鄒麗秋　王彩霞　匡雪君　李瀅　孫超

[摘要] 黃酮類化合物是來源于植物的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多種藥理作用。黃酮類化合物的主要合成途徑已經(jīng)研究得比較清晰，即首先合成二氫黃酮類的柚皮素或松屬素，然后進(jìn)一步通過分支途徑合成黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷醇和花色素等。黃酮生物合成途徑的解析為其合成生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。利用合成生物學(xué)技術(shù)已成功在大腸桿菌或酵母中合成了黃酮類化合物，如柚皮素、松屬素和非瑟酮等。合成生物學(xué)研究為黃酮類化合物提供了新的來源，將進(jìn)一步推動(dòng)黃酮類藥物和保健品的研發(fā)，使其在人類飲食和健康等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

[關(guān)鍵詞] 黃酮類化合物； 合成途徑； 合成生物學(xué)

Advance in flavonoids biosynthetic pathway and synthetic biology

ZOU Liqiu1， WANG Caixia2， KUANG Xuejun1， LI Ying1， SUN Chao1*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking

Union Medical College， Beijing 100193， China；

2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Flavonoids are the valuable components in medicinal plants， which possess a variety of pharmacological activities， including antitumor， antioxidant and antiinflammatory activities. There is an unambiguous understanding about flavonoids biosynthetic pathway， that is，2Sflavanones including naringenin and pinocembrin are the skeleton of other flavonoids and they can transform to other flavonoids through branched metabolic pathway. Elucidation of the flavonoids biosynthetic pathway lays a solid foundation for their synthetic biology. A few flavonoids have been produced in Escherichia coli or yeast with synthetic biological technologies， such as naringenin， pinocembrin and fisetin. Synthetic biology will provide a new way to get valuable flavonoids and promote the research and development of flavonoid drugs and health products， making flavonoids play more important roles in human diet and health.

[Key words] flavonoids； biosynthetic pathway； synthetic biology

doi：10.4268/cjcmm20162207

黃酮類化合物（flavonoids）是植物特有的次生代謝產(chǎn)物，指2個(gè)苯環(huán)（A與B環(huán)）通過中央3個(gè)碳原子相互連接形成具有C6C3C6基本結(jié)構(gòu)的一系列化合物[1]，由于這類化合物大多呈黃色或淡黃色，因此稱為黃酮。目前已知的黃酮類化合物超過1萬種，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同可以分為二氫黃酮（2Hflavanones）、黃酮（flavones）、異黃酮（isoflavones）、黃酮醇（flavonols）、黃烷醇（flavanols）和花色素六大類（anthoyanidins）[2]。黃酮類化合物是多種藥用植物的主要有效成分，例如，黃芩中的黃芩苷和黃芩素為黃酮及黃酮醇類化合物，甘草中的甘草素和橙皮中的橙皮素為二氫黃酮類化合物，兒茶中的兒茶素為黃烷酮類化合物，葛根中的葛根素為異黃酮類化合物。在植物中黃酮大多與糖結(jié)合，以黃酮苷的形式存在，少部分以游離態(tài)存在?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃酮類化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等多種藥理活性，在藥品開發(fā)和食品保健領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[34]。

1 黃酮類化合物的合成途徑

黃酮類化合物的生物合成首先通過苯丙烷途徑將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為香豆酰CoA，香豆酰CoA再進(jìn)入黃酮合成途徑與3分子丙二酰CoA結(jié)合生成查爾酮，然后經(jīng)過分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)生成二氫黃酮類化合物[5]。二氫黃酮是其他黃酮類化合物的主要前體物質(zhì)，通過不同的分支合成途徑，可以分別生成黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷醇和花色素等（圖1）。

