劉月慶, 樊 星, 周 夏, 錢 金, 楊文慶, 楊 靜, 樊 東*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2. 東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030)

甘藍夜蛾CYP9A90基因的克隆及
溴氰菊酯對其誘導表達

劉月慶1, 樊 星2, 周 夏1, 錢 金1, 楊文慶1, 楊 靜1, 樊 東1*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2. 東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030)

P450CYP9A家族基因與昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性相關。為證實溴氰菊酯對甘藍夜蛾CYP9A基因的誘導效果,本研究采用RT-PCR和RACE技術克隆獲得甘藍夜蛾CYP9A基因,real-time PCR檢測該基因在甘藍夜蛾不同組織中的表達差異及溴氰菊酯處理甘藍夜蛾5齡幼蟲不同時間后該基因相對表達量變化,研究結果可為甘藍夜蛾對溴氰菊酯的抗性治理提供依據(jù)。結果表明:克隆得到甘藍夜蛾CYP9A基因cDNA全長序列,該序列包含1 828 bp,包括1個125 bp的5′非編碼區(qū),1個104 bp的3′非編碼區(qū)和1個1 599 bp的開放閱讀框,編碼532個氨基酸,分子量約為61.1 kDa,等電點為8.84,GenBank登錄號為KR676343,被國際P450命名委員會命名為CYP9A90。Real-time PCR分析結果表明,該基因在甘藍夜蛾5齡幼蟲6個組織中表達情況不同,其中在脂肪體中表達量最高。低劑量溴氰菊酯作用后不同時間點CYP9A90 mRNA總體呈現(xiàn)誘導表達趨勢。

甘藍夜蛾; P450; 基因克隆; 溴氰菊酯; 表達

細胞色素P450多功能氧化酶系(cytochrome P450 enzymes,P450s)在昆蟲體內主要分布于中腸、脂肪體和馬氏管等組織中[1],可代謝殺蟲劑等多種內源及外源性化合物[2-3],以及多種激素及信息素[4-5]。一般認為,其對殺蟲劑的代謝(解毒或活化)關系到昆蟲對殺蟲劑的耐受性和殺蟲劑對昆蟲的選擇性,P450 介導的殺蟲劑代謝解毒作用的增強是昆蟲產(chǎn)生抗藥性常見而重要的機制[4]。已有研究表明,對二氯苯醚菊酯產(chǎn)生抗性的致倦庫蚊CulexquinquefasciatusCYP9M10基因的mRNA表達為敏感體系的264倍[6],小菜蛾對二氯苯醚菊酯抗性品系中CYP6BG1基因表達是敏感品系的4.9倍[7]。P450的可誘導性表現(xiàn)為昆蟲暴露于藥劑或其他異源物質環(huán)境下,其體內某一種或幾種細胞色素P450的水平會顯著上升,使得解毒作用顯著增強[8]。其誘導作用增強了昆蟲的解毒作用,提高了昆蟲對環(huán)境有毒物質的適應能力,因此昆蟲抗藥性產(chǎn)生通常表現(xiàn)為P450酶活性的增強和其表達量的上升[4]。用氯氰菊酯誘導野桑蠶Bombyxmandarina時,CYP9A21基因在中腸的表達量是對照的2.1倍,導致野桑蠶對氯氰菊酯氧化解毒代謝作用的增加[9]。用氯蟲苯甲酰胺誘導甜菜夜蛾,4個P450基因CYP9A9、CYP4G37、CYP4S11及CYP6B的表達明顯上調[10]。溴氰菊酯可以顯著增強褐飛虱體內CYP303A1的表達[11]。

