李 亞, 賈奧琳, 鮑敏麗, 許美容, 鄧曉玲

(1 廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 廣東 湛江 524088; 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點試驗室， 廣東 廣州 510642)

長春花感染黃龍病菌多酚氧化酶基因的表達(dá)及活性分析

李 亞1,2, 賈奧琳2, 鮑敏麗2, 許美容2, 鄧曉玲2

(1 廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 廣東 湛江 524088; 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點試驗室， 廣東 廣州 510642)

【目的】分析長春花Catharanthusroseus受黃龍病菌CandidatusLiberibacter asiaticus侵染后多酚氧化酶(PPO)基因的表達(dá)及活性變化?！痉椒ā扛鶕?jù)不同作物多酚氧化酶基因PPO序列的相似性，篩選出長春花多酚氧化酶基因PwPPO引物，PCR擴增得PwPPO基因片段，運用qRT-PCR和生理生化方法分析長春花嫁接黃龍病芽后，不同時間長春花葉、主莖和根中PwPPO基因的表達(dá)量和酶活性變化?！窘Y(jié)果】長春花受黃龍病菌侵染后，葉、主莖和根中PwPPO基因的表達(dá)分別在嫁接后30、35和40 d上調(diào)表達(dá)4.23、12.64和33.80倍，不同組織中PwPPO基因上調(diào)表達(dá)的時間和幅度不同。染病長春花的葉、主莖和根中PPO活性分別在嫁接后30、35和45 d為對照的2.87、2.10和1.89倍?！窘Y(jié)論】PwPPO基因表達(dá)量與PPO活性成正比，與長春花抵抗黃龍病菌侵染的能力密切相關(guān)。

長春花； 黃龍病菌； 多酚氧化酶； 基因表達(dá)； 多酚氧化酶(PPO)活性

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，最早于我國廣東珠江三角洲、潮汕地區(qū)進(jìn)行經(jīng)濟(jì)作物病害調(diào)查時被發(fā)現(xiàn)，隨后成為研究熱點[1-3]。目前，除了地中海盆地、西亞和澳洲外，黃龍病已在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50個國家和地區(qū)發(fā)生為害，幾乎覆蓋了全球所有的柑橘主產(chǎn)區(qū)[4]，嚴(yán)重制約著世界柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。雖然目前黃龍病菌還不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，也未能完成嚴(yán)格意義上的柯赫氏法則，但基于當(dāng)前的研究，一致認(rèn)為柑橘黃龍病是由韌皮部桿菌CandidatusLiberibacter spp.引起的。Garnier等[5]證實夾竹桃科草本植物長春花Catharanthusroseus可以通過嫁接的方式感染黃龍病菌，而且與柑橘屬寄主一樣，黃龍病菌感染長春花后可以在其體內(nèi)進(jìn)行有效增殖。研究還發(fā)現(xiàn)長春花染病后葉片上的癥狀更明顯，菌液濃度更高，因此常用作黃龍病的指示植物和試驗材料[6]。

植物在進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的防御機制，當(dāng)植物正常生長時，體內(nèi)活性氧代謝處在一個低水平的動態(tài)平衡中。當(dāng)受到病原侵染時，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的代謝平衡被破壞，過量的活性氧引發(fā)細(xì)胞的過氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡[7]。在維持活性氧平衡的過程中酚類物質(zhì)和細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)起到了非常重要的作用。關(guān)于多酚氧化酶(PPO)的活性與寄主抗病性的關(guān)系在水稻Oryzasativa、小麥Triticumaestivum、棉花Gossypiumspp.等寄主與稻瘟病菌Pyriculariaoryzae、條銹病菌Pucciniastriiformisfsp.tritici、棉枯萎病菌Fusariumoxysporumfsp.vasinfectum、霜霉病菌Peronosporaparasitica和輪紋病菌Physalosporapiricola等多種病原菌互作系統(tǒng)中都有研究[8-10]。大量研究結(jié)果表明，在不同作物與病原互作中，PPO活性的變化趨勢存在顯著差異，但是其活性的變化規(guī)律仍然反映了植物對病原菌的抵抗能力。對于同屬于韌皮部桿菌屬的土豆斑馬片病原CandidatusLiberibacter solanacearum，Wallis等[11]研究發(fā)現(xiàn)PPO含量在感染發(fā)病的土豆中高于不顯癥的土豆。鮮見柑橘黃龍病病原感染與PPO活性變化的關(guān)系研究。本文以長春花為寄主，在其被黃龍病菌感染的不同時間，通過實時熒光定量PCR對PPO基因在各個時期的表達(dá)量進(jìn)行分析，并結(jié)合生理生化指標(biāo)的測定，探討黃龍病菌感染長春花過程中PPO活性的變化，旨在為寄主抗黃龍病機理研究及抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)長崗山網(wǎng)室內(nèi)，經(jīng)檢測為Ca. L. asiaticus陽性的長春花枝條(病原可通過菟絲子從染病柑橘上獲取)作為嫁接用病芽條；經(jīng)檢測Ca. L. asiaticus陰性的長春花枝條作為嫁接用健康芽條。