1.1 酚酰CoA的形成 酚酰CoA包括香豆酰CoA和肉桂酰CoA，是黃酮類化合物生物合成的起始物質(zhì)。L苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下能生成反式肉桂酸，反式肉桂酸然后在肉桂酸4羥化酶（C4H）的作用下能轉(zhuǎn)化為香豆酸，而L酪氨酸能在酪氨酸解氨酶（TAL）的作用下直接轉(zhuǎn)化為香豆酸。香豆酸和肉桂酸在香豆酰CoA連接酶（4CL）的作用下分別形成相應(yīng)的酚酰CoA。在大多數(shù)藥用植物中參與酚酰CoA生物合成的基因已經(jīng)得到鑒定。PAL是苯丙烷途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵酶，其能催化L苯丙氨酸非氧化性脫氨生成反式肉桂酸（cinnamic acid），Zhang等[6]從青蒿中克隆到了PAL，該基因與其他植物的PAL具有高度同源性。通過RTPCR分析表明該基因在青蒿的嫩葉中高表達(dá)，在大腸桿菌中PAL的酶活力能達(dá)287.2 U·mg-1。C4H是苯丙烷途徑的第2個(gè)酶，其能對(duì)反式肉桂酸進(jìn)行羥基化形成香豆酸（coumaric acid），C4H在許多植物中都已得到鑒定例如長春花[7]、黃芩[8]、三角葉楊[9]等。Kong等[10]通過分析虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆到了1個(gè)C4H基因，通過酵母異源表達(dá)分析表明該基因能將反式肉桂酸轉(zhuǎn)化為香豆酸。4CL是苯丙氨酸途徑中的關(guān)鍵性限速酶，其能催化香豆酸和肉桂酸分別形成香豆酰CoA和肉桂酰CoA。Gao等[11]從地錢中克隆到了1個(gè)4CL基因，在大腸桿菌中該基因能將香豆酸轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基香豆酰CoA，酶動(dòng)力學(xué)分析表明該酶的最適底物是香豆酸。

1.2 從酚酰CoA到二氫黃酮 二氫黃酮主要包括柚皮素和松屬素。查耳酮合成酶（CHS）是黃酮類化合物合成途徑中的第1 個(gè)限速酶，第1 個(gè)植物中的CHS是1983 年在荷蘭芹中發(fā)現(xiàn)的，其能將3 分子的丙二酰CoA和1 分子的香豆酰CoA或者肉桂酰CoA結(jié)合形成一個(gè)具有C13 結(jié)構(gòu)的柚皮素查耳酮或松屬素查耳酮。查耳酮異構(gòu)酶（CHI）是黃酮類化合物代謝途徑中的第2 個(gè)關(guān)鍵酶，第1 個(gè)CHI基因是Mehdy等[12]于1987 年從法國豌豆中分離出來的，其能使CHS的催化產(chǎn)物發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化。柚皮素查耳酮和松屬素查耳酮在CHI的催化下能形成柚皮素和松屬素。Cheng等[13]在銀杏葉中克隆到了CHI基因，在大腸桿菌中該酶能將6羥基查耳酮轉(zhuǎn)化為柚皮素。Park等[14]從黃芩中克隆到了CHI基因，為了驗(yàn)證該基因的功能，該研究小組構(gòu)建了CHI基因的過表達(dá)和RNAi載體并轉(zhuǎn)化毛狀根。與對(duì)照組相比，CHI基因過表達(dá)的毛狀根中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量明顯增加，而在CHI基因表達(dá)通過RNAi受到抑制后，黃酮類化合物的含量明顯降低。

1.3 從二氫黃酮到各類黃酮類化合物 二氫黃酮類化合物能在黃酮合酶（FNS）催化下在2，3位脫氫形成雙鍵生成黃酮類化合物。FNS存在2種類型FNSⅠ和FNSⅡ，其中FNSⅠ主要分布于傘形科植物中，能直接將柚皮素轉(zhuǎn)化為芹黃素，而FNSⅡ則于植物中普遍存在且表現(xiàn)出完全不同的催化活性，其能在C2和C3脫氫生成黃酮類化合物[1516]。Han等[17]從地錢中克隆到了FNS基因，通過異源表達(dá)和體外酶活分析顯示，該酶具有FNSI的催化活性，能將柚皮素轉(zhuǎn)化為芹黃素和2羥基柚皮素。Wu等[18]從金銀花中克隆到了2個(gè)FNS基因（LjFNSⅡ1.1和LjFNSⅡ2.1），從灰氈毛忍冬中克隆到了一個(gè)FNS基因（LmFNSⅡ1.1），在酵母中表達(dá)的LjFNSⅡ1.1， LjFNSⅡ2.1和LmFNSⅡ1.1分別能將圣草酚，柚皮素，甘草素轉(zhuǎn)化為木樨草素，芹黃素和7，4′二氫黃酮（DHF）。其中LjFNSⅡ1.1與LjFNSⅡ2.1表現(xiàn)出的不同催化活性主要是由于242位的氨基酸差異引起的，研究表明在206和381位的甲基化能顯著提高LjFNSⅡ1.1的催化活性。