甘藍夜蛾MamestrabrassicaeLinnaeus,又名甘藍夜盜蟲、夜盜蛾等,屬于鱗翅目夜蛾科,盜夜蛾亞科,為世界性分布害蟲[12]。不僅為害甘藍、白菜、卷心菜等十字花科蔬菜,還是瓜類、豆類、茄果類、甜菜的重要害蟲[13]。目前對于甘藍夜蛾的主要防治手段是化學防治,主要藥劑包括高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯和溴氰菊酯。目前國內外一些文章報道了P450對殺蟲劑的代謝解毒機制,研究多在 CYP4 家族、CYP6 家族和 CYP9 家族三個與抗藥性相關的家族中[14],且Yang等通過試驗證實發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲中CYP9A家族與氰戊菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯抗性有關[15-17],煙芽夜蛾中與硫代滅多威和氯氰菊酯抗藥性相關的基因為CYP9A1[18-19],家蠶當中的CYP9A22與野桑蠶中的CYP9A21均能被氯氰菊酯誘導[9,20]。因此,本研究對甘藍夜蛾CYP9A型基因的cDNA序列進行克隆,將其命名為CYP9A90;并通過熒光定量PCR技術檢測該基因在各組織中的表達以及經(jīng)溴氰菊酯誘導后的表達,為開展甘藍夜蛾細胞色素P450基因的功能分析提供基礎,同時也為P450酶系的抗性機理研究及甘藍夜蛾抗性治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

在東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗基地黑光燈下誘集甘藍夜蛾成蟲,將其放入恒溫培養(yǎng)箱內進行飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光周期L∥D=14 h∥10 h,相對濕度70%,以5%蜂蜜水飼喂,待其產(chǎn)卵,幼蟲取食未接觸任何農(nóng)藥的白菜葉,飼養(yǎng)2代后再用作試驗材料。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒TRIzolReagent購自Invitrogen公司;反轉錄酶M-MLV、低熔點瓊脂糖購自Fermentas(FBI)公司;DNA 膠回收試劑盒、克隆載體 pMD18-T、DL2000 DNA Marker、3′RACE試劑盒、5′RACE試劑盒、TapDNA聚合酶購自大連寶生物公司;感受態(tài)細胞Trans5α購自北京全式金生物技術公司、限制性內切酶購自NEB公司、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購自TOYOBO公司;大腸桿菌DH5α(本實驗室保存),其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。基因測序由上海生工生物有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取與第一鏈cDNA的合成

選取發(fā)育良好的甘藍夜蛾5齡第1天幼蟲為試驗材料,提取方法根據(jù)TRIzol試劑盒使用說明進行,提取得到的RNA為模板,以dt-Adapter(表1)為cDNA合成引物,根據(jù)M-MLV反轉錄酶使用說明進行,合成第一鏈cDNA。

1.3.2 cDNA全長序列克隆及序列分析

根據(jù)已登錄GenBank的棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(AY371318)CYP9A12和野桑蠶B.mandarina(EF535806)CYP9A22兩種昆蟲CYP9A基因的全序列設計甘藍夜蛾CYP9A基因特異片段的簡并引物Mb9-F和Mb9-R(表1)。以合成的cDNA為模板,以Mb9-F和Mb9-R為引物擴增甘藍夜蛾CYP9AcDNA序列片段。PCR程序如下:95℃預變性5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min 。經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物后回收目的片段,進行純化后再克隆到pEasy-T1載體上,轉化至感受態(tài)細胞DH5α中,氨芐篩選,挑斑活化,鑒定后選擇陽性克隆菌斑送上海生工生物有限公司進行測序。按照得到的基因片段及試劑盒要求設計RACE嵌套引物Mb9-3′RACE-Ro,Mb9-3′RACE-Ri,Mb9-5′RACE-Ro,Mb9-5′RACE-Ri(表1),根據(jù)5′ Full RACE Kit說明進行5′ RACE擴增,根據(jù)3′ Full RACE Kit說明進行3′ RACE擴增。檢測RACE產(chǎn)物并進行純化、測序,測序結果拼接。利用Blastx進行相似性比對,DNAMAN翻譯開放閱讀框,氨基酸序列的分子量、等電點和信號肽等利用ExPASy在線網(wǎng)站(http:∥us.expasy.o-rg/tools/dna.html)推導獲得。

