心肌組織面積的百分率。

1.2.6 心臟組織IMD的免疫組織化學染色 取4 μmol/L心臟組織石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常兔血清封閉，然后與IMD抗血清共孵育。二抗處理后進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。棕黃色為IMD免疫化學陽性染色。光鏡下選取至少5個非重疊的400倍高倍鏡視野照相。利用Image J圖像分析軟件檢測心肌組織IMD陽性染色的灰度值。

1.2.7 Real-time PCR檢測心臟心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)、內(nèi)源性IMD及其受體的mRNA表達 TRIZOL試劑盒提取心臟組織的總RNA，用逆轉錄酶和通用引物 oligo (dT),以 RNA 為模板反轉錄合成 cDNA 的第1鏈。再以 cDNA 為模板，參照試劑盒說明書利用不同目的基因的引物(表1)進行Real-time PCR實驗。PCR反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。采集熒光信號，制作融解曲線。目的基因的相對表達率(RQ)采用△△Ct計算方法，即RQ=2-△△Ct。

2 結 果

2.1IMD處理對小鼠大體狀況的影響ISO組與對照組相比較，活動減少，毛發(fā)凌亂無光澤，心質(zhì)量/體質(zhì)量顯著增加(P<0.01)；IMD-ISO組與ISO組相比較，小鼠的活動明顯增加，毛發(fā)有光澤，心質(zhì)量/體質(zhì)量顯著降低(P<0.01)，見圖1。ISO組與對照組比較，心臟肥大標志物ANP和BNP的mRNA水平也顯著增加(P<0.01)。IMD-ISO組與ISO組比較，ANP和BNP的mRNA水平也顯著降低(P<0.05)，見圖2。

表1 Real-time PCR擴增所用的引物序列

圖1 對照組、ISO組和IMD-ISO組小鼠心質(zhì)量/體質(zhì)量比值

圖2 小鼠心臟組織ANP和BNP基因的mRNA表達與GAPDH基因mRNA表達的比值柱狀圖

2.2IMD處理對小鼠心肌細胞橫截面的影響 心臟組織經(jīng)固定后切片，HE染色后測量心肌纖維橫截面積。與對照組小鼠心臟相比較，ISO組小鼠的心臟橫截面積顯著增加93.0%(P<0.01)。與ISO組相比較，IMD-ISO組小鼠的心臟橫截面積顯著減小23.0%(P<0.01)，見圖3。

2.3IMD處理對小鼠心肌細胞凋亡的影響 心臟組織切片經(jīng)TUNEL染色，評價心肌細胞凋亡的情況。與對照組小鼠相比較，ISO組小鼠心臟的凋亡指數(shù)顯著增加9.4倍(P<0.01)。IMD-ISO組小鼠的心肌細胞凋亡指數(shù)比ISO組顯著減少40.0%(P<0.05)，見圖4。

2.4IMD處理對小鼠心臟組織纖維化的影響 心臟組織切片經(jīng)Masson染色評價纖維化情況，纖維組織呈藍色染色。ISO組小鼠心臟的纖維化與對照組比較明顯增加，纖維化率增加13.1倍(P<0.01)。IMD-ISO組小鼠的心臟纖維化程度明顯低于ISO組，顯著減少44.6%(P<0.05)，見圖5。

A：心臟冠狀面切片HE染色的代表性圖片(×400)，紅色為胞質(zhì)，藍色為胞核；B：ImageJ軟件評價心肌細胞橫截面的柱狀圖。

圖3 小鼠心臟組織HE染色

2.5IMD處理對小鼠心臟功能的影響 用PVLOOP評價心臟的功能，觀察到與對照組相比較，ISO組小鼠的心臟功能出現(xiàn)明顯的障礙，LVP、dP/dtmax、dp/dtmin、SV、CO和EF值明顯降低，而LVEDP顯著增加(表2)。與ISO組相比較，腹腔注射IMD干預后，IMD-ISO組小鼠的心臟功能明顯改善，LVP、dP/dtmax、dp/dtmin、SV、CO和EF明顯增加，而LVEDP顯著降低，見表2。

2.6ISO處理誘導心臟組織內(nèi)源性IMD及其受體的表達上調(diào) 與對照組小鼠相比較，ISO組小鼠心臟組織的IMD及RAMP3mRNA水平分別顯著上調(diào)28.0倍和11.4倍(P<0.01)；CRLR和RAMP1mRNA表達水平分別上調(diào)46.6%和131.6%(P<0.05)；而RAMP2mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

