張道為，石瓊，金戈，王軍，宋旭，蔡暢，方震，周秀萍，郭克勤，于如同

·論著·

FRK通過調(diào)節(jié)EGFR-Y1173磷酸化促進腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡作用的研究

張道為，石瓊，金戈，王軍，宋旭，蔡暢，方震，周秀萍，郭克勤，于如同

目的 研究FRK是否通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)-Y1173磷酸化促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。 方法 應用PolyJetTM將FRK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腦膠質(zhì)瘤U251細胞中，western blot(WB)檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果及EGFR蛋白水平和EGFR-Y1173磷酸化水平的變化，流式細胞術(shù)檢測腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡的變化；轉(zhuǎn)染EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)質(zhì)粒，或共轉(zhuǎn)FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)質(zhì)粒，流式細胞術(shù)檢測腦膠質(zhì)瘤U251細胞凋亡的變化。結(jié)果 成功將FRK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腦膠質(zhì)瘤U251細胞，過表達FRK促進腦膠質(zhì)瘤U251細胞的凋亡。過表達FRK增加EGFR-Y1173磷酸化水平，而對EGFR蛋白水平無影響。過表達EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)質(zhì)粒，細胞凋亡均減少，分別減少了25%和75%。WB結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)質(zhì)粒成功；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達FRK促進了細胞凋亡，EGFR抑制了細胞凋亡，且轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組的作用比轉(zhuǎn)染EGFR(WT)的效果更明顯。此外，轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒可逆轉(zhuǎn)過表達FRK對膠質(zhì)瘤細胞的促凋亡作用。結(jié)論 FRK可以通過促進EGFR-Y1173磷酸化從而調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。

膠質(zhì)瘤；FRK；EGFR；凋亡

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腦腫瘤[1]，發(fā)病率高，預后很不理想，究其原因主要是膠質(zhì)瘤細胞的凋亡能力下降所致。因此，探明膠質(zhì)瘤細胞的凋亡分子機制并采取有效的防治措施，有著極其重要的醫(yī)學價值?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌HeLa細胞系、乳腺癌MCF-7和BT474細胞系中，過表達FRK均可促進細胞凋亡[2]。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)過表達FRK能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，促進其凋亡[3]，那么FRK是通過何種機制發(fā)揮這種作用的呢？2013年Jin和Craven首次報道了在肺癌細胞中FRK與表皮生長因子受體(EGFR)直接結(jié)合，促進Tyr1173殘基磷酸化[4]。磷酸化的Tyr1173降低EGFR活性且抑制下游信號通路，調(diào)節(jié)細胞凋亡[5]。本研究采用Western blot、流式細胞術(shù)等實驗方法，研究FRK是否通過調(diào)節(jié)EGFR-1173磷酸化來影響腦膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供理論依據(jù)與治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 U251細胞系(中國科學院上海細胞庫)，pcDNA3.0-FRK質(zhì)粒(Flag-tag)、pcDNA3.0-EGFR(WT)、pcDNA3.0-EGFR(Y1173F)(美國德州大學醫(yī)學部安德森腫瘤研究中心饋贈)，F(xiàn)RK、EGFR、EGFR(phospho Y1173)抗體(Abcam公司)，GAPDH抗體(杭州賢至公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 腦膠質(zhì)瘤U251細胞依照其培養(yǎng)說明書，在超凈工作臺上操作。棄去原培養(yǎng)基，0.01%PBS洗細胞兩遍，加入0.25%胰酶消化，待細胞收縮變圓后加入適量含有10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，后輕輕吹打細胞至形成單細胞懸液，分瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2，飽和濕度。每3～4 d，細胞處于對數(shù)生長期，鋪滿培養(yǎng)瓶底約70%時傳代一次；按1∶3或1∶4的細胞比例傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 單轉(zhuǎn)組PolyJetTM與 DNA比例為3.0 μl∶1 μg，共轉(zhuǎn)組PolyJetTM與siRNA、DNA 比例為5 μl∶4 μl∶1 μg，檢測時間點為轉(zhuǎn)染后48 h。轉(zhuǎn)染前24 h將 U251細胞接種于6孔塑料培養(yǎng)板，每孔細胞約 5×105個。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，不含抗生素，細胞在24 h后達到85%～90%的融合即可轉(zhuǎn)染。每孔用量為質(zhì)粒DNA 1.0 μg，PolyJetTM3.0 μl，各用高糖培養(yǎng)基50 μl 稀釋，室溫靜置5 min，將兩者混勻室溫靜置孵育15 min，然后直接將混合物加到6孔板中。輕輕搖晃混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h 后換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后提取細胞蛋白進行檢測。