1.3.3 不同組織表達分析

在RNA保存液中快速解剖5齡幼蟲20頭,獲得前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體和唾腺等6種組織。共設3個生物學重復。cDNA模板的制備同1.3.1。

根據(jù)CYP9A90基因全長序列,設計熒光定量PCR引物CYP9A-q-F和CYP9A-q-R。利用β-actin作為內參基因,設計引物β-actin-F和β-actin-R(表1)。實時熒光定量PCR按照qPCR Mix(Code:QPS-201)熒光定量試劑盒(TOYOBO)說明書的要求進行操作。PCR反應條件為:預變性95℃ 5 min, 變性95℃ 10 s,退火60℃ 12 s,延伸72℃ 20 s,40個反應循環(huán),最后以每1 s上升1℃的速度從60℃上升至95℃記錄熔解曲線。采用2-ΔΔCt法進行PCR相對定量分析。數(shù)據(jù)的多重比較利用SAS9.4軟件來進行,數(shù)值均以平均值±SE進行表示,差異顯著性分析應用HSD檢驗法進行檢測,P< 0.01。

1.3.4 溴氰菊酯對CYP9A90基因的誘導表達分析

1.3.4.1 室內毒力測定

采用點滴法,用丙酮將2.5%溴氰菊酯水乳劑(拜耳作物科學(中國)有限公司)稀釋成5個不同的濃度,點滴0.5 μL藥液于甘藍夜蛾5齡幼蟲第2、3腹節(jié)之間,每個處理20頭,3個重復,以丙酮作對照。點滴后的甘藍夜蛾幼蟲放在室溫條件下飼養(yǎng),24 h后計算死亡率。采用SAS軟件對藥劑使用劑量和昆蟲死亡率之間進行回歸分析。計算出5齡甘藍夜蛾幼蟲對溴氰菊酯的LD10、LD30和LD50。

圖1 甘藍夜蛾CYP9A90 cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig.1 CYP9A90 cDNA and the deduced amino acid sequence from Mamestra brassicae

1.3.4.2 溴氰菊酯對甘藍夜蛾CYP9A90基因的誘導表達

分別點滴0.5 μL LD10、LD30和LD50濃度的溴氰菊酯于甘藍夜蛾5齡幼蟲第2、3腹節(jié)之間,每處理120頭,3個重復,以丙酮作對照,室溫條件下飼養(yǎng),在點滴處理后3、6、12、24 和 48 h 分別從每個重復收集存活的幼蟲10頭并凍存于液氮中保存。依照1.3.1方法獲得cDNA第一鏈,-80℃冰箱中保存待用。采用real-time PCR方法分析甘藍夜蛾CYP9A90基因相對表達量。反應體系及條件參見1.3.3。

表1 本研究所用引物

Tabel 1 The primers used in this study

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5'-3')dt-AdapterGACTCGAGTCGACATCGA(T)17Mb9-FGGTCAAGAATGGAAAGACATGCGNTCMb9-RATGGAGTTGAAGTCGAACTTCCGCCGTMb9-3'RACE-RoCAGAGTTTGGACTGACACCGACCTCATTGCMb9-3'RACE-RiCAGGAGCGTCTGGGGCACGAGATCAAGMb9-5'RACE-RoCGCAGGAGGCTATCACGTCGTTAGMb9-5'RACE-RiCCGACCTCCACCATGAAAGGCACCATCAGACGCYP9A-q-FAAGATTTTATCGTCCGCAAAGGCYP9A-q-RGTCCAACACCGAAGGGCATβ-actin-FCCAACGGCATCCACGAGACCAβ-actin-RTCGGCGATACCAGGGTACAT