2014年3月，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)長崗山網(wǎng)室內(nèi)，將長春花種子播種于育種盆中，待幼苗長到2～3 cm時移栽至直徑為15 cm花盆內(nèi)，保證每盆1株，隔天澆水1次。待植株長至20 cm時，以去頂嫁接病芽的長春花作為染病組，以嫁接健康芽的長春花作為健康組。嫁接后，將所有長春花苗放置陰涼處避免陽光直射，保持嫁接口處芽條濕潤，1周后將嫁接苗從陰涼處取出，轉(zhuǎn)移至網(wǎng)室內(nèi)，隔天澆水1次。

1.2 方法

嫁接病芽后14 d開始，隔天取嫁接點下方葉片，以葉中脈提取DNA，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，以確定染病植株作為陽性樣品。最后按嫁接后染病20、25、30、35、40和45 d共6個時間取樣，每個時間點所取樣品包含3棵陽性植株，3棵健康植株，每棵植株的葉、主莖和根3個部分作為獨立的樣品，液氮冷凍后于-80 ℃條件下保存，用于酶活力測定和RNA提取。

1.2.1 長春花組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 RNA提取參考Omega植物RNA提取試劑盒說明書，提取的總RNA經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性，核酸蛋白測定儀Nanodrop 2000(美國Thermo Fisher公司)測定純度及濃度?？俁NA經(jīng)DNaseⅠ消化處理后取1 μg作為模板，加入1 μL Oligo(dT)18 Primer (50 μmol·L-1)，1 μL dNTP Mixture(10 mmol·L-1)和RNase free ddH2O共10 μL混合均勻，65 ℃保溫5 min后在冰上迅速冷卻，離心后向上述混合液中加入4 μL 5×Primer Script TMⅡ Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor(40 U·μL-1)，1 μL Primer Script TMⅡ RTase(200 U·μL-1)，4.5 μL RNase free ddH2O，振蕩混勻后離心, 42 ℃反應(yīng)1 h，然后70 ℃保溫15 min，將得到的cDNA溶液置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 長春花PwPPO基因片段克隆與序列分析 根據(jù)土豆Solanumtuberosum、番茄Solanumlycopersicum、小麥、擬南芥Arabidopsisthaliana、煙草Nicotianatabacum、山茶Camelliajaponica等物種PPO基因的同源序列，使用PremierPrimer 5設(shè)計出多對引物，由上海英俊公司合成。篩選出長春花多酚氧化酶基因(PwPPO)的引物PwPPOF: 5′-ACAGACCCTACTTCTCCAA-3′，PwPPOR: 5′-TGACGCCTTCCTCCACCTA-3′。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴增保守區(qū)段序列，PCR 擴增反應(yīng)體系為25 μL，包含1 μL cDNA，濃度為10 μmol·L-1的引物PwPPOF和PwPPOR各0.5 μL，2.5 μL 10×PCR Buffer, 2.5 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1), 0.4 μLTaqDNA polymerase(5 U·μL-1), 17.6 μL ddH2O。反應(yīng)條件為96 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)全式金(Transgen)EasyPure? Quick Gel Extraction Kit回收后，按照Transgen PEASY-T1 Simple cloning Kit說明書進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，陽性菌落送上海生工生物工程股份有限公司測序。利用DNAMAN對克隆所得到的序列進(jìn)行相似性分析。