1.2.3 Western blot檢測 將待測蛋白用4×上樣緩沖液配成40 μl體積，然后在垂直電泳槽通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以100 V電壓電泳約2 h。電泳結(jié)束后，根據(jù)上樣情況和蛋白質(zhì)分子量切取適當大小的長方形分離膠，至電轉(zhuǎn)液中浸泡。 剪適當大小的PVDF膜,PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)分鐘后，置入電轉(zhuǎn)液中，而中性濾紙則直接放入電轉(zhuǎn)液中浸泡數(shù)分鐘后開始轉(zhuǎn)膜。恒壓100 V，時間為100 min左右。轉(zhuǎn)膜完畢，把膜放入封閉液中2 h。將膜從封閉液中取出，根據(jù)標記分別放入相應的一抗，4℃過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h。暗室中進行顯影，定影。

1.2.4 流式細胞術(shù) 收集細胞(1～5)×106個，800 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液；3 ml PBS洗1次；離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃，過夜；離心棄去固定液，3 ml PBS重懸5 min；800 r/min離心5 min，棄去PBS；用1 ml PI染液，4℃避光30 min；然后加Annexin V-FITC(5 μl)，流式細胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1 過表達FRK對腦膠質(zhì)瘤U251細胞凋亡的影響 在膠質(zhì)瘤U251細胞中轉(zhuǎn)染FRK質(zhì)粒后48h，提取細胞總蛋白，分別用Flag抗體(圖1A左)和FRK抗體(圖1A右)進行檢測。結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤U251 細胞中，F(xiàn)RK過表達組中FRK的蛋白水平明顯升高，提示轉(zhuǎn)染成功(圖 1A)。應用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，過表達FRK促進了腦膠質(zhì)瘤U251細胞的凋亡，增加約300%(圖1B、1C)。

A：轉(zhuǎn)染Flag和Flag-FRK質(zhì)粒48 h后，Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率；B、C：過表達FRK對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響及統(tǒng)計圖(*P<0.05)圖1 FRK對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響

2.2 過表達FRK對EGFR蛋白水平的影響 在膠質(zhì)瘤U251中轉(zhuǎn)染FRK質(zhì)粒后48 h，Western blot檢測EGFR和EGFR-pY1173水平。與對照組相比，轉(zhuǎn)染FRK質(zhì)粒組EGFR-pY1173蛋白水平明顯上升，上升約200%，而EGFR蛋白水平無明顯變化。結(jié)果表明FRK可以促進EGFR-Y1173磷酸化，但不影響EGFR總蛋白水平(圖2)。

2.3 過表達EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)對細胞凋亡的影響 在膠質(zhì)瘤U251細胞中轉(zhuǎn)染EGFR(WT)和EGFR(Y1173F)質(zhì)粒后，Western blot檢測EGFR蛋白水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染EGFR(WT)和EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組EGFR蛋白水平均明顯上升，提示轉(zhuǎn)染成功(圖3A)。應用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡(圖3B)，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組相比，轉(zhuǎn)染EGFR(WT)和EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組細胞凋亡數(shù)減少，分別減少了25%和75%(圖3C，P<0.05)；且轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染EGFR(WT)質(zhì)粒組相比細胞凋亡數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(圖3C，P<0.01)。

A：Western blot檢測EGFR蛋白水平；B：統(tǒng)計圖(* P<0.05)圖2 FRK對EGFR蛋白水平的影響

A：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染驗證圖;B、C：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及統(tǒng)計圖(*P<0.05，**P<0.01)圖3 過表達EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)對細胞凋亡的影響