2 結果與分析

2.1 CYP9A90基因的獲得及序列分析

利用RT-PCR及RACE方法獲得甘藍夜蛾細胞色素P450基因1 828 bp的全長cDNA序列,包括1個125 bp的5′非編碼區(qū),1個104 bp的3′非編碼區(qū)和1個1 599 bp的開放閱讀框。編碼532個氨基酸。氨基酸序列中包括P450蛋白特征序列FxxGxRxCxG(血紅素結合區(qū))(圖2)。通過ExPaSy在線生物軟件獲得其氨基酸序列的分子量約為61.1 kDa,等電點為8.84。GenBank登錄號為KR676343,國際P450命名委員會命名為CYP9A90。

圖2 CYP9A90與其他昆蟲CYP9A 氨基酸序列多重比對Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences of CYP9A90 and other CYP9As

2.2 CYP9A90基因與鱗翅目其他種昆蟲CYP氨基酸序列比對

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取與甘藍夜蛾CYP9A90相似性高的其他昆蟲CYP9A氨基酸序列16條,利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對,結果發(fā)現(xiàn),甘藍夜蛾CYP9A90與其他昆蟲CYP9A亞家族的氨基酸序列同源性達70%以上,其中與甘藍夜蛾(AY390260)一致性最高,達86%,與棉鈴蟲(DQ003275)、美洲棉鈴蟲(DQ788839)、斜紋夜蛾(GQ465040)、甜菜夜蛾(AB381883)和草地貪夜蛾(KJ671577)的一致性分別為 79%、78%、72%、71%和 70%;這7種氨基酸序列均具有相似的螺旋C、螺旋K、氧結合區(qū)、血紅素結合區(qū)(圖2)。通過MEGA5.0軟件NJ法構建鱗翅目不同昆蟲的細胞色素P450系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖3)。結果表明,CYP9A90推導出的氨基酸序列與同種的CYP9A13(AY390260)關系最近,與鱗翅目夜蛾科棉鈴蟲(DQ003275)、美洲棉鈴蟲(DQ788839)親緣關系較近,與斜紋夜蛾(GQ465040)、甜菜夜蛾(AB381883)和草地貪夜蛾(KJ671577)關系稍遠;與家蠶(AB498807)、稻縱卷葉螟(KP001131)、蘋果蠹蛾(KC832920)等非夜蛾科昆蟲的親緣關系相對較遠。

圖3 昆蟲CYP9A基因推導氨基酸的系統(tǒng)進化樹構建Fig.3 Phylogenetic tree based on calculated amino acid sequences of CYP9A

2.3 CYP9A90基因在不同組織中的表達

通過real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)CYP9A90在甘藍夜蛾5齡幼蟲的6個不同組織內表達情況不同,其中在脂肪體中表達最高,其次是前腸、中腸和后腸,而在馬氏管和唾腺中沒有檢測到該基因的表達(圖4)。脂肪體中該基因表達量分別是中腸、前腸和后腸的4.48、6.54和98.1倍。

2.4 溴氰菊酯對CYP9A90基因的誘導表達分析

2.4.1 室內毒力測定

經(jīng)點滴法測定,溴氰菊酯對甘藍夜蛾5齡幼蟲的LD10、LD30和LD50分別為0.152(0.017～0.335)、0.448(0.146～0.792)和0.943(0.475～1.817)ng/g(表2)。

2.4.2 低劑量溴氰菊酯對CYP9A90基因表達量的影響

為了驗證溴氰菊酯對CYP9A90基因表達量的影響,通過實時熒光定量技術對溴氰菊酯LD10、LD30和LD50劑量處理甘藍夜蛾5齡幼蟲不同時間(3、6、12、24和48 h)后CYP9A90基因的表達狀況進行研究。LD30和LD50誘導效果不理想,與對照差異不顯著,數(shù)據(jù)在此沒有列出。圖5表示低劑量溴氰菊酯LD10作用后CYP9A90基因在一定時間范圍內,排除對照影響后,各時間點數(shù)值均為正值,表示該基因在各個時間點均被誘導,但誘導量存在差異。6、24和48 h表達量間差異不顯著,但這3個時間點與3 h和12 h時間點的表達量間存在顯著差異,分別是3 h和12 h的1.40、1.43、1.31倍和4.07、4.13、3.80倍。

