（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科暨器官移植科，沈陽 110001）

高爾基體磷蛋白3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其臨床病理學(xué)意義

張城碩，陳保民，焦奧，孫寧，張佳林

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科暨器官移植科，沈陽 110001）

目的 探討高爾基體磷蛋白3（GOLPH3）在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其臨床病理學(xué)意義。方法 采用免疫組織化學(xué)方法檢測132例肝細(xì)胞癌與配對的癌旁組織中GOLPH3蛋白的表達(dá)情況，分析肝細(xì)胞癌組織中GOLPH3表達(dá)水平與患者組織病理學(xué)特征的關(guān)系。利用激光共聚焦顯微鏡檢測GOLPH3蛋白在肝細(xì)胞癌細(xì)胞的亞細(xì)胞定位。結(jié)果 GOLPH3在肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率為70.0%（92/132），在癌旁組織中為42.4%（56/132），GOLPH3在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其癌旁組織（P＜0.001）。肝細(xì)胞癌組織中，GOLPH3高表達(dá)組門靜脈癌栓的發(fā)生率為21.2%（14/66），而GOLPH3低表達(dá)組為6.1%（4/ 66），GOLPH3高表達(dá)組門靜脈癌栓的發(fā)生率明顯高于GOLPH3低表達(dá)組（P＜0.05）。激光共聚焦免疫熒光結(jié)果顯示GOLPH3主要存在于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且在細(xì)胞核內(nèi)存在散在性分布。結(jié)論 GOLPH3可作為一種癌基因在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

肝細(xì)胞癌；高爾基體鱗蛋白3；免疫組化；免疫熒光

原發(fā)性肝癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2015年我國肝癌新發(fā)病例估計為46.6萬人，發(fā)病例數(shù)位居全部惡性腫瘤第4位；全年死亡病例估計為42.2萬人，死亡例數(shù)位居全部惡性腫瘤第3位［1］。在原發(fā)性肝癌中，超過90%為肝細(xì)胞癌，手術(shù)切除和肝臟移植是早期肝細(xì)胞癌的主要治療手段，然而進(jìn)展期患者卻常常失去手術(shù)機(jī)會［2］。因此，不斷深入研究并發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌重要的分子標(biāo)志物及關(guān)鍵生物治療靶點(diǎn)，對于提高肝細(xì)胞癌的療效具有重要臨床意義。高爾基體磷蛋白3（Golgi phos?phoprotein 3，GOLPH3）是近年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)蛋白，其定位于人染色體5p13。研究［3?4］表明，GOLPH3通過參與細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、受體再循環(huán)以及糖基化等多種功能影響腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)，其被陸續(xù)證實(shí)在腎癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、舌癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌及橫紋肌肉瘤等多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)［5］，但是GOLPH3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及分布情況尚不十分清楚。因此，本研究擬探討GOLPH3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其臨床病理學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2008年6月至2013年9月在我院接受手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的132例肝細(xì)胞癌及其癌旁組織石蠟標(biāo)本。所有患者均有完整臨床資料，且術(shù)前均未接受過放化療或消融治療，其中男性96例，女性36例；年齡32～79歲，平均（45.04±6.52）歲；患者隨訪時間3～77個月，平均33個月。肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh?7、Bel?7402及MHCC?97H購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，制作3 μm連續(xù)切片。采用免疫組化SP法檢測組織中GOLPH3的表達(dá)，SP與DAB試劑盒購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司，兔抗人GOLPH3多克隆抗體購自美國ABGEN公司。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。陰性對照以PBS代替一抗，用已知陽性標(biāo)本作為陽性對照。每份標(biāo)本常規(guī)HE染色，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞分化程度判斷。