2.4 共轉(zhuǎn)FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)質(zhì)粒對細胞凋亡的影響 為研究FRK是否可以通過磷酸化EGFR的Tyr1173殘基促進腦膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，設(shè)計了6個共轉(zhuǎn)組：NC+Control，NC+FRK，Control+EGFR(WT)，Control+EGFR(Y1173F)，F(xiàn)RK+ EGFR(WT)和RK+ EGFR(Y1173F)。WB檢測顯示，共轉(zhuǎn)成功(圖4A)；采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡(圖4B)，與對照組相比，過表達FRK促進了細胞凋亡，EGFR抑制了細胞凋亡，且轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組的作用比轉(zhuǎn)染EGFR(WT)的效果更明顯；此外，轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)了過表達FRK對膠質(zhì)瘤細胞促凋亡的作用(圖4C，P<0.05)。表明通過對EGFR Tyr1173位點突變，可以逆轉(zhuǎn)FRK促進細胞凋亡的作用，F(xiàn)RK可以通過磷酸化EGFR Tyr1173殘基，促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、病死率最高的原發(fā)性腦腫瘤，是威脅人類生命最主要的疾病之一，約占全部原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%～60%[1]，雖然經(jīng)過近幾十年的手術(shù)、放療、化療等綜合治療研究發(fā)展，其總體生存率仍不高。因此，探明膠質(zhì)瘤細胞的分子機制及針對靶基因的基因治療，成為一種新的治療方法。

Src是最早發(fā)現(xiàn)的原癌基因，后來發(fā)現(xiàn)的一些基因在結(jié)構(gòu)、功能上與其有著共同的特點，被統(tǒng)稱為Src激酶家族[6]。眾多研究表明，Src家族在眾多信號傳導通路中起著關(guān)鍵作用，影響著細胞的增殖、分化、遷移和存活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)[7]。其家族成員之一FRK是一個分子量為54 kD的蛋白酪氨酸激酶，屬于Src非受體酪氨酸蛋白激酶家族，與Src激酶家族的大部分成員不同的是，越來越多的證據(jù)表明FRK在人類腫瘤組織中是一個抑癌基因[2-4,8-11]。在宮頸癌HeLa細胞系、乳腺癌MCF-7和BT474細胞系中，過表達FRK均可促進細胞凋亡[11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)過表達FRK可以促進腦膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，與我們以往的報道相符[3]。

EGFR的分子量約為170 kD，由胞外配體結(jié)合域、跨膜疏水結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸結(jié)構(gòu)域組成[12]。EGFR基因是腫瘤中主要的突變基因之一，EGFR激活后，觸發(fā)Ras/Raf、 MAPK、 PKC、 PI3K/PKB、JAK/STAT等很多信號通路，最終調(diào)節(jié)腫瘤的生長、增殖、分化、遷移等相關(guān)基因的表達[13-14]。 EGFR介導的PI3K/PDK1/Akt 信號通路在腫瘤細胞的增殖和凋亡方面扮演重要角色。磷酸化的EGFR-Y920 可以與PI3K結(jié)合，將PIP2轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP3，同時使Akt磷酸化，抑制Bad和 caspase-9引起的凋亡信號通路[5]。EGFR是影響多形性膠質(zhì)母細胞瘤病理和預后主要致癌基因之一[15]。EGFR基因的擴增、過表達和突變已經(jīng)被證明與癌癥有廣泛的聯(lián)系，并且在影響腫瘤發(fā)生多個方面扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染EGFR(WT)和EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組細胞凋亡數(shù)減少，分別減少了25%和75%(圖3C)；且轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染EGFR(WT)質(zhì)粒組相比，細胞凋亡數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這可能與EGFR-Y1173F突變體對腫瘤的致癌性有關(guān)。

A：共轉(zhuǎn)質(zhì)粒驗證圖；B、C：流式細胞術(shù)檢測6組細胞凋亡及統(tǒng)計圖(*P<0.05)圖4 共轉(zhuǎn)FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)質(zhì)粒對細胞凋亡的影響