表2 溴氰菊酯對甘藍夜蛾5齡幼蟲的毒力1)

Table 2 Toxicity of deltamethrin on fifth-instar larvae ofMamestrabrassicae

LD10(CI95)/ng·g-1LD30(CI95)/ng·g-1LD50(CI95)/ng·g-1毒力回歸方程Toxicityregressionequation相關系數(shù)rCorrelationcoefficient0.152(0.017～0.335)0.448(0.146～0.792)0.943(0.475～1.817)y=1.978x-0.0790.989

1) CI95: 95%的置信限。 CI95: 95% confidence interval.

圖4 CYP9A90在甘藍夜蛾不同組織中的表達Fig.4 Expression pattern of CYP9A90 in different tissues of Mamestra brassicae

圖5 溴氰菊酯點滴后不同時間點CYP9A90的表達量Fig.5 Expression of CYP9A90 treated by deltamethrin at different time points

3 討論

由于P450基因在昆蟲組織器官表達的差異性,使這些基因在昆蟲體內表現(xiàn)的功能也不盡相同[21]。王煒等發(fā)現(xiàn)致倦庫蚊CYP9J40基因在肌肉、消化道、卵巢、腦和胸部神經(jīng)節(jié)均有明顯表達,表明了該基因參與蚊蟲對殺蟲劑的抗性,并且對雌蟲發(fā)育有重要的影響[22]。鄭笑笑等發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾P450基因的分布也具有一定的特異性:主要分布在外源化合物進入體內所經(jīng)過的主要入口的一些組織中,這些組織是針對經(jīng)口、皮進入的外源化合物的第一道防線[23]。趙華強等發(fā)現(xiàn)家蠶CYP9A22的mRNA轉錄表達具有組織特異性,在中腸的表達量高于脂肪體[20]。CYP4D46基因在脂肪體中的相對表達量較高,說明CYP4D46可能與脂肪體的重要生理功能相關。本文研究的CYP9A90基因在5齡幼蟲脂肪體中有最高表達,這可能與脂肪體的功能密切相關。在昆蟲體內,脂肪體是最主要的代謝器官[24],因此推斷本文研究的CYP9A90基因可能參與內源和外源物質的代謝,也可能參與殺蟲劑的解毒作用。隨后的試驗將利用RNA干擾等技術探討該基因與殺蟲劑殺蟲活性的關系,達到利用分子手段降低或延緩昆蟲抗性甚至減少殺蟲劑的目的。

