丁海琴+曾祥玲+王艷麗+鄭日如+王彩云

摘要：以花煙草（Nicotiana forgetiana）無菌苗植株的葉片為材料，研究不同NAA和6-BA組合培養(yǎng)的再生體系，得到最佳培養(yǎng)基配方為NAA濃度為0.1 mg/L和6-BA濃度為1.5 mg/L， 此時再生率達(dá)97%、平均芽數(shù)達(dá)8.65。以卡那霉素（Km）、頭孢霉素（Cef）為篩選試劑，探討了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花煙草遺傳轉(zhuǎn)化因素，表明卡那霉素敏感性濃度為20 mg/L、頭孢霉素抑菌濃度為300 mg/L，在菌液OD600 nm為0.2～0.4時最適侵染時間為5 min；最適篩選培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）、壯芽培養(yǎng)基Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）、生根培養(yǎng)基S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。以最佳組合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，獲得的生根苗經(jīng)煉苗移栽后存活35個株系，用CTAB法提取植物組織DNA，經(jīng)PCR檢測證實(shí)外源基因已轉(zhuǎn)入植物組DNA中，陽性率為71%。

關(guān)鍵詞：花煙草（Nicotiana forgetiana）；再生體系；根癌農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化體系

中圖分類號：S681.9；Q813.1；Q813.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5384-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.055

Abstract： Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants， the effects of different concentrations of naphthalene-acetic acid（NAA） and 6-benzylamino purine（6-BA） to the regeneration system were explored. Results showed that optimum medium for the highest differentiation rate amounting to 97% and number of per buds up to 8.65 was MS medium with supplement of 0.1 mg/L Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants，the effects of different concentrations of naphthalene-acetic acid（NAA） and 6-benzylamino purine（6-BA） on the leaf regeneration were analyzed. On the basis of the regeneration medium，the factors affecting the genetic transformation efficiency，such as Kanamycin（Km），Cefotaxime（Cef） and infection duration，were studied. Results suggested that the optimal concentration of Km for callus selecting was 20 mg/L，300 mg/L Cef could control the agrobacterium pollution and suitable infection duration was 5 min. The optimal medium for selecting（MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km），induction（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km） and rooting（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km） were also selected. Finally，35 transferred plants were obtained，and PCR analysis indicated that the exogenous gene had been integrated into the genome of transformed Nicotiana forgetiana.

Key words：Nicotiana forgetiana； regeneration system； Agrobacterium tumefaciens； genetic transformation system

花煙草（Nicotiana forgetiana）又稱福吉特士煙草，起源于澳大利亞和北美洲[1]，與煙草（Nicotiana tabacum L.）、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）等同為茄科煙草屬植物。其株型較小，株高1 m左右，花朵美麗，花色為穩(wěn)定的洋紅色，從初夏至降霜均可開放，具有較高的觀賞價值，可在園林中普遍應(yīng)用[2]。國外的報道主要包括其自交不親和機(jī)理的研究[3]、與煙草屬中多種野生種共同作為比較基因組學(xué)[4]、傳粉生物學(xué)[5]、形態(tài)進(jìn)化學(xué)[6]的重要研究對象等，如Bissell等[7]研究了煙草屬N. forgetiana與N.alata兩個物種的花朵形態(tài)學(xué)遺傳規(guī)律。但因花煙草的自交不親和性，通常需要人工授粉獲得后代[8]，較耗費(fèi)時力，而組培再生能夠?yàn)槠浍@得大量材料提供簡單可靠的途徑。

自Horseh等[9]首次以煙草為材料獲得轉(zhuǎn)基因植株以來，越來越多不同植物材料的遺傳轉(zhuǎn)化得以研究和應(yīng)用[10，11]，為不同需求的基因功能分析提供了有效途徑[12，13]。普通煙草、本氏煙草等的再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系不斷更新完善[14-17]，成為觀賞植物，尤其是木本觀賞植物轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證的模式材料[18，19]。但是普通煙草的株型較大，占地多，不便于整體的開花調(diào)控；其花色易受光照、溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，容易干擾花色相關(guān)基因的結(jié)果[20]。相比而言，花煙草株型較小，花色為穩(wěn)定的花煙草，便于管理和花色相關(guān)基因研究，但是至今鮮見其再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系的報道。因此，以花色穩(wěn)定且株型較小的觀賞花煙草為材料，建立其再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，可為觀賞植物花色基因的研究提供一種新的轉(zhuǎn)基因模式材料。

