閆春宇，胡冰濤，王素英

(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津,300134)

常壓室溫等離子體誘變對螺旋藻中氨基酸成分的影響

閆春宇，胡冰濤，王素英*

(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津,300134)

旨在了解常壓室溫等離子體誘變處理對螺旋藻氨基酸含量及營養(yǎng)價值的影響。以TJF1為出發(fā)藻株，多功能等離子體誘變儀對藻株進(jìn)行誘變處理，日立L-8900氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成和含量，利用模糊識別法和氨基酸比值系數(shù)法對突變體與出發(fā)藻株的氨基酸營養(yǎng)價值進(jìn)行評價。結(jié)果表明：與出發(fā)藻株相比，15個突變株中的17種氨基酸含量均高于出發(fā)藻株，總氨基酸含量差異顯著；突變株的氨基酸含量分布與出發(fā)藻株保持一致；總必需氨基酸與總氨基酸含量比值(E/T)維持在0.43～0.45，沒有明顯變化；2種營養(yǎng)價值評價結(jié)果表明，等離子體誘變沒有降低氨基酸營養(yǎng)價值；突變株10的總氨基酸含量最高，比出發(fā)藻株高出53.52%，可以作為高產(chǎn)蛋白優(yōu)勢藻株。

螺旋藻；常壓室溫等離子體誘變；氨基酸；營養(yǎng)評價

螺旋藻[Spirulina(Arthrospira)]是一種多細(xì)胞原核藍(lán)藻，主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)的淡水或鹽堿湖泊[1]。它不僅富含蛋白質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸和微量元素，而且氨基酸種類齊全，必需氨基酸組成合理，易被人體吸收利用。此外，有些氨基酸還具有多種藥理活性，在調(diào)節(jié)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫和酶活性等方面發(fā)揮作用。因此螺旋藻是世界公認(rèn)的食藥同源功能性食品[2-3]。作為一種新型產(chǎn)業(yè)，目前雖有60多個國家養(yǎng)殖螺旋藻，但生產(chǎn)的螺旋藻粉主要作為飼料、餌料應(yīng)用，缺乏多元化的食用、藥用產(chǎn)品。其原因主要是養(yǎng)殖藻種單一，養(yǎng)殖過程中藻種退化現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致生長快、蛋白質(zhì)及其他活性物質(zhì)含量高的藻種匱乏。因此，利用誘變育種及相關(guān)技術(shù)改良現(xiàn)有螺旋藻品種，選育遺傳穩(wěn)定、單一功能性物質(zhì)含量豐富且高產(chǎn)的突變體勢在必行。

常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術(shù)是利用氦氣輝光放電形成的等離子射流中的各種活性粒子作用在微生物體上誘發(fā)突變[4]。該技術(shù)具有放電均勻穩(wěn)定，活性粒子濃度高，操作簡便，誘變快速，環(huán)境友好，安全無輻射，操作可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[5-8]，相關(guān)研究表明[5,9-10]，ARTP技術(shù)可以快速突變細(xì)菌、微藻、真菌、酵母等微生物，已成為獲得高產(chǎn)突變體的有效方法。如最早在2009年，WANG等應(yīng)用ARTP對阿維鏈霉菌進(jìn)行誘變，成功獲得阿維菌素產(chǎn)量提高 21%的突變菌株B1a，并且優(yōu)勢遺傳穩(wěn)定[11]。FANG[12]等在2013年利用ARTP誘變儀對藻株S.platensisFACHB-904誘變處理，同時采用高通量篩選出了生長速率提高10.5%的突變株，并且有2個突變株的含糖量分別提高了40.3%、78%，并且這種優(yōu)勢在不同的培養(yǎng)條件可以穩(wěn)定保持。

本實(shí)驗(yàn)利用多功能等離子體誘變儀對螺旋藻藻株進(jìn)行誘變，探討誘變對藻株氨基酸組成及含量的影響，并應(yīng)用模糊識別法和氨基酸比值系數(shù)比較誘變后的藻株與出發(fā)藻株的營養(yǎng)價值，旨在獲得氨基酸含量高、且組成合理的突變藻株，為螺旋藻養(yǎng)殖提供優(yōu)質(zhì)藻種。