外源物質不同劑量和作用時間對P450均產(chǎn)生不同的誘導效應,當外源物質達到一定劑量并作用一定的時間后才會產(chǎn)生誘導作用[22]。溴氰菊酯是最重要的擬除蟲菊酯類殺蟲劑,其使用范圍很廣[25]。目前,越來越多的試驗證明很多昆蟲已對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性,而昆蟲體內P450的參與是產(chǎn)生抗性的主要原因[26]。Pottelberge等發(fā)現(xiàn)巴比妥、苯巴比妥和香葉醇對二斑葉螨P450s誘導作用表現(xiàn)出時間效應,在藥劑處理1～4 h內P450s酶活性迅速增加,而4～48 h內其活性達到最大[27]。王學貴等發(fā)現(xiàn)氯蟲苯甲酰胺誘導甜菜夜蛾,CYP9A9基因上調表達表現(xiàn)出時間效應,在12 h達到最大[10]。劉昌燕發(fā)現(xiàn)吡蟲啉誘導大草蛉P450基因上調表達表現(xiàn)出時間效應,在16 h達到最高峰[28]。在本研究中,CYP9A90基因被誘導表達,在3 h 時就開始出現(xiàn)誘導效應,至48 h時仍保持一定的誘導效應,總體情況下,各個時間點誘導表達量均為對照組的2倍左右,但在12 h出現(xiàn)誘導表達量明顯減少的現(xiàn)象,與對照表達量間差異不顯著。導致在該時間點排除對照影響后,其誘導表達量明顯低于其他各時間點的表達量,其原因可能是由于此時間節(jié)點昆蟲體內特殊生理過程導致該基因表達量明顯下降,其具體原因有待下一步試驗驗證。在低劑量(LD10)溴氰菊酯條件下CYP9A90基因被誘導表達;而在較高劑量LD30、LD50條件下,可能蟲體受到溴氰菊酯的影響較大,不能及時對刺激做出反應,所以CYP9A90并沒有表現(xiàn)出誘導作用(數(shù)據(jù)未列出)。因此,溴氰菊酯只能在一定的劑量范圍內對該基因發(fā)揮誘導作用,劑量過高反而無誘導效果。但不同昆蟲種類和不同CYP基因對溴氰菊酯的誘導可能存在不同的效應,東亞飛蝗Locustamigratoria的CYP409A1和CYP408B1均可被不同濃度(LD10、LD30和LD50)的溴氰菊酯所誘導[29],與本研究的CYP9A90只有在LD10劑量下被誘導存在一定區(qū)別。在棉鈴蟲的脂肪體中,只有低劑量溴氰菊酯誘導了CYP6AE14、CYP6B2、CYP6B6、CYP9A14的表達[30],與本研究結果有類似之處。

P450酶系是一個共同作用的代謝酶系,探究P450酶系中CYP基因的種類和功能將有助于更好地開展P450的系統(tǒng)研究工作。本試驗以對甘藍夜蛾P450基因家族的CYP9A90基因為切入點,克隆了1個新的CYP9A基因,研究了其在不同組織中的分布及表達量差異,明確了低劑量溴氰菊酯殺蟲劑對其誘導反應,研究結果豐富了甘藍夜蛾P450基因家族成員,為在甘藍夜蛾體內系統(tǒng)研究P450解毒作用,降低或延緩甘藍夜蛾抗藥性奠定基礎。

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(責任編輯：田 喆)

Cloning ofCYP9A90 and effects of deltamethrin on its mRNA expression inMamestrabrassicae

Liu Yueqing1, Fan Xing2, Zhou Xia1, Qian Jin1, Yang Wenqing1, Yang Jing1, Fan Dong1

(1.CollegeofAgriculture，NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China；2.CollegeofResourcesandEnvironment，NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

Genes inCYP9Asubfamily of P450 are associated with the resistance of insects to pyrethroids. In order to verify the induction effect of deltamethrin toCYP9AinMamestrabrassicae, RT-PCR and RACE were used to clone the full-length cDNA sequence ofCYP9Agene. Its mRNA expression profiles in different tissues at fifth-instar larvae and the effect of deltamethrin were detected by real-time PCR.The results would give us a basis for resolving the management problem of the resistance ofM.brassicaeto deltamethrin. The results showed that the cDNA sequence was 1 828 bp in length, which contained a 125 bp 5′-untranslated region, a 104 bp 3′ untranslated region and a 1 599 bp open reading frame, and coded a polypeptide of 532 amino acid residues with a predicted molecular weight of 61.1 kDa and pI 8.84 (GenBank accession no. KR676343). It was namedCYP9A90 by the P450 Nomenclature Committee. The real-time quantitative RT-PCR assay showed thatCYP9A90 gene expression levels were different in six tissues of the fifth-instar larvae. The expression level was at the highest point in fat body. Low dosage of deltamethrin treatment could induceCYP9A90 mRNA expression at different time points after treatment.

Mamestrabrassicae; cytochrome P450; cloning; deltamethrin; expression

2016-06-20

2016-07-21

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531045)

Q 785， S 436.35

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.009

* 通信作者 E-mail:dnfd@163.com