二氫黃酮類化合物能在異黃酮合成酶（IFS）的催化下將芳香基團(tuán)從2位向3位轉(zhuǎn)移生成異黃酮類化合物。Misra等[19]首次從補(bǔ)骨脂中克隆到了PcIFS基因，該基因在補(bǔ)骨脂的各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，并可以被茉莉酸甲酯和水楊酸的誘導(dǎo)。為了驗(yàn)證該基因的功能，該研究小組在煙草中對(duì)PcIFS基因進(jìn)行了過表達(dá)分析，與對(duì)照組相比過表達(dá)煙草花瓣中異黃酮含量有顯著積累。Jung等[20]從大豆EST中篩選出了2個(gè)IFS基因并在擬南芥中對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證，在表達(dá)IFS的擬南芥中能檢測(cè)到染料木黃酮，說明IFS參與異黃酮類化合物的生物合成。

二氫黃酮類化合物能在黃烷酮3羥化酶（F3H）的作用下生成二氫槲皮素和二氫山柰素等二氫黃酮醇類化合物，之后又在黃酮醇合酶（FLS）的作用下去飽和形成黃酮醇類化合物。F3H能在5，7，4黃烷酮 C3位進(jìn)行羥化反應(yīng)，生成二氫山柰素，而該物質(zhì)則是合成黃烷酮和花色素的重要中間產(chǎn)物，因此F3H是控制黃酮合成與花青素苷積累的分流節(jié)點(diǎn)，被認(rèn)為是整個(gè)類黃酮代謝途徑的中樞[21]。Xiong等[22]首次從青蒿中克隆到了F3H基因，通過體外酶活分析發(fā)現(xiàn)F3H能將松屬素轉(zhuǎn)化為二氫山柰酚。黃酮醇合成酶（FLS）是黃酮類化合物合成途徑與兒茶素合成途徑的橋梁，二氫黃酮醇能在FLS的作用下去飽和形成黃酮醇類化合物[23]。Xu等[24]從銀杏中克隆到了FLS基因，在大腸桿菌中該酶能將二氫山柰酚轉(zhuǎn)化為山柰酚，同時(shí)該酶也能將柚皮素轉(zhuǎn)化為山柰酚，該研究表明在黃酮類化合物合成途徑中FLS是一個(gè)雙功能酶。二氫黃酮醇類化合物能在二氫黃酮醇4還原酶（DFR）的作用下生成無色花色素類化合物，之后又在無色花色素還原酶（LAR）的作用下轉(zhuǎn)化為兒茶酚等黃烷醇類化合物。二氫黃酮醇 4還原酶（DFR）是花青素和鞣質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶，其是一個(gè)重要的分支點(diǎn)[25]。Cheng等[26]從銀杏中克隆到了3個(gè)DFR基因（DFR1，DFR2，DFR3），在大腸桿菌中表達(dá)的DFR1與DFR3能將二氫槲皮素轉(zhuǎn)化為無色花青素，而DFR2能將二氫山柰酚轉(zhuǎn)化為白天竺葵苷元。原花色素是植物應(yīng)對(duì)生物及非生物脅迫的一種重要化合物，而LAR是參與原花色素生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。Wang等[27]從三葉楊中克隆到了LAR基因（PtrLAR1）。為了驗(yàn)證該基因的功能，該研究小組在白楊中對(duì)基因PtrLAR1進(jìn)行了過表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株中的原花色素有明顯的增加，同時(shí)兒茶素和表兒茶素也有顯著的增加。