1 材料與方法

1.1 材料

花煙草無菌苗，來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所建立的無菌苗株系，以40～50 d的花煙草葉片作為轉(zhuǎn)化的受體材料。

MYB目的基因來源于桂花（Osmanthus fragrance），供試質(zhì)粒為pCAMBIA2300s，含CaMV35S啟動子及卡那霉素抗性基因；轉(zhuǎn)化受體菌株為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。檢測正向引物為35S-F：ACGCACAATCCCACTATCCTTC。

頭孢霉素（Cef）、卡那霉素（Km）、利福平（Rif）采用過濾滅菌，生長素NAA、細(xì)胞分裂素6-BA均用121 ℃下高溫高壓蒸汽滅菌。農(nóng)桿菌培養(yǎng)基主要有LB+Km固體培養(yǎng)基、LB+Km+Rif液體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基。

1.2 再生培養(yǎng)基的篩選

將40～50 d的無菌苗葉盤，接種于不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合（A-F）的培養(yǎng)基（表1），在（25±2） ℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)，每個處理30個外植體， 30 d后統(tǒng)計再生率和平均芽數(shù)。

不定芽再生率=再生不定芽的外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100（%）；平均芽數(shù)=外植體再生不定芽總數(shù)/再生不定芽外植體總數(shù)。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

1.3.1 抗生素敏感性試驗(yàn)及頭孢霉素抑菌濃度的確定 卡那霉素濃度篩選：配制卡那霉素0、10、20、30、40和50 mg/L的再生培養(yǎng)基，將30～50 d的無菌苗葉盤接種于不同的培養(yǎng)基上，在（25±2） ℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計不定芽再生率和平均芽數(shù)。

頭孢霉素抑菌濃度的確定。配置頭孢霉素100、200、300、400 mg/L及20 mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基。葉盤侵染5 min后接種于不同的培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計菌落和葉盤再生情況。

1.3.2 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與菌液準(zhǔn)備 在含卡那霉素的固體培養(yǎng)基上平板劃線，避光培養(yǎng)3 d。挑取單克隆置于含Km和Rif的LB液體培養(yǎng)基中（5 mL），28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色由酒紅色變?yōu)槌燃t色。再進(jìn)行繼代培養(yǎng)，取1 mL菌液于50 mL培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色由酒紅色變?yōu)闇\橙紅色，用分光光度計測定OD600 nm，OD600 nm為0.2～0.4左右可用。將菌液置于50 mL無菌的離心管4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入50 mL MS液體培養(yǎng)基，振蕩使菌液重懸，28 ℃條件下200 r/min培養(yǎng)1 h即可。

1.3.3 葉盤的侵染 將無菌苗葉盤在重懸后的菌液中進(jìn)行侵染，侵染時間設(shè)置梯度為2、5、8和 11 min，侵染完成后，用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，暗培養(yǎng)3 d。

1.3.4 侵染后的培養(yǎng) 暗培養(yǎng)完成后，用含有Cef（300 mg/L）的無菌水清洗葉片8 min，再用無菌水清洗2～3遍，無菌濾紙吸干后，放入篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每隔15 d繼代1次，直到長出小芽，再放入壯芽培養(yǎng)基（Z1、Z2）中培養(yǎng)。Z1（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。小芽長出3～4片葉時，切下放入生根培養(yǎng)基（S1、S2）中培養(yǎng)。S1（1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。培養(yǎng)室設(shè)置為（25±2） ℃、16 h/d光照。

1.3.5 生根苗的煉苗及移栽 將已生根且根長約2～3 cm、株高3～4 cm的葉片鮮綠組織培養(yǎng)壯苗帶瓶移到光照培養(yǎng)箱中，選擇光照適中的區(qū)域打開瓶蓋，進(jìn)行2～3 d光適應(yīng)。然后將根洗凈移栽于裝有基質(zhì)的小缽中，基質(zhì)全部用清水浸濕，第一次澆水澆透，之后每隔2～3 d澆水1次，使基質(zhì)見干見濕，至新根新葉發(fā)出，即移栽成活。