1.2.3PwPPO基因的實時熒光定量PCR表達(dá)分析 根據(jù)“1.2.2”中PwPPO基因保守片段的測序結(jié)果，PwPPOF和PwPPOR可作為PwPPO基因?qū)崟r熒光定量表達(dá)的引物。篩選內(nèi)參基因18S rRNA[12]，18s rRNA F: 5′-GCTTAGGCCAAGGAAGTTTG-3′，18s rRNA R:5′-TCTATCCCCATCACGATGAA-3′。qRT-PCR以SYBER Green為染料，梯度稀釋質(zhì)粒DNA為模板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測時以10倍稀釋的樣品cDNA為模板，20 μL反應(yīng)體系：10 μL SYBER Green mix，濃度為10 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，2.5 μL cDNA，其余用ddH2O補足。每個反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線。使用BIO-RAD公司IQ5定量PCR儀，樣品所有目的基因和內(nèi)參基因的Ct以3次重復(fù)的平均值計算，數(shù)據(jù)分析根據(jù)2-ΔΔCt法[13]進(jìn)行，分析PwPPO基因的時序表達(dá)時用第1次采樣的對照樣品的相對表達(dá)值校正，數(shù)據(jù)均以mRNA的相對表達(dá)量表示。

1.2.4 PPO活性分析 PPO活性的測定采用鄰苯二酚法[14]：稱取新鮮植物組織0.1 g，加液氮研磨后加入1 mL 0.05 mol·L-1pH 6.8的磷酸緩沖液，將勻漿轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液作為酶粗提液；取0.5 mL鄰苯二酚(0.1mol·L-1)，0.5 mL粗酶液，2.5 mL pH 6.8的磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1)，以清水為對照，測定D420 nm的變化。以1 min內(nèi)D420 nm變化0.01為l個酶活力單位(U)，以鮮質(zhì)量為基礎(chǔ)，酶活性單位表示為U·g-1，每樣品重復(fù)測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，ANOVA和鄧肯氏新復(fù)極差法分析數(shù)據(jù)，Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 PwPPO基因擴增與分析

利用反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA作為模板，引物為PwPPOF和PwPPOR，擴增PwPPOcDNA片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到片段長度為419 bp的目的基因(圖1)。目的條帶經(jīng)切膠回收、連接和轉(zhuǎn)化后送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明PCR擴增序列與Genbank中其他植物已知的PPO基因的相似性最高可達(dá)83%。

M: DL 2000 DNA Marker；1:PwPPO基因。

圖1PwPPO基因特異性引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 A garose gel electrophoresis ofPwPPOPCR product with specific primers

2.2 PwPPO基因的實時熒光定量PCR表達(dá)分析

長春花葉片DNA常規(guī)PCR檢測結(jié)果顯示，試驗組所有樣品均為Ca. L. asiaticus陽性，對照組樣品均為Ca. L. asiaticus陰性。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，在試驗組和對照組都能檢測到PwPPOmRNA的表達(dá)，在染病長春花的葉、主莖和根中，PwPPO的表達(dá)總體呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢(圖2A、2B、2C)，但不同組織上調(diào)表達(dá)的時間和幅度不同。葉片中PwPPO的表達(dá)從嫁接后25 d開始明顯上調(diào)，在30 d達(dá)到最大值，上調(diào)4.23倍，差異極顯著(P<0.01)，染病后期(35～45 d)上調(diào)均超過3.00倍，差異顯著(P<0.05)。主莖中PwPPO的表達(dá)量在染病早期(20～30 d)無明顯上調(diào)趨勢，在35 d達(dá)到試驗周期中的最大值，上調(diào)12.64倍，差異極顯著(P<0.01)，隨后表達(dá)量下降，在45 d時與對照差異不明顯(P>0.05)。根中PwPPO基因的表達(dá)在感染后期快速上調(diào)，40 d時上調(diào)達(dá)到33.80倍(P<0.01)，45 d上調(diào)表達(dá)倍數(shù)有所下降，但仍達(dá)到11.39倍，差異極顯著(P<0.01)。由圖2D可以看出PwPPO基因表達(dá)在染病長春花上的空間差異，在染病早期(20 d)時，葉、主莖、根組織中PwPPO的表達(dá)幾乎沒有差異，表達(dá)水平較低；25～30 d，葉片中PwPPO基因的表達(dá)上調(diào)倍數(shù)較高，與主莖、根間差異顯著；35 dPwPPO在主莖中的表達(dá)占優(yōu)勢，而后期(40～45 d)根中的PwPPO表達(dá)量較葉和主莖高。