花色素合成酶（ANS）是位于花青素合成途徑中的倒數(shù)第2個(gè)酶，該酶能將無色花青素轉(zhuǎn)化為花青素。Xu等[28]從銀杏中克隆到了ANS基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)后，該酶能將無色花青素轉(zhuǎn)化為花青素，同時(shí)該酶也能將二氫槲皮素轉(zhuǎn)化為槲皮素，說明ANS在花青素和黃酮醇合成途徑中是一個(gè)雙功能酶。

1.4 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)修飾 黃酮類化合物在甲基和糖基轉(zhuǎn)移酶等修飾酶的催化下能形成多種黃酮類衍生物。Li等[29]首次從葛根中克隆到了一個(gè)異黃酮3O甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）基因，通過在大腸桿菌和酵母中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該酶能對(duì)異黃酮的3位羥基進(jìn)行甲基化。在植物的組織內(nèi)多數(shù)黃酮與糖結(jié)合，以黃酮苷的形式存在，對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行糖基化修飾有利于增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性及溶解性。Li等[30]從葛根中分離了7個(gè)全長的糖基轉(zhuǎn)移酶候選基因并在酵母表達(dá)體系中對(duì)這些基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證，通過分析發(fā)現(xiàn)有一個(gè)候選基因（PlUGT1）能將異黃酮的7位羥基進(jìn)行糖基化，這些實(shí)驗(yàn)表明PlUGT1是一個(gè)異黃酮7O糖基轉(zhuǎn)移酶。Wang等[31]從葛根中克隆到了異黃酮4′，7O二糖苷糖基轉(zhuǎn)移酶（PlUGT2）基因，通過體外酶活分析發(fā)現(xiàn)PlUGT2能對(duì)異黃酮的O4′和O7′進(jìn)行糖基化，Realtime PCR發(fā)現(xiàn)PlUGT2在葛根根中表達(dá)量最高，這與4′，7O二糖苷的積累模式相同。PlUGT的挖掘及鑒定將有利于更好地理解葛根中黃酮類化合物的糖基化反應(yīng)。

2 黃酮類化合物的合成生物學(xué)研究

對(duì)黃酮類化合物合成途徑的深入研究和解析為其合成生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，推動(dòng)了相關(guān)領(lǐng)域的快速發(fā)展，近年來已對(duì)槲皮苷[32]、柚皮素[33]、松屬素[34]、兒茶素[35]、金雀異黃酮[36]、非瑟酮[37]和無色花青素[38]等多種黃酮類化合物開展了合成生物學(xué)相關(guān)研究。

2.1 柚皮素 Santos等[39]將來源于類球紅細(xì)菌的RgTAL，有高效催化活性的Sc4CL和PhCHS及經(jīng)密碼子優(yōu)化的MsCHI一起構(gòu)建到表達(dá)載體，以產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌為底盤細(xì)胞，在含葡萄糖的MOPS培養(yǎng)基里生產(chǎn)出了柚皮素29 mg·L-1。丙二酰CoA是黃酮類化合物生物合成的重要底物之一，但因其在微生物中合成較少，使其成為黃酮類化合物合成生物學(xué)研究的一個(gè)瓶頸。在該研究中采用了2種策略來提高丙二酰CoA的供應(yīng)，策略一：構(gòu)建一條丙二酸鹽同化途徑增加丙二酰CoA的供應(yīng)；策略二：添加脂肪酸途徑的抑制劑淺藍(lán)菌素用于抑制競爭支路，限制丙二酰CoA向脂肪酸轉(zhuǎn)化。通過以上2個(gè)途徑的改造，柚皮素的產(chǎn)量分別增加了59%，190%，最終使柚皮素的產(chǎn)量達(dá)到了84 mg·L-1。

