巴翠玉, 張培軍, 趙福廣, 杜曉燕, 焦 雪, 李月紅

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118； 2吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林 長春 130000；3 吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林 長春 130033)

異育銀鯽呼腸孤病毒的分離與鑒定

巴翠玉1, 張培軍2, 趙福廣1, 杜曉燕3, 焦 雪1, 李月紅1

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118； 2吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林 長春 130000；3 吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林 長春 130033)

【目的】發(fā)現(xiàn)異育銀鯽Carassiusauratusgibelio新病原，為其病害防控提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā?從吉林省某養(yǎng)殖場采集異育銀鯽出血病疑似病樣，對其進行細菌分離及寄生蟲觀察、鯉皰疹病毒Ⅱ型的PCR檢測和人工感染試驗,然后用感染濾液接種鯉上皮瘤細胞(EPC)，并對其進行電鏡觀察。對病毒基因組進行SDS-PAGE電泳分析、RT-PCR鑒定及序列測定?！窘Y(jié)果】 發(fā)病異育銀鯽無細菌及寄生蟲感染，鯉皰疹病毒Ⅱ型的PCR檢測無特異性條帶，將過濾后的患病魚組織濾液感染健康異育銀鯽， 7 d內(nèi)死亡率高達86.7%。盲傳4代后出現(xiàn)明顯的細胞病變。負染后電鏡下可觀察到病毒粒子，直徑約70 nm，病毒顆粒近球形，無囊膜結(jié)構(gòu)，初步判斷為呼腸孤病毒(暫命名JL-4)。SDS-PAGE結(jié)果揭示，JL-4 基因組由11條dsRNA組成，呈現(xiàn)水生呼腸孤病毒基因組典型特征。將RT-PCR擴增產(chǎn)物的序列進行聚類分析，結(jié)果顯示，JL-4與呼腸孤病毒HZ08株S6序列相似性高達99%，證明該分離株為呼腸孤病毒?！窘Y(jié)論】 從患病異育銀鯽中分離到1株呼腸孤病毒。

異育銀鯽； 呼腸孤病毒； 鯉上皮瘤細胞； 分離與鑒定; SDS-PAGE

水生呼腸孤病毒Aquareovirus具雙層衣殼，病毒粒子直徑為60～70 nm，二十面體對稱，無囊膜，基因組由11 條分節(jié)段的雙鏈RNA 組成[1-5]，其不僅能感染淡水魚類，還能感染海水魚類，已在世界范圍造成比較廣泛的危害。草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤病毒科Reoviridae新成員，是中國大陸分離的第1株魚類病毒[6-8]。該病毒主要引起中國、越南、緬甸等亞洲國家淡水養(yǎng)殖中的草魚在魚種階段發(fā)生出血病，死亡率高達90%以上，還可感染青魚、麥穗魚和稀有鮈鯽等，使其發(fā)生出血病癥狀而死亡。該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長，嚴重影響了廣大養(yǎng)殖者的積極性和我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[9-12]。

異育銀鯽Carassiusauratusgibelio是一種改良的鯉科魚類，因其肉質(zhì)鮮美、生長速度快、飼養(yǎng)周期短、經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，深受廣大生產(chǎn)者和消費者的歡迎，是我國重要的食用經(jīng)濟魚類之一。其產(chǎn)量可以達到1.12～1.50 kg·m-2[13-14]。近年來由于養(yǎng)殖密度大和品種退化等原因，異育銀鯽的養(yǎng)殖遭遇了病害，部分池塘連續(xù)發(fā)病率在70%以上，死亡率高達80%[15]。目前對其患孢子蟲病、斜管蟲病，以及敗血癥、溶血性腹水病等細菌性疾病[16-19]的研究較多，但對病毒性出血病的研究報道較少，其中鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinidherpesvirus-2,CyHV-2)感染異育銀鯽是近年新出現(xiàn)的一種嚴重病毒性疾病,已經(jīng)造成重大經(jīng)濟損失。2015年5月中旬，吉林省某漁場異育銀鯽暴發(fā)嚴重病害，造成異育銀鯽的大規(guī)模死亡，經(jīng)濟損失慘重。本研究通過對發(fā)病異育銀鯽樣品，在排除細菌感染的可能后，應(yīng)用鯉上皮瘤細胞(EPC) 分離到1株病毒，暫命名為JL-4，并通過電鏡觀察、核酸分析、序列測定等方法對該病毒進行了研究，旨在發(fā)現(xiàn)新的病原，為異育銀鯽的病害防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 患病異育銀鯽于2015年5月采自吉林省某漁場，體質(zhì)量約40～50 g, 臨床癥狀為眼球突出、鰓出血、胸鰭和腹鰭基部出現(xiàn)充血現(xiàn)象、魚身出現(xiàn)不同的出血點及潰爛。解剖之后發(fā)現(xiàn)魚鰓部發(fā)紅，且有的鰓絲發(fā)白，內(nèi)臟多處均出現(xiàn)充血癥狀。