*和**分別表示同一時間不同處理間差異達(dá)顯著和極顯著(P<0.05，P<0.01，Duncan’s法)。

2.3 PPO活性分析

從嫁接后第20天開始，測定用于1.2.3中qRT-PCR試驗的長春花葉片、主莖和根的PPO活性，結(jié)果表明，健康對照中各時期葉、主莖和根中PPO活性變化不大，根部的活性要高于葉和主莖(圖3A)。染病長春花葉和主莖中PPO的活性變化呈現(xiàn)相似的規(guī)律，分別在30和35 d達(dá)最大值，分別為634.67和548.11 U·g-1，在感染中后期酶活力下降，45 d分別下降至492.00和377.00 U·g-1，根部的PPO活性變化整體呈逐漸增加的趨勢，在45 d達(dá)到最大值792.00 U·g-1(圖3B)。與對照相比，染病的長春花葉、主莖和根中PPO活性均較健康對照高，分別于30，35和45 d達(dá)到對照的2.87、2.10和1.89倍，差異極顯著(P<0.01)(圖4A、4B、4C)。

圖3 健康和染病長春花不同組織中PPO活性變化Fig.3 Changes of PPO activities in different tissues of healthy and infected periwinkles

*和**分別表示染病組與健康組差異達(dá)顯著和極顯著(P<0.05，P<0.01，Duncan’s法)。

3 討論與結(jié)論

本研究根據(jù)不同物種PPO基因的同源序列設(shè)計出多套長春花PwPPO基因的引物，利用篩選出的特異性引物，PCR 擴增得到長春花長度419 bp的PwPPO片段。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)擴增得到的PwPPO基因目的片段與刺癢黎豆Mucunapruriens的PPO基因序列相似性最高，達(dá)到83%，說明所克隆的基因片段屬于PPO基因家族的成員。

植物體內(nèi)，PPO可以通過參與酚的氧化，形成對病菌毒性較高的醌類物質(zhì)，并參與木質(zhì)素的合成，使細(xì)胞壁增厚來抵御病菌的侵入和擴展從而抑制寄主發(fā)病，因此，PPO與寄主的病原性防御反應(yīng)密切相關(guān)，在寄主拮抗微生物侵染過程中發(fā)揮著重要作用[15]。在哈茨木霉Trichodermaharziaiarum與水稻[16]、寡雄腐霉Pythiumoligandrum與煙草Nicotianatabavum[17]、綠色木霉Trichodermaviride與黃瓜Cucumissativus[18]和潰瘍病菌Pseudomonassyringaepv.tomato與番茄Solanumlycopersicum[19]等互作研究中均發(fā)現(xiàn)PPO活性的增強與寄主抗病能力的增加有密切關(guān)系。本研究運用qRT-PCR和生理生化方法分析不同時間長春花葉、主莖和根中PwPPO基因的表達(dá)量和PPO活性變化。結(jié)果表明，黃龍病菌侵染后長春花各組織中PwPPO基因的表達(dá)量總體呈上調(diào)的趨勢，酶活性測定結(jié)果也證實染病長春花中PPO活力較健康長春花中的活性高，說明在黃龍病菌侵染的長春花中PPO活性的增加與寄主抵抗病原入侵有一定的相關(guān)性。與健康組相比，染病長春花各組織中均發(fā)現(xiàn)在PwPPO基因上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較高的階段，PPO的活性也較強，說明PwPPO基因的表達(dá)量與PPO活性之間存在一定的正相關(guān)性。在黃龍病菌的刺激下，長春花通過增加各組織中PwPPOmRNA的表達(dá)量來提高植株P(guān)PO的整體水平，達(dá)到增強抵抗病原菌入侵的目的。至于長春花不同組織中PwPPO基因的表達(dá)量以及PPO活性上調(diào)的幅度和時間不完全一致，原因之一可能與PPO的組織特異性有一定關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)幼葉、花、根的分生組織以及正在生長的果實中PPOmRNA含量都較高，而成熟組織，如成熟的葉片和莖中則較少[20]。本試驗也證實在健康的長春花中，主莖部位PPO活性最低，根部活性最高。其二可能與黃龍病菌對植物不同組織感染的時間和分布有關(guān)。頂端嫁接試驗表明，黃龍病菌可以從嫁接點隨著營養(yǎng)物質(zhì)的運輸轉(zhuǎn)移到根部，很多研究也證實其在寄主植物不同組織中分布是不均勻的[21]，從而導(dǎo)致長春花不同部位間防御反應(yīng)發(fā)生的時間和強度有一定差異。