1.4 轉(zhuǎn)基因花煙草的PCR檢測

取篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株葉片，采用CTAB法提取植物組織總DNA，用CaMV35S啟動子上游引物和MYB目的基因下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為5 μL Es Taq Mix、35S-F和MYB-R各0.5 μL、1 μL DNA模板、3 μL去離子水。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 S，60 ℃退火30 S，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。設(shè)置供試質(zhì)粒為陽性對照，野生型花煙草為陰性對照，計算陽性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對葉盤再生的影響

30 d后統(tǒng)計葉片再生情況發(fā)現(xiàn)，葉盤在NAA和6-BA不同濃度配比的培養(yǎng)基中再生率差別較大（表2、圖1）。其中，B組合即當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L、6-BA濃度為1.5 mg/L時，誘導(dǎo)效果最好，再生率達(dá)97%，平均芽數(shù)達(dá)8.65。葉盤1周左右開始誘導(dǎo)形成愈傷組織，2周后開始分化形成芽點(diǎn)，4周后芽點(diǎn)萌發(fā)形成整齊一致的叢生芽，適合作為遺傳轉(zhuǎn)化材料。

2.2 卡那霉素敏感性濃度及頭孢霉素（Cef）抑菌濃度的確定

在預(yù)試驗(yàn)階段，用50、100 mg/L的卡那霉素濃度進(jìn)行篩選比較，花煙草葉盤在培養(yǎng)至20 d時已全部褐化。在此基礎(chǔ)上設(shè)計含有0、10、20、30、40和50 mg/L卡那霉素再生培養(yǎng)基進(jìn)行篩選比較。結(jié)果表明，花煙草葉盤對卡那霉素反應(yīng)比較敏感（表3、圖2）。當(dāng)卡那霉素濃度為20 mg/L時，愈傷組織褐變率為90.9%，出芽率為2.0%，極少部分葉盤及愈傷組織能夠維持綠色，并分化出部分綠芽。當(dāng)卡那霉素濃度大于20 mg/L時，葉盤基本全部褐化，無法分化出綠芽。一般確定篩選濃度要略低于臨界致死濃度，因此，本試驗(yàn)確定卡那霉素敏感性濃度為20 mg/L。

當(dāng)頭孢霉素濃度為300 mg/L時，基本能夠抑制農(nóng)桿菌的生長，且再生率最高為71.0%，當(dāng)其濃度繼續(xù)升高時，葉盤再生率下降，說明頭孢霉素濃度過高時會抑制葉盤的生長（表4）。因此選擇300 mg/L作為頭孢霉素抑菌的適宜濃度。

2.3 農(nóng)桿菌菌液侵染時間的確定

侵染時間是影響農(nóng)桿菌侵染效果的重要因素，前人的研究中侵染時間從30 s到30 min均有采用[21]，其差異可能源于品種基因型不同。在菌液濃度基本一致（OD600 nm為0.2～0.4）的情況下，參照普通煙草的最佳侵染時間，設(shè)計梯度為2、5、8、11 min進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，侵染時間以5 min為宜，當(dāng)侵染時間過短時，農(nóng)桿菌無法有效附著，則會降低轉(zhuǎn)化植株的陽性率，當(dāng)侵染時間過長時，葉盤容易被農(nóng)桿菌污染，并可能在長時間內(nèi)產(chǎn)生反菌現(xiàn)象，影響葉盤愈傷組織的形成和綠芽的分化（圖3）。

2.4 壯芽、生根培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1 壯芽培養(yǎng)基的優(yōu)化 一般而言，篩選培養(yǎng)基分化出的小芽在壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，更容易生根存活。在預(yù)試驗(yàn)階段已經(jīng)篩選出兩種待選壯芽培養(yǎng)基，分別為Z1（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。培養(yǎng)15 d后，兩種培養(yǎng)基中小芽的生長狀況見表5。Z1培養(yǎng)基中小芽能夠繼續(xù)生長，部分帶葉盤或愈傷組織的小芽能夠持續(xù)分化，形成更多的小芽，但是生根率較低。Z2培養(yǎng)基中大部分小芽開始生根，但是根系并不發(fā)達(dá)。Z2培養(yǎng)基生根率更高，效果更好，因此選擇Z2用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.4.2 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用兩種生根培養(yǎng)基S1（1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。結(jié)果表明，雖然兩者的生根率都偏低，而且生根緩慢，但是S2的生根率明顯高于S1，且S2培養(yǎng)基中的小芽生長相對較快，小芽褐化率低（表6），選定S2作為生根培養(yǎng)基。