健康異育銀鯽購自吉林省新立城水庫，平均體質(zhì)量(68.00±0.91) g，24～26 ℃水溫馴養(yǎng)7 d后，選取體格健壯、規(guī)格整齊、游動活躍的異育銀鯽進行試驗。

1.1.2 試驗試劑 鯉上皮瘤細胞(EPC)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)研究室保存；M199 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶為Gibco 公司產(chǎn)品；Taq酶、dNTPs、DNA Marker、DNA提取試劑盒購自TaKaRa 公司； cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol Reagent 購于Invitrogen 公司；膠回收試劑盒購自Qiagen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物的設(shè)計和合成 引物由上海生工合成，引物設(shè)計參照《SN3584-2013草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范》[20]，序列為S6R：5′-AGTTCTCAAAGCTGAGACAG-3′和S6F：5′-ACGTGCGATTGGAAGAGCTT-3′。

1.2 細菌分離及寄生蟲觀察

參照徐洋等[21]的方法，從患病魚的肝胰臟、脾、腎等組織進行細菌分離，所用培養(yǎng)基為胰酪胨大豆瓊脂(TSA)。同時，取病魚鰓、鰭條等組織在顯微鏡下檢查寄生蟲情況。

1.3 鯉皰疹病毒Ⅱ型的PCR檢測

收集病魚的鰓、肝胰臟、腸等組織，用DNA提取試劑盒提取DNA。參考GenBank中CyHV-2的基因序列，根據(jù)保守序列設(shè)計引物，F(xiàn)：5′-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3′；R：5′-CCATAGTCACCCATAGTCAC-3′。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：ddH2O 5 μL,上、下游引物各1 μL，2×TaqMix 12.5 μL，DNA模板5 μL，MgCl20.5 μL。PCR程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，純化后交由上海生工測序。

1.4 樣品處理

無菌條件下，取瀕臨死亡、具有典型癥狀的發(fā)病異育銀鯽的鰓、肝胰臟和腸等組織，用經(jīng)高壓滅菌的研缽將其碾碎，加入含φ為10%血清的M199培養(yǎng)基，將其制成勻漿，反復(fù)凍融3次。4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清，經(jīng)直徑為0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

1.5 人工感染試驗

選用健康異育銀鯽60尾，隨機分為2組：對照組和試驗組。將2組魚同時放入相同水環(huán)境的不同魚缸中。對照組每條魚注射無菌生理鹽水0.2 mL，試驗組每條魚注射“1.4”中制備的濾液0.2 mL，25 ℃ 水溫下飼養(yǎng) 7 d，觀察并記錄魚體變化情況。

1.6 病毒分離和電鏡觀察

EPC細胞經(jīng)傳代長成致密單層細胞，棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌2次，加入1 mL“1.4”中制備的濾液，27 ℃培養(yǎng)箱中吸附1 h，棄濾液，加入含10%(φ)血清和1%(φ)雙抗的細胞培養(yǎng)液，27 ℃恒溫培養(yǎng)。每天觀察細胞是否病變, 若無病變再盲傳5代，并每天用顯微鏡觀察病變細胞的比例，待病變細胞80 %以上時收獲。

收集盲傳4代的病變細胞，反復(fù)凍融3次，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min后，取30 μL上清液進行負染后用透射電鏡進行觀察。

1.7 病毒基因組的SDS-PAGE鑒定

按照Trizol Reagent提取病毒RNA。配制聚丙烯酰胺凝膠：10%分離膠和5%濃縮膠，每孔病毒RNA上樣量為50 μL RNA提取物混合10 μL 6×Loading Buffer，加入凝膠樣品孔中。恒壓80 V開始電泳，直至樣品濃縮成1條線，加大電壓至120 V繼續(xù)電泳20 h。電泳結(jié)束后，進行硝酸銀染色后拍照。

1.8 RT-PCR鑒定和生物信息學(xué)分析

按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。 PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：TaKaRa LA-Taq0.5 μL， cDNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 8 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 30.5 μL。PCR程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物純化后交由上海生工測序。測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，使用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離及寄生蟲觀察

對發(fā)病異育銀鯽進行細菌分離，僅在肝胰臟組織分離板有個別菌生長，判定是雜菌或是繼發(fā)感染的細菌，并非是引起異育銀鯽發(fā)病的病原菌。取發(fā)病魚的鰓及鰭條顯微鏡下觀察未見有寄生蟲感染。

2.2 鯉皰疹病毒Ⅱ型的PCR檢測

以發(fā)病異育銀鯽的鰓、肝胰臟、腸等組織的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增未得到CyHV-2特異性片段(圖1)，說明該病的病原不是鯉皰疹病毒Ⅱ型。