1.2.2 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：GOLPH3蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，根據(jù)5個視野的陽性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)計分。0分，無陽性細(xì)胞；1分，陽性細(xì)胞＜10%；2分，陽性細(xì)胞10%～＜50%；3分，陽性細(xì)胞≥50%；染色強(qiáng)度：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕色3分。染色指數(shù)為上述兩項(xiàng)相乘，所有樣本的中位染色指數(shù)為GOLPH3表達(dá)高低的分級標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 免疫熒光法檢測：3株肝細(xì)胞癌細(xì)胞接種至載有蓋玻片的12孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁展開，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，0.2%Triton X?100室溫下孵育25 min，隨后5%BSA室溫封閉1 h，GOLPH3一抗（1∶100）4℃孵育過夜后，熒光二抗室溫避光孵育2 h，DAPI染核（1∶1 000）室溫避光孵育10 min后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，熒光二抗購自艾美捷科技有限公司，DAPI購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，激光共聚焦顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GOLPH3在肝細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，GOLPH3主要表達(dá)于組織細(xì)胞質(zhì)中，呈棕色至深棕色表達(dá)。見圖1。GOLPH3在肝細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率為70.0%（92/132），而在其對應(yīng)癌旁組織中陽性表達(dá)率為42.4%（56/132），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 GOLPH3在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與組織病理學(xué)特征的關(guān)系

圖1 免疫組化法檢測GOLPH3在肝細(xì)胞癌組織和對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況 ×400Fig.1 GOLPH3 immunostaining in HCC and pericarcinoma tissues×400

在肝細(xì)胞癌組織中，GOLPH3表達(dá)水平與門靜脈癌栓發(fā)生率呈正相關(guān)（χ2=6.433，P=0.020），見表1。

2.3 肝細(xì)胞癌細(xì)胞中GOLPH3的亞細(xì)胞定位

免疫熒光結(jié)果顯示，在3株肝細(xì)胞癌細(xì)胞中，GOLPH3均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，且在細(xì)胞核中存在散在性分布（圖2）。

3 討論

GOLPH3也被稱為GMx33、GPP34、MIDAS或酵母Vps74p，是通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的位于反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的蛋白。GOLPH3的核苷酸序列從酵母到人類均高度保守，編碼大小為34 000的蛋白質(zhì)。雖然其主要位于反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（胞質(zhì)面），但其在胞質(zhì)、胞核及質(zhì)膜也均存在表達(dá)。有研究［6］報道GOLPH3通過與磷脂酰肌醇4磷酸、MYO18A和纖維型肌動蛋白結(jié)合，在蛋白質(zhì)分選等高爾基體功能中發(fā)揮作用。本研究通過免疫組化和免疫熒光等技術(shù)發(fā)現(xiàn)GOLPH3主要表達(dá)于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且在細(xì)胞核中存在散在性分布，說明GOLPH3可能發(fā)揮類似于轉(zhuǎn)錄因子的功能，進(jìn)而參與某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

表1 GOLPH3表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌組織病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between GOLPH3 expression and clinicopathological characteristics of hepatocellular carcinoma

近年來，研究［3］發(fā)現(xiàn)GOLPH3所在染色體5p13在腫瘤組織中頻繁擴(kuò)增，因此被確定為第一類高爾基體腫瘤蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)GOLPH3在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于其配對癌旁組織，且肝細(xì)胞癌組織中GOLPH3的表達(dá)水平與門靜脈癌栓的發(fā)生率呈正相關(guān)，說明GOLPH3可能作為一個癌基因在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有關(guān)GOLPH3的調(diào)控機(jī)制涉及較廣，有研究［7］報道GOLPH3通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapa? mycin，mTOR）信號通路調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其通過整合通路上游多種信號來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與存活。ZHANG等［8］報道下調(diào)GOLPH3可以抑制mTOR活性及YB1的表達(dá)，也有研究［9］發(fā)現(xiàn)GOLPH3可通過抑制FOXO1轉(zhuǎn)錄并激活A(yù)KT信號通路來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與腫瘤發(fā)生。GOLPH3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可影響RhoA表達(dá)及細(xì)胞遷移［10］。此外，ISAJI等［11］也發(fā)現(xiàn)GOLPH3可通過唾液酸化過程進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。鑒于GOLPH3可通過多種分子機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，其在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用有待進(jìn)一步深入研究。

圖2 共聚焦顯微鏡檢測GOLPH3在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位 ×400Fig.2 Subcellular localization of GOLPH3 in HCC cells by laser confocal microscope×400