2.2 松屬素 Wu等[40]利用合成生物學(xué)手段首次將葡萄糖轉(zhuǎn)化為松屬素，為了實(shí)現(xiàn)二氫黃酮的從頭合成，該研究小組在大腸桿菌中構(gòu)建了4個(gè)功能模塊，模塊一含內(nèi)源性3脫氧D阿拉伯庚酮糖酸7磷酸合酶基因aroFwt和抗反饋抑制的突變預(yù)苯酸脫水酶基因pheAfbr，可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸；模塊二含基因PAL和4CL，將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酰CoA；模塊三含基因三葉草根瘤菌丙二酰CoA合酶matB和丙二酸鹽載體蛋白matC，增加丙二酰CoA的供應(yīng)；模塊四含基因CHS和CHI，將肉桂酰CoA和丙二酰CoA轉(zhuǎn)化為松屬素；對(duì)這4個(gè)模塊進(jìn)行優(yōu)化調(diào)節(jié)最終使得松屬素的產(chǎn)量達(dá)到40.02 mg·L-1。Cao等[41]通過在大腸桿菌中過表達(dá)脂肪酸合成途徑中的基因β酮乙基ACP 合成酶Ⅲ （FabH） 和 β酮乙基ACP 合成酶Ⅱ （FabF）使得大腸桿菌中丙二酰CoA的表達(dá)量分別增加了1.4，1.6倍，導(dǎo)致松屬素的產(chǎn)量分別增加了10.6，31.8倍，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)FabF能提高丙二酰CoA和松屬素的產(chǎn)量。隨后，該研究小組在過表達(dá)FabF的菌株中加入了淺藍(lán)菌素使松屬素的產(chǎn)量最終由25.8 mg·L-1增加到 29.9 mg·L-1。

2.3 非瑟酮 非瑟酮存在于多種水果和蔬菜中，具有抗衰老，抗炎，抗癌和抗病毒等功效?；诜巧c槲皮素相似的結(jié)構(gòu)，Stahlhut等[37]推測(cè)非瑟酮可能通過一個(gè)類似于槲皮素生物合成途徑進(jìn)行合成，因此提出一個(gè)新穎的在大腸桿菌中以L酪氨酸為前體合成非瑟酮的生物合成途徑。在該途徑中酚酰CoA在CHS及CHR的催化下生成異甘草素，然后在CHI的作用下轉(zhuǎn)化為甘草素，甘草素在F3H的作用下轉(zhuǎn)化為garbanzol，該化合物與二羥基山柰酚具有相似的結(jié)構(gòu)，最后garbanzol在黃酮單氧化酶（FMO）和細(xì)胞P450還原酶（CPR）的作用下轉(zhuǎn)化為非瑟酮，該途徑中以O(shè)2， NADPH， aKG作為輔助因子。這是首次利用大腸桿菌將芳香族氨基酸轉(zhuǎn)化為非瑟酮。最終，在該研究中構(gòu)建的工程菌株能產(chǎn)12.5 mg·L-1的香豆酸和0.3 mg·L-1非瑟酮。

黃酮類化合物具有多種藥理活性，在人類的健康及飲食方面發(fā)揮著具有重要作用。過去大多數(shù)黃酮類化合物都是通過植物提取和化學(xué)合成獲得，這會(huì)帶來資源過度開采和環(huán)境污染破壞等問題。隨著人們健康觀念的不斷提高，人們對(duì)黃酮類藥品和保健品的需求量逐漸增大，現(xiàn)有的產(chǎn)量將難以滿足日益增長的市場(chǎng)需求。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和其他組學(xué)技術(shù)在本草基因組學(xué)（herbgenomics）研究中的應(yīng)用，極大地推動(dòng)了黃酮類化合物合成途徑研究的進(jìn)展，為其合成生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)[4243]。因?yàn)殍制に睾退蓪偎厥嵌喾N黃酮類化合物的前體物質(zhì)，因此對(duì)這2種化合物的合成生物學(xué)研究最為深入和廣泛。早期的研究通過在大腸桿菌或者酵母中表達(dá)一些關(guān)鍵酶基因，可以將外源添加的香豆酸、苯丙氨酸、肉桂酸等前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為柚皮素和松屬素，但是由于這些前體物質(zhì)昂貴導(dǎo)致難以產(chǎn)業(yè)化。近期研究表明可以通過合成生物學(xué)方法直接以葡萄糖為底物合成柚皮素和松屬素，這將極大地降低生產(chǎn)成本。通過進(jìn)一步優(yōu)化黃酮生物合成體系，提高終產(chǎn)物的產(chǎn)量，推動(dòng)黃酮合成生物學(xué)研究從實(shí)驗(yàn)室向工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化，從而為黃酮類藥物和保健品的研發(fā)提供新的化合物來源。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]