2.3 人工感染試驗

人工感染試驗中，感染3 d后，異育銀鯽開始發(fā)病，同自然發(fā)病癥狀相同，表現(xiàn)為：眼球突出、鰓出血、胸鰭和腹鰭基部出現(xiàn)充血現(xiàn)象、魚身出現(xiàn)不同的出血點及潰爛。解剖之后發(fā)現(xiàn)魚鰓部發(fā)紅，且有的鰓絲發(fā)白，內(nèi)臟多處出現(xiàn)充血癥狀。7 d后，試驗組30尾試驗魚，共死亡26尾，死亡率約為86.7%，對照組無死亡。

M:DL2000 DNA Marker；1、2為異育銀鯽DNA。

2.4 病毒分離和電鏡觀察

組織液感染單層EPC細胞24 h后并未出現(xiàn)任何病變，盲傳4代36 h后開始出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為單層細胞局部出現(xiàn)邊緣不整齊的空洞，少許細胞脫落，隨著細胞病變效應(yīng)(CPE)的發(fā)展，細胞呈網(wǎng)狀收縮，逐漸脫落崩解，最后呈現(xiàn)典型破魚網(wǎng)狀(圖2A)。而未接種病毒的對照細胞生長狀態(tài)良好(圖2B)。

A：被感染細胞 B: 對照組細胞

病毒懸液經(jīng)過負染，在透射電鏡中觀察到病毒粒子，大小均一，直徑約70 nm，病毒顆粒近球形，無囊膜結(jié)構(gòu)，中間有一電子密度至密區(qū)域(圖3)。初步鑒定為呼腸孤病毒，暫時命名為JL-4。

圖3 電鏡下的病毒粒子Fig.3 The viron under electron microscope

2.5 病毒基因組的SDS-PAGE鑒定

將JL-4核酸樣品進行SDS-PAGE電泳20 h，硝酸銀染色，結(jié)果顯示病毒基因組產(chǎn)生10條清晰條帶(圖4)，其中S4和S5由于相對分子質(zhì)量接近，2條帶不能完全分開，這11條帶按照相對分子質(zhì)量從大到小可以分為3組，即S1、S2、S3；S4、S5、S6和S7、S8、S9、S10、S11，為典型的水生呼腸孤病毒基因組核酸帶型。

圖4 病毒基因組SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of the isolate genome

2.6 RT-PCR鑒定

以JL-4株cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增得特異性片段，與預(yù)期產(chǎn)物的大小相符合(圖5)。將上述PCR 擴增產(chǎn)物進行測序，用NCBI/Blast 對該序列進行同源性分析，結(jié)果如圖6所示，該序列與GenBank 中已發(fā)表的呼腸孤病毒HZ08株第6 基因片段核苷酸序列(登錄號：GQ896337.1)的相似性達99%，因此可確定該病毒為呼腸孤病毒。

M:DL2000 DNA Marker；1為JL-4的cDNA基因組。

圖6 基于S6序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on S6 sequences

3 討論與結(jié)論

本試驗對從吉林省某漁場采集的發(fā)病異育銀鯽樣品進行病原的分離鑒定，為鑒定是否為細菌性感染疾病，進行了細菌的平板劃線分離，僅在肝胰臟組織分離板中可見個別細菌生長，故判斷是雜菌或是繼發(fā)感染的細菌，并非是引起異育銀鯽發(fā)病的病原菌。通過人工感染試驗發(fā)現(xiàn)試驗組的發(fā)病癥狀與自然條件下魚體發(fā)病癥狀一致，表現(xiàn)為眼球突出、鰓出血、胸鰭和腹鰭基部出現(xiàn)充血現(xiàn)象、魚身出現(xiàn)不同的出血點及潰爛。解剖發(fā)現(xiàn)鰓部發(fā)紅，且有的鰓絲發(fā)白，內(nèi)臟多處出現(xiàn)充血癥狀。感染7 d后，致死率達到86.7%。但張超等[22]研究發(fā)現(xiàn)草魚呼腸孤病毒HZ08株感染草魚后, 病魚體色發(fā)黑, 并無明顯出血癥狀，這與本試驗有所差異。不同病毒株感染的魚體發(fā)病癥狀不同，可能是因為不同基因型所致。而劉永奎等[23]和郝貴杰等[2]研究發(fā)現(xiàn)草魚感染草魚呼腸孤病毒后，發(fā)病草魚口腔及上下頜、頭蓋、眼眶周圍、鰓蓋及鰭條基部都充血，與本試驗結(jié)果相似。采用EPC細胞分離的方法對病樣進行病毒分離，病樣組織濾液感染單層EPC細胞24 h后并未出現(xiàn)任何病變，盲傳4代后開始出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為單層細胞局部出現(xiàn)邊緣不整齊的空洞，少許細胞脫落，隨著細胞病變效應(yīng)(CPE)的發(fā)展，單層細胞呈網(wǎng)狀收縮，逐漸脫落崩解，最后呈現(xiàn)典型破魚網(wǎng)狀。與劉寶芹等[24]研究發(fā)現(xiàn)的草魚呼腸孤病毒不導(dǎo)致細胞病變的結(jié)果不一致，可能是JL-4發(fā)生了變異的原因，或者是因為不同的呼腸孤病毒株對EPC的感染性是有差異的。