1 材料與方法

1.1 誘變處理

以分離自津靜公路S110處自然池塘的螺旋藻藻株TJF1為出發(fā)藻株，利用多功能等離子體誘變儀對其進(jìn)行誘變，具體處理見表1。

1.2 螺旋藻培養(yǎng)及干藻粉制備

將誘變處理的藻株接種于AB培養(yǎng)基，在光照強(qiáng)度9 000lx，光暗比(12∶12) h，溫度(30/28)℃的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，1 500目絹紗過濾收集藻泥，用蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥24 h獲得干藻粉，4 ℃貯藏備用。

表1 誘變處理及藻株編號信息

注：TJF1為本實(shí)驗(yàn)室從津靜S110西自然塘分離純化出的純培養(yǎng)藻株。

1.3 氨基酸含量測定

準(zhǔn)確稱取0.020 0 g樣品于水解管中，6 mol/L鹽酸水解，參照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》[13]方法利用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行檢測。

1.4 氨基酸營養(yǎng)價值評價

1.4.1 模糊識別法

參照蘭氏距離法[14]定義待評價物質(zhì)u與標(biāo)準(zhǔn)蛋白模式a的貼近度U(a，u)，以反映待評價對象的營養(yǎng)價值，貼近度越接近1，表示物質(zhì)的營養(yǎng)價值越高。貼近度計(jì)算公式[15]如下：

(1)

式中:ak為標(biāo)準(zhǔn)蛋白模式的第k種EAA含量，1≤k≤7；uik為第i個評價對象的第k種EAA含量，1≤k≤7。

1.4.2 氨基酸比值系數(shù)法[16]

利用WHO/FAO必需氨基酸模式[17]，計(jì)算不同藻株必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)、比值系數(shù)分(SRC)。SRC作為評判物質(zhì)營養(yǎng)價值的指標(biāo)，表示物質(zhì)中蛋白質(zhì)的相對營養(yǎng)價值，SRC越接近100，說明物質(zhì)營養(yǎng)價值越高[16,18]。

(2)

(3)

SRC=100-RSD×100

(4)

RSD為RC的相對標(biāo)準(zhǔn)差。

表2 FAO/WHO模式蛋白中各必需氨基酸含量 單位：%

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變對氨基酸含量的影響

出發(fā)藻株及突變體的氨基酸測定結(jié)果如表3、表4所示。

表3 16株藻株氨基酸組成和含量 單位：mg/g

表4 16株藻株氨基酸組成和含量

注：*代表藥效氨基酸；E代表總必需氨基酸；T代表總氨基酸；同一列肩標(biāo)不同代表顯著性不同，P<0.05。

從測定結(jié)果可以看出，除色氨酸在樣品前處理過程中被破壞外，各突變藻株中均檢測到17種氨基酸，且氨基酸含量明顯高于出發(fā)藻株，不同處理之間氨基酸總量差異顯著，其中突變藻株10的總氨基酸含量最高，達(dá)到575.81mg/g，比出發(fā)藻株提高53.52%；突變株14的變化最小，氨基酸總量提高31.16%。所有突變株的各種氨基酸的含量分布與出發(fā)藻株保持一致，谷氨酸與天門冬氨酸含量最高，所占比例分別為15%～17%，10%～11%；組氨酸與半胱氨酸的含量最低，所占比例為1.6%～1.7%、0.2%～0.3%。對16藻株中的各個氨基酸成分進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)除脯氨酸外，其余氨基酸含量在不同藻株中的差異顯著(P<0.05)，對其進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表3。