長春花作為黃龍病菌研究中常用的指示植物和試驗材料，其與黃龍病菌的互作可以為黃龍病菌與柑橘類寄主的互作研究提供重要參考。本試驗證實PwPPO基因表達(dá)量與PPO活性成正比，與長春花抵抗黃龍病菌侵染的能力密切相關(guān)。這一結(jié)果將促進(jìn)黃龍病菌與長春花互作機理的深入研究，而有關(guān)病原侵染后PPO表達(dá)的分子機制以及是否可以將PPO作為篩選抗性材料的生化指標(biāo)，還需要進(jìn)一步試驗和研究。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

Gene expression and activity of polyphenol oxidase from Catharanthus roseus infected by Candidatus Liberibacter asiaticus

LI Ya1,2, JIA Aolin2, BAO Minli2, XU Meirong2, DENG Xiaoling2

(1 College of Agriculture, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China;
2 College of Agriculture, South China Agricultural University/Guangdong Province Key
Laboratory of Microbial Signals and Disease Control, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To study gene expression and enzyme activities of polyphenol oxidase (PPO) from periwinkle(Catharanthusroseus)infected byCandidatusLiberibacter asiaticus.【Method】The gene fragment of periwinkle PPO (PwPPO) was obtained using PCR technique. Primers were designed according to the sequence similarity ofPPOgenes from different species. Expression and enzyme activities ofPwPPOwere analyzed in leaves, center stems and roots ofC.roseusinfected byCa. L. asiaticus at different days after inoculation using qRT-PCR and physiological and biochemical methods. 【Result】The expressions ofPwPPOwere upregulated 4.23, 12.64 and 33.80 fold respectively in leaves, center stems and roots at 30, 35 and 40 days after inoculation. The time and extent of the upregulated expressions ofPwPPOin different tissues were different. The PPO activities in leaves, center stems and roots of periwinkle infected byCa. L. asiaticus were 2.87, 2.10 and 1.89 times respectively of healthy control at 30, 35 and 45 days after inoculation respectively. 【Conclusion】Gene expression level ofPwPPOis proportional to PPO activity, and is related closely to the resistance ability of host periwinkle againstCa. L. asiaticus invasion.

Catharanthusroseus;CandidatusLiberibacter asiaticus; polyphenol oxidase; gene expression; polyphenol oxidase (PPO) activity

2016- 05- 27優(yōu)先出版時間：2017-01-10

李 亞(1978—)，女，高級實驗師，博士，E-mail：freebirdliya@163.com；通信作者：鄧曉玲(1966—)，女，教授，博士，E-mail:xldeng@scau.edu.cn

廣東省柑橘黃龍病防控專項(粵農(nóng)2014-293)

S828

A

1001- 411X(2017)02- 0063- 06

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李 亞, 賈奧琳, 鮑敏麗， 等.長春花感染黃龍病菌多酚氧化酶基因的表達(dá)及活性分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(2):63- 68.