A：心臟冠狀面切片TUNEL染色的代表性圖片(×400),紅色為TUNEL陽性凋亡胞核，藍色為胞核;B：心肌細胞凋亡率柱狀圖。

圖4 心臟組織心肌細胞凋亡檢測

2.7ISO處理誘導心臟組織內(nèi)源性IMD的蛋白表達上調(diào) 用IMD抗血清檢測IMD蛋白在心臟組織的蛋白表達，觀察到ISO組小鼠心臟的內(nèi)源性IMD表達明顯強于對照組 (P<0.01)，見圖7。

A：心臟冠狀面切片Masson染色的代表性圖片(×400)，藍色為纖維化組織，紅色為細胞質(zhì)，黑色為細胞核；B：ImageProplus6.0圖像分析軟件計算膠原纖維面積占整個心肌組織面積的百分率柱狀圖。

圖5 小鼠心臟組織的纖維化表2 ISO造模后1周用PV-LOOP檢測C57小鼠心功能指標

a：P<0.05,b：P<0.01，與對照組比較；c：P<0.05,d：P<0.01，與ISO組比較。

圖6 小鼠心臟組織IMD及其受體系統(tǒng)基因的mRNA表達與GAPDH基因mRNA表達的比值柱狀圖

A：IMD抗血清免疫組化染色代表性圖(×400)，棕褐色為心肌組織的IMD陽性染色，深藍色點為胞核；B：IMD陽性染色的光密度值柱狀圖。

圖7 內(nèi)源性IMD蛋白在心臟中的表達

3 討 論

CGRP家族與心臟肥大疾病有密切的關系[5,7-8]。Tsuruda等[10]報道該家族的另一個成員腎上腺素質(zhì)素具有拮抗心肌肥大的作用。IMD與ADM的基因核苷酸和多肽氨基酸序列具有較高的同源性[9]，近來在主動脈弓縮窄的小鼠[11]和腹主動脈縮窄的大鼠[12]心臟肥大模型中被證實具有拮抗壓力過載誘導的心肌肥大的作用[7]。

本研究采用背部皮下注射小劑量ISO激動心肌腎上腺素β1受體，模擬交感神經(jīng)興奮導致的心肌肥大病變，觀察到ISO處理后，小鼠的心質(zhì)量/體質(zhì)量比和心肌細胞橫截面積明顯增加，心肌的肥大標志物ANP和BNP的mRNA表達水平上調(diào)，提示成功建立了心臟肥大模型。ISO誘導心臟發(fā)生肥大的同時，會促進大量心肌細胞發(fā)生凋亡，并刺激成纖維細胞等間質(zhì)細胞增殖，造成纖維化病變[13-14]。進一步利用心臟組織切片進行染色，觀察到ISO處理誘導心肌細胞凋亡和心肌組織纖維化均明顯增加。另外，檢測小鼠的心功能，發(fā)現(xiàn)ISO處理明顯損傷小鼠的心功能，特別是收縮功能發(fā)生明顯障礙，射血相關參數(shù)均顯著降低。

IMD分散表達于正常心臟和血管，尤其是內(nèi)皮細胞[7-9]，其作用為擴張血管、調(diào)節(jié)局部血流、增強心肌收縮力[7-8]。近期報道IMD及其受體水平在充血性心力衰竭、高血壓、慢性缺氧性肺動脈高壓及長期抑制一氧化氮合酶等情況下會增加[7]。IMD肽在病理狀態(tài)的上調(diào)提示IMD可能是對抗器官損傷起重要保護作用的內(nèi)源性自/旁分泌因子[7,8,15]。本研究采用腹腔注射IMD的方式治療ISO誘導的小鼠心臟肥大病變，觀察到與ISO組相比較，IMD治療后小鼠的心質(zhì)量/體質(zhì)量比和心肌細胞橫截面積均明顯降低，心肌肥大標志物ANP和BNP的mRNA表達水平下降，心肌細胞凋亡和心臟纖維化病變均明顯改善，表明IMD具有很強的心肌細胞保護作用，可有效拮抗心臟肥大和纖維化。此外，IMD治療還明顯改善ISO誘導的左心室收縮功能障礙，射血相關參數(shù)均明顯增加，提示IMD還具有保護心臟功能的作用。