病毒懸液經(jīng)過負染后，在透射電鏡中觀察到病毒粒子大小均一，直徑約70 nm，病毒顆粒近球形，無囊膜結(jié)構(gòu)，中間有一電子密度至密區(qū)域。與曾偉偉等[25]從草魚中分離到的草魚呼腸孤病毒JX09-01株電鏡觀察結(jié)果一致。而陳吉剛等[26]從鋸緣青蟹中分離到的呼腸孤病毒的病毒直徑約為60 nm，可能是從不同養(yǎng)殖品種中分離到的原因。提取病毒RNA后進行SDS-PAGE凝膠電泳和RT-PCR檢測，凝膠電泳結(jié)果顯示病毒基因組產(chǎn)生10條清晰條帶，其中S4和S5由于分子量接近，2條帶不能完全分開，這11條帶按照分子量從大到小可以分為3 組, 即S1、S2、S3；S4、S5、S6和S7、S8、S9、S10、S11，為典型的水生呼腸孤病毒基因組核酸帶型，該結(jié)果與曾令兵等[6]從患出血病斑點叉尾鮰中分離出的斑點叉尾鮰呼腸孤病毒的SDS-PAGE結(jié)果相似，而與張叔勇等[27]從鋸緣青蟹中分離到的呼腸孤病毒的12條核酸帶構(gòu)成結(jié)果不同。經(jīng)RT-PCR檢測，獲得特異性目的條帶，測序結(jié)果在NCBI中進行Blast比對，結(jié)果與GCRV相應(yīng)序列相似性達99%。綜上研究表明，本試驗分離到的JL-4病毒株為水生呼腸孤病毒。該病毒的分離鑒定為異育銀鯽出血性疾病的防治策略和后續(xù)的研究提供了重要的參考，具有一定的理論意義。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Isolation and identification of a reovirus strain from Gibel carp

BA Cuiyu1, ZHANG Peijun2, ZHAO Fuguang1, DU Xiaoyan3, JIAO Xue1, LI Yuehong1

(1 Animal Science and Technology College,Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;
2 Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Changchun 130000，China;
3 Freshwater Fisheries Research Institute of Jilin Province,Changchun 130033,China)

【Objective】 To discover a new pathogen of Gibel carp (Carassiusauratusgibelio), and to provide a theoretical basis for the disease prevention and control. 【Method】 Gibel carps suspected having hemorrhagic disease were collected from a farm in Jilin Province. Tissues were observed for bacterial infection and parasite contamination. PCR was used to detectCyprinidherpesvirus-2. Artificial infection was conducted, the infection filtrate was vaccinated to the carp epithelial tumor cells (EPC), and the EPC were observed by an electron microscope. The virus genome was analyzed by SDS-PAGE and identified by RT-PCR and sequencing. 【Result】 Neither bacterial nor parasitic infection was detected.Cyprinidherpesvirus-2 specific bands were not detected by PCR. After healthy Gibel carps were infected with tissue filtrate of sick fish, the mortality rate reached 86.7% within seven days. Clear cytopathy was detected after four generations via blind passage. The virus particles were observed by an electron microscope after negative staining, the particle was spherical with around 70 nm in diameter and with no envelope. The virus was initially determined as a reovirus strain (temporarily named JL-4). The SDS-PAGE results showed that JL-4 possessed 11 segments of dsRNA, which was the typical characteristic ofAquareovirusgenome. Cluster analysis for the sequences of the RT-PCR amplification product showed that S6 sequences from JL-4 and reovirus HZ08 had 99% similarity, confirming that JL-4 was reovirus. 【Conclusion】 One reovirus strain was isolated and identified from Gibel carp.

Carassiusauratusgibelio; reovirus； epithelial tumor cell; isolation and identification; SDS-PAGE

2016- 06- 07優(yōu)先出版時間：2017-01-10

巴翠玉(1992—)，女，碩士， E-mail:1030652998@qq.com; 通信作者：李月紅(1968—)，女，教授，博士，E-mail：liyhong@sina.com

國家自然科學(xué)基金(30972191)；吉林省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(201506)；948計劃(2014Z34)

S941

A

1001- 411X(2017)02- 0022- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170110.1423.006.html

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