有研究［12］發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中GOLPH3高表達(dá)可以提高以5?氟尿嘧啶為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后效果，增加結(jié)直腸癌細(xì)胞中GOLPH3的表達(dá)也可以提高腫瘤細(xì)胞對5?氟尿嘧啶化療藥物的敏感性。但值得注意的是，很多研究發(fā)現(xiàn)沉默GOLPH3可以提高細(xì)胞對化療藥物的敏感性：沉默口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞GOLPH3表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)caspase?3、Bcl?2和細(xì)胞色素C的表達(dá)來提高化療效果［13］。在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中沉默GOLPH3表達(dá)，也可以增加順鉑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)致DNA損傷因素可引起高爾基體重組，使高爾基體在胞質(zhì)中彌散分布，而GOLPH3/MYO18A/纖維型肌動蛋白參與這種高爾基體核周彌散，抑制DNA損傷等化療藥物對細(xì)胞的損傷，但GOLPH3調(diào)控腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的具體機(jī)制尚不清楚。

mTOR復(fù)合物包括2個不同的組成部分：mTOR受體復(fù)合物（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）1和mTORC2。雷帕霉素敏感型mTORC1可激活下游核糖體蛋白S6激酶和真核生物翻譯啟動因子4E結(jié)合蛋白1，從而促進(jìn)帽樣結(jié)構(gòu)依賴的蛋白質(zhì)翻譯過程［14］。但雷帕霉素不敏感型mTORC2可促進(jìn)AKT在Thr308位點(diǎn)的磷酸化，從而使AKT的活力最大化［15］。AKT的高度活化會促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖及存活，同時抑制細(xì)胞的凋亡［16］。需要注意的是，mTORCl抑制后會通過核糖體蛋白S6激酶和胰島素受體底物1負(fù)反饋調(diào)節(jié)，激活mTORC2信號通路，進(jìn)而弱化了mTORCl的抗腫瘤效應(yīng)［17］。由此可見，mTORC1與mTORC2在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮截然相反的生物學(xué)效應(yīng)。因此，GOLPH3可能在不同的細(xì)胞中與mTORC1/mTORC2結(jié)合的比例不同，進(jìn)而對化療藥物敏感性產(chǎn)生上述不同的影響。但該假設(shè)尚需進(jìn)行進(jìn)一步相關(guān)研究予以證實(shí)。

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（編輯 陳 姜）

Expression of Golgi Phosphoprotein 3 in Human Hepatocellular Carcinoma and Its Clinicopathological Significance

ZHANG Chengshuo，CHEN Baomin，JIAO Ao，SUN Ning，ZHANG Jialin
（Department of Hepatobiliary Surgery and Unit of Organ Transplantation，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the expression characteristics of Golgi phosphoprotein 3（GOLPH3）in human hepatocellular carcinoma（HCC）and explore its clinicopathological significance.Methods The expressions of GOLPH3 protein was detected in 132 cases of paired paraf?fin embedded HCC specimens and pericarcinoma tissues using immunohistochemical staining，and the relation of the expression of GOLPH3 to clinicopathologic features was analyzed.Meanwhile，the expression and distribution of GOLPH3 in HCC cells was observed by laser confocal mi?croscopy.Results The positive expression rates of GOLPH3 in HCC and pericarcinoma tissues were 70.0%（92/132）and 42.4%（56/132）（P＜0.001），respectively.The incidence of portal vein tumor thrombus in high and low GOLPH3 expression groups of HCC were 21.2%（14/66）and 6.1%（4/66）（P＜0.05），respectively.The expression rate of GOLPH3 in HCC was significantly higher than that in pericarcinoma tissues，and the expression of GOLPH3 in HCC was positively related to portal vein tumor thrombus.In addition，GOLPH3 was mainly expressed in cyto?plasm of HCC cells，and there was also scattered distribution in the nucleus.Conclusion GOLPH3acts as an oncogene and may play vital roles in the carcinogenesis and development of HCC.

hepatocellular carcinoma；Golgi phosphoprotein 3；immunohistochemistry；immunofluorescence

R735.7

A

0258-4646（2017）03-0214-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.006

遼寧省自然科學(xué)基金（201602874）

張城碩（1987-），男，講師，博士.

張佳林，E-mail：jlzhang@cmu.edu.cn

2016-09-26

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