對9種必需氨基酸作變異性分析，變異率見圖1。結(jié)合表3可以看出，異亮氨酸的變異幅度最大，突變株15的異亮氨酸含量最高，為26.59 mg/g，比原藻株高出75%；苯丙氨酸變異系數(shù)為10.48%，突變株10中苯丙氨酸達(dá)最高值，由原來的15.86 mg/g提高到26.87 mg/g；其余7種氨基酸變異幅度較小，變異系數(shù)在9.25～9.84之間。

圖1 9種必需氨基酸變異性Fig.1 The variability of 9 kinds of essential amino acids

突變株的總必需氨基酸(E)與總氨基酸含量(T)見圖2。從圖2中可以看出，藻株的總必需氨基酸(E)與總氨基酸(T)變化趨勢基本一致，E/T值保持在0.43～0.45之間，表明誘變處理對非必需氨基酸的影響不大。

圖2 16個藻株總氨基酸(T)與總必需氨基酸(E)含量折線圖Fig.2 The line chart of the total amino acids and total essential amino acid content in 16 strains

2.2 誘變對氨基酸營養(yǎng)價值的影響

2.2.1 必需氨基酸的RAA、RC及SRC分析

依據(jù)FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)模式譜，計(jì)算突變藻株及出發(fā)藻株必需氨基酸的RAA，結(jié)果見表5。計(jì)算RC與SRC值，結(jié)果見表6。

由表5可以看出：16個藻株中蘇氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸+酪氨酸(Phe+Tyr)的RAA值>1，表明這4種氨基酸相對過剩；纈氨酸(Val)、賴氨酸(Lys)的RAA值<1，低于模式氨基酸規(guī)定值。甲硫氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)與異亮氨酸(Ile)的RAA值在0.0.85～1.18之間。

比較9種必需氨基酸的RC值，可以看出誘變使得藻株的第一限制氨基酸有所變化。原藻株的第一限制氨基酸為賴氨酸(Lys)，編號1、2、11、14以及15的誘變藻株的第一限制氨基酸保持不變，其余藻株的第一限制氨基酸變?yōu)槔i氨酸(Val)。因此在商業(yè)化生產(chǎn)中可以根據(jù)蛋白質(zhì)互補(bǔ)原則，考慮不同藻株混合養(yǎng)殖，以提高藻粉的營養(yǎng)價值。

表5 必需氨基酸的RAA值

表6 16株螺旋藻的RC與SRC值

注：﹡代表第一限制氨基酸。

比較誘變藻株與原藻株的比值系數(shù)得分(SRC)，所有藻株得分均高于75，出發(fā)藻株得分最高為81.71。

2.2.2 與模式氨基酸的貼近度比較

依據(jù)模糊識別法提供的計(jì)算方式，得出各個藻株中的必需氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)FAO/WHO模式的貼近度，結(jié)果如表7所示。以FAO/WHO模式，得出突變藻株與原藻株蛋白質(zhì)中氨基酸營養(yǎng)排序?？梢钥闯?，15株誘變藻株，除了藻株5的貼近度為0.93外，其他14個藻株的貼近度均為0.94，通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，各個藻株的貼近度之間沒有顯著性差異(P<0.05)表明誘變處理對藻株中必需氨基酸組成沒有顯著性影響。

表7 對于模式氨基酸的貼近度

3 結(jié)果與討論

本研究比較了出發(fā)藻株與15株突變體的氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)突變藻株17種氨基酸含量均高于出發(fā)藻株；總氨基酸含量依次比對照高出48%、34%、40%、35%、48%、41%、35%、41%、46%、54%、35%、38%、33%、31%、50%；誘變處理使得9種必需氨基酸含量也顯著提高，突變株必需氨基酸與總氨基酸比值(E/T)的均值為44.4%，與出發(fā)藻株的E/T(44.4%)保持一致，均符合FAO/WHO規(guī)定值，表明本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的誘變處理沒有影響藻株?duì)I養(yǎng)平衡性。