IMD與ADM分享同一家族受體復合物，由CRLR分別與3種RAMPs之一結合組成[7-9]。RAMPs作為CRLR運輸?shù)陌閭H蛋白，在不同類型細胞中與CRLR共同表達時表現(xiàn)出與CRLR不同程度的親和力[9,16]。有研究認為，IMD與CRLR/RAMP1和CRLR/RAMP3受體復合物的親和力較強，而與CRLR/RAMP2受體復合物的親和力較弱[9]，故IMD被認為是CRLR/RAMP1和CRLR/RAMP3受體復合物的特異性激動劑[9,16]。IMD可通過蛋白激酶C和蛋白激酶A依賴的機制迅速增強心肌細胞收縮力[7-8]，通過cGMP依賴的途徑舒張大鼠肺動脈環(huán)[7]。本研究檢測了心臟內(nèi)源性IMD及其受體系統(tǒng)的mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平，觀察到ISO明顯刺激心臟組織的內(nèi)源性IMD的轉錄和蛋白表達，顯著增加CRLR、RAMP1和RAMP3的mRNA表達水平，但不影響RAMP2的轉錄。這些結果表明，ISO誘導的內(nèi)源性IMD及其受體復合物CRLR/RAMP1和CRLR/RAMP3的表達增加，可能是心臟發(fā)生肥大病變時活化內(nèi)源性保護通路的代償性適應反應之一，進而增強內(nèi)源性IMD及其受體介導的信號轉導。此外，ISO刺激上調(diào)IMD的受體復合物后，外源性給予的IMD也可以通過活化的受體復合物增強其拮抗心臟肥大和心肌細胞損傷的作用。

本研究結果表明心臟肥大刺激因素ISO上調(diào)內(nèi)源性保護因子IMD及其受體系統(tǒng)的表達，外源性給予的IMD也可能通過受ISO刺激所活化的IMD受體系統(tǒng)，實現(xiàn)其抑制心肌細胞肥大、心肌纖維化和凋亡、改善心功能的藥理作用。

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Study on protective effects of mouse intermedin against isoproterenol induced cardiomegaly*

ZengHui1,2,WuDan2,WangXue2,ChenHuali2,FuRong1,JiangWei2△

(1.DepartmentofInfectiousDiseases,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610071,China;2.MolecularMedicineResearchCenter,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China)

Objective To investigate the pharmacological effect and mechanism of mouse intermedin (IMD) for antagonizing cardiac hypertrophy by using isoproterenol (ISO) induced mouse cardiomegaly model.Methods The mouse cardiomegaly model was constructed by small dose of ISO subcutaneous injection.The mouse blood dynamic indexes and heart weight /body weight ratio were investigated.Then the cardiomyocyte cross-sectional area,apoptosis and cardiac tissue fibrosis were evaluated by using the cardiac tissue section.ANP,BNP,mRNA expression levels of endogenous IMD and its receptors system in cardiac tissues were detected by using real time fluorescence PCR method.Results Compared with the ISO induced mouse cardomegaly model group,the intraperitoneal injection of IMD significantly decreased the heart weight/ body weight ratio and cardiomyocyte cross-sectional area increased by ISO treatment,cardiomegaly marker ANP and BNP mRNA level,cardiomyocyte apoptosis and cardiomyocyte fibrosis,improved the cardiac function,left ventricular pressure,maximal and minimal rate of LV pressure increase and decrease during the isovolumetric contraction phase,stroke volume,cardiac output and ejection fraction,but significantly decreased the left ventricle end-diastolic pressure.In addition,the ISO treatment significantly induced the expressions of endogenous IMD and its receptors in heart tissues.Conclusion ISO induces the expressions of endogenous IMD and its receptors in cardiac tissues,and exogenous IMD supplementation therapy realizes the pharmacological protective effect for antagonizing cardiomegaly by ISO activated IMD receptor system.

isoproterenol；cardiomegaly；pituitary gland;intermedin；intermedin receptor system

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.003

國家自然科學基金面上項目(31071001，31271226)。

曾慧(1977-)，主管護師，本科，主要從事心血管藥理學及護理管理方面研究?！?/p>

R963

A

1671-8348(2017)01-0024-05

2016-07-18

2016-09-06)