2.5 轉(zhuǎn)基因花煙草的分子檢測

用CTAB法提取經(jīng)生根培養(yǎng)基篩選獲得的部分抗性單株的DNA，并用PCR擴(kuò)增法進(jìn)行陽性檢測（圖4）。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化植株DNA中擴(kuò)增出單一的目的條帶，大小與預(yù)測大小一致；而未轉(zhuǎn)化植株則沒有，證實(shí)外源基因已轉(zhuǎn)入花煙草DNA中。在經(jīng)生根培養(yǎng)獲得的35個抗性株系中，陽性株系為25個，陽性率為71.0%。

3 小結(jié)與討論

本研究初步建立了花煙草再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系。與普通煙草相比，其再生率、各種植物生長調(diào)節(jié)劑使用濃度和比例、卡那霉素敏感性濃度、篩選濃度、侵染時間及生根率等都有差別[14-17]。NAA和6-BA的濃度比例是葉片再生和芽萌發(fā)率的關(guān)鍵，對于不同植物種類或品種，兩者的濃度比例呈現(xiàn)不同的效果。當(dāng)NAA為0.1 mg/L，6-BA為1.5 mg/L時，花煙草的誘導(dǎo)效果最好，再生率達(dá)97%，平均芽數(shù)達(dá)8.65。當(dāng)6-BA不變而NAA濃度升高時，再生率和平均綠芽數(shù)呈下降趨勢。相比常用的普通煙草再生體系0.3 mg/L NAA與2.25 mg/L 6-BA，其濃度較低，6-BA與NAA的比例較高[16]。而與本氏煙草再生體系NAA 0.1 mg/L、6-BA 1.5 mg/L的比例基本一致，這可能與植物不同的基因型相關(guān)[15]。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，所構(gòu)建的載體、篩選濃度等因素對植物的轉(zhuǎn)化效率有很重要的影響[21，22]。其中，載體的影響尤為重要，因不同載體其所攜帶的篩選抗生素的種類不同，而試驗(yàn)選用的篩選抗生素的種類在很大程度上決定了轉(zhuǎn)化效率的高低。在有關(guān)煙草屬轉(zhuǎn)化的報道中，大部分遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)采用以卡那霉素為篩選抗生素的載體，篩選效果良好[14，16，17]。本研究采用以卡那霉素為篩選抗生素的載體，獲得卡那霉素最適篩選濃度為20 mg/L，與普通煙草相比，其對卡那霉素的敏感性較高，篩選濃度較低。此外，采用頭孢霉素為抑菌試劑，獲得適宜抑菌濃度為300 mg/L。與普通煙草使用的400 mg/L相比，濃度偏低[16]。

在篩選壯芽、生根培養(yǎng)基的試驗(yàn)中，低濃度的NAA和6-BA促進(jìn)小芽在壯芽培養(yǎng)基上產(chǎn)生部分根系，全MS營養(yǎng)比1/2MS營養(yǎng)供給更有利于植株產(chǎn)生發(fā)達(dá)的根系。一般而言，轉(zhuǎn)基因植株會因難以生根而較難存活，會在一定程度上阻礙試驗(yàn)的整體進(jìn)展，也會降低遺傳轉(zhuǎn)化體系的穩(wěn)定性[21]。在煙草屬的遺傳轉(zhuǎn)化中較理想繁榮其生根率和移栽存活率達(dá)到了90%以上[17]，而本試驗(yàn)的2種生根培養(yǎng)基中植株的生根率都相對較低，對生根培養(yǎng)基以及提高移栽成活率需要進(jìn)一步研究。

本研究初步建立了花煙草再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系。在再生體系中，適宜組合為0.1 mg/L NAA與1.5 mg/L 6-BA。在遺傳轉(zhuǎn)化體系中，卡那霉素敏感性濃度為20 mg/L，抑菌抗生素頭孢霉素為300 mg/L，在菌液侵染濃度OD600 nm為0.2～0.4時，適侵染時間為5 min。最適篩選培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km，最適壯芽培養(yǎng)基為MS+0.01 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km，最適生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km。獲得的生根苗經(jīng)煉苗移栽后存活35個株系，用CTAB法提取植物組織DNA，經(jīng)PCR檢測初步證實(shí)外源基因已轉(zhuǎn)入植物組DNA中，本研究為后續(xù)的MYB基因功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

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