食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸的組成決定了其營養(yǎng)價值的高低，組成比例越接近人體所需氨基酸比例，越容易使人體吸收，營養(yǎng)價值越高。依據(jù)氨基酸平衡理論，通過氨基酸比值系數(shù)法與模糊識別法2種方法評價藻株的營養(yǎng)價值，發(fā)現(xiàn)誘變不僅提高了突變體各種必須氨基酸的含量，而且保持了螺旋藻氨基酸營養(yǎng)價值較高的特點(diǎn)。

突變藻株10與15的總氨基酸含量變化最大，分別比出發(fā)藻株高出54%、50%；必需氨基酸含量為(259.35±0.09)、(255.04±5.62) mg/g；9種藥效氨基酸含量分別為364.489、359.449mg/g。比較這2個突變株的氨基酸營養(yǎng)價值，盡管氨基酸比值系數(shù)得分(SRC)突變株15為78.68高于突變株10(75.90)，但是與模式氨基酸的貼近度均為0.94，因此可以優(yōu)先考慮突變株10作為高產(chǎn)蛋白質(zhì)藻株應(yīng)用于養(yǎng)殖。

另外與出發(fā)藻株相比，突變藻株10的藥效氨基酸含量明顯提高，如作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑，用于配制氨基酸輸液、調(diào)劑和氨基酸營養(yǎng)食品的主要成份苯丙氨酸的含量提高了69%；可以加速體內(nèi)脂肪氧化分解[19-21]，已開始作為一種膳食補(bǔ)充劑在臨床上輔助減肥的亮氨酸的含量提高了60%；通過參與淋巴細(xì)胞內(nèi)的代謝過程發(fā)揮細(xì)胞免疫作用，在免疫防御和免疫調(diào)節(jié)、維持和保護(hù)腸道黏膜功能及腫瘤特異性免疫方面發(fā)揮重要作用[22]，并能夠?qū)ν砥趯?shí)體瘤營養(yǎng)不良患者進(jìn)行營養(yǎng)支持，有助于增加蛋白質(zhì)合成，減緩因腫瘤引起的蛋白質(zhì)消耗[23]的精氨酸的含量提高59%；改善心肌收縮功能，降低氧消耗，在冠狀動脈循環(huán)障礙缺氧時，對心肌有保護(hù)作用[24]，同時通過參與鳥氨酸循環(huán)，促進(jìn)氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強(qiáng)肝臟功能，消除疲勞的作用，治療肝臟病和膽汁分泌障礙[25]的天冬氨酸的含量提高了57%。由此可見突變藻株10可以作為藥用螺旋藻產(chǎn)品生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)藻株。

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The influence of atmospheric and room temperature plasma mutation on the nutritional value ofSpirulina

YAN Chun-yu, HU Bing-tao ,WANG Su-ying*

(The Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, Institute of Biotechnology and Food Science of Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134,China)

The aim was to study the influence of atmospheric and room temperature plasma mutation on amino acid contents and nutritional value ofSpirulina. The original strain (TJF1) was treated by multifunctional plasma mutation system(MPMS) , and the amino acid content and composition of all strains are tested by L-8900 type amino acid analyzer, fuzzy distinguish method and amino acid ratio coefficient method are adopted to evaluate the amino acid nutritional values of the mutant strains and the original strain.The result indicates that the contents of 17 kinds of amino acids in all the mutant strains are higher than the original strain; the difference of total amino acid content between mutated and unmutated strains is significant; the distribution of the amino acid content of the mutant strains remain consistent with the original strain; the ratio of total essential amino acids and total amino acid content is 0.43～0.45,but the difference is not significant; the result of nutrition evaluation showed that atmospheric and room temperature plasma mutation did not reduced amino acid nutritional values; the total amino acid content of mutant strain No.10 is the highest, with 53.52% higher than the original strain. According to the research, the mutant strain No.10 can be used as the protein high-yielding mutant strain.

Spirulina; atmospheric and room temperature plasma(ARTP); amino acid; nutritional evaluation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701011

碩士研究生(王素英教授為通訊作者,E-mail:wsuying@tjcu.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(No. 31270050)；天津市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No.TD12-5049)

2016-01-08，改回日期：2016-05-26