2013年Jin和Craven首次報道了在肺癌細胞中FRK對EGFR的作用。FRK與EGFR直接結(jié)合，磷酸化Tyr1173殘基，而不改變EGFR整體水平[4]。而磷酸化的Tyr1173與EGFR的活性有關(guān)[5]。Hsu等制作了EGFR-Y1173F突變體(1173位的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?，發(fā)現(xiàn)含有突變體的細胞相比野生型細胞生長更快并且表現(xiàn)出更高的腫瘤形成能力。進一步證明了磷酸化的Tyr1173對EGFR信號通路的抑制作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染FRK質(zhì)粒后,EGFR-pY1173蛋白水平明顯上升，而EGFR蛋白水平無明顯變化(圖2B)，表明在膠質(zhì)瘤細胞中FRK可以促進Tyr1173殘基磷酸化。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達FRK促進了細胞凋亡，EGFR抑制了細胞凋亡，且轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒組的作用比轉(zhuǎn)染EGFR(WT)的效果更明顯，此外，轉(zhuǎn)染EGFR(Y1173F)質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)了過表達FRK對膠質(zhì)瘤細胞促凋亡的作用(圖4B)。以上結(jié)果表明通過對EGFR Tyr1173位點突變，可以逆轉(zhuǎn)FRK促進細胞凋亡的作用，提示FRK可以通過磷酸化EGFR Tyr1173殘基，促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示FRK通過磷酸化EGFR的Tyr1173殘基促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡。這一結(jié)果提示EGFR的Tyr1173殘基可能作為腦膠質(zhì)瘤治療的重要靶點，但其具體機制還需要進一步研究。

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(收稿2015-10-23 修回2016-02-01)

FRK promotes the apoptosis of glioma cells by regulating phosphorylation of EGFR-Y1173

ZHANGDao-Wei,SHIQiong,JINGe,etal.

TheGraduateSchool,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China

Correspondingauthor：GUOKe-qin

Objective To study whether FRK can promote the apoptosis of glioma cells by regulating phosphorylation of EGFR-Y1173.Methods The FRK plasmid was transfected into glioma U251 cells,transfection efficiency,the protein level and Y1173 phosphorylation of EGFR was exmined by western blot.The flow cytometry was used to examine the apoptosis of glioma cells.The EGFR(WT) and EGFR(Y1173F) plasmids were transfected to glioma U251 cells respectively,also the FRK,EGFR(WT) and EGFR(Y1173F) were co-transfected to glioma U251 cells,the apoptosis of glioma cells was tested by flow cytometry.Results The FRK plasmid was transfected into glioma U251 cells successfully,FRK over-expression promoted the apoptosis of glioma U251 cells.And FRK over-expression increased the EGFR-Y1173 phosphorylation,but had no effect on the protein level of EGFR.Also,the ability of glioma cells apoptosis was all decreased in EGFR(WT) and EGFR(Y1173F) over-expression group,and decreased by 25% and 75%,respectively.WB results showed,the FRK,EGFR(WT) and EGFR(Y1173F) plasmid were co-transfected into glioma U251 cells successfully.The flow cytometry results showed,the ability of glioma cells apoptosis was increased after FRK over-expression,but decreased in EGFR overexpression group,and the effect of EGFR(Y1173F) on glioma cells apoptosis showed stronger than EGFR(WT)’s. In addition,the promoting effect of FRK on glioma cells apoptosis was abolished after EGFR(Y1173F) plasmid transfection.Conclusion FRK can regulate the glioma cells apoptosis by promoting phosphorylation of EGFR-Y1173.

glioma;FRK;EGFR;apoptosis

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.01.006

國家自然科學基金(81372699，81472345，81402046)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(CXZZ13_0990)

221000 徐州，徐州醫(yī)學院研究生院(張道為，金戈，王軍，蔡暢，方震)；徐州醫(yī)學院神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究所(石瓊，周秀萍，于如同)；徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院神經(jīng)外科(石瓊，郭克勤，于如同)

郭克勤

R739.41

A

1672-7770(2017)01-0021-05