寧娜??+韓建軍??+胡宇莉++鄒宗堯??+郁建生

摘要：采用蛇床子素作為原料，通過酶法從蛇床子中提取蛇床子素，并以蛇床子素提取率為指標(biāo)，研究料液比、酶種類、酶用量等因素的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取酶用量、酶解溫度、酶解時間以及酶解pH值進(jìn)行了4因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計。結(jié)果表明，最優(yōu)提取條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時間125 min、酶解pH值4.6，在此條件下蛇床子素的提取率可達(dá)95.13 %。

關(guān)鍵詞：蛇床子；蛇床子素；復(fù)合酶；提??；響應(yīng)曲面法

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0169-05

床子為傘形科植物蛇床[Cnidium monnieri （L.） Cuss.]的干燥成熟果實，具有燥濕祛風(fēng)、殺蟲止癢、溫腎壯陽之功效，臨床上用于陰癢帶下、宮冷不孕等癥[1]。蛇床子中含有香豆素類[2]、酚苷類[3]、揮發(fā)油[4]等多種化學(xué)成分，其中蛇床子素是蛇床子藥材的質(zhì)控成分[1]。體內(nèi)藥理研究表明蛇床子素具有抗炎[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、降血糖[7]等活性。

目前已報道的從蛇床子中提取蛇床子素的方法主要有乙醇回流法[8-9]、超聲法[10]、微波法[11]等。生物酶解技術(shù)是通過生物酶破壞植物細(xì)胞壁從而促進(jìn)有效成分提取，該方法具有提取效率高、反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)且易于控制等優(yōu)點(diǎn)[12-14]。現(xiàn)在越來越多的研究將生物酶解技術(shù)應(yīng)用于中藥有效成分的提取中，以達(dá)到提高有效成分的提取率、縮短提取時間、減少提取溶劑用量等目的[15-17]。采用生物酶解技術(shù)提取蛇床子中蛇床子素的研究尚未見報道。本研究采用生物酶提取蛇床子中蛇床子素成分，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化該提取工藝，為蛇床子中蛇床子素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

蛇床子藥材購于河北安國中藥材市場，經(jīng)鑒定為傘形科植物蛇床子[Cnidium monnieri （L.） Cuss.]的干燥成熟果實；蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶（酶活性為22 000 U/g）購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；水為重蒸水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀（手動進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、四元泵、DAD檢測器和Agilent ChemStation 色譜工作站），美國Agilent公司生產(chǎn)；SK8200H 超聲清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn)；pHS-3C精密pH計，上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn)；METTLER AE240型十萬分之一電子天平，德國梅特勒公司生產(chǎn)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；FZ102微型植物粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1HPLC法測定蛇床子素的含量

1.2.1.1色譜條件Agiletn Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 ×250.0 mm2）；流動相：乙腈/水（65/35，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：322 nm；進(jìn)樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數(shù)以蛇床子素峰計算不低于3 000。該色譜條件下測定蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品及蛇床子藥材得到的色譜圖見圖1。

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱定蛇床子素對照品 12.5 mg 置于25 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻，分別精確量取此溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述所配制的對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定。以測得的峰面積y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛇床子素質(zhì)量濃度在5～50 μg/mL 范圍時，線性方程為y=18 467.46x-3 362.07，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，線性良好。

1.2.1.3蛇床子藥材中蛇床子素的含量測定本研究所用的蛇床子藥材按照《中國藥典》2010版一部蛇床子項下方法進(jìn)行含量測定，表明本試驗中所用蛇床子藥材中蛇床子素的含量為1. 65%。

1.2.2蛇床子素的提取及提取率的計算取干燥的蛇床子藥材用中藥材粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，取10 g 蛇床子粉末加入一定量的生物酶后，再按照一定的料液比加入蒸餾水，在一定溫度、pH值條件下酶解一定時間后，過濾，收集提取液，并將所得提取液濃縮后，用無水乙醇定容至100 mL，備用。用移液管精密吸取上述定容后的蛇床子提取液0.7 mL轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，所得溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液10 μL按照上述色譜條件進(jìn)行測定，并根據(jù)峰面積計算蛇床子素的提取率。蛇床子素提取率的計算公式：蛇床子素提取率=提取出的蛇床子素質(zhì)量/蛇床子藥材中蛇床子素質(zhì)量×100%。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1酶種類對蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，分別加入酶用量為10 mg/g的纖維素酶、果膠酶、復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2），在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時間120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與單一酶相比，由不同比例的纖維素酶和果膠酶組合成的復(fù)合酶對蛇床子中蛇床子素均有較好的提取效果。當(dāng)纖維素酶和果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合用于酶解提取時，蛇床子素的提取率最高，因此選用復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）提取蛇床子素。

2.1.2料液比對蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，按照不同料液比（1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]40、1 ∶[KG-*3]50，g ∶[KG-*3]mL）加入蒸餾水，在復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時間120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，料液比小于1 g ∶[KG-*3]30 mL時，蛇床子素提取率隨著溶劑用量的增加而增大。當(dāng)料液比為1 g ∶[KG-*3]30 mL時蛇床子素提取率達(dá)到最大，此后隨著溶劑用量的進(jìn)一步增加，蛇床子素提取率呈下降趨勢。這是由于過多的溶劑會使提取溶液中生物酶的有效濃度降低，同時，提取溶劑用量過大也會增加后續(xù)濃縮過程的工作量。因此提取溶劑的料液比選定為1 g ∶[KG-*3]30 mL。

2.1.3酶用量對蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，加入一定量的由纖維素與果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合成的復(fù)合酶（6、8、10、12、14 mg/g），在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時間120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，酶用量在6～10 mg/g時，蛇床子素提取率隨酶用量的增加而明顯升高，當(dāng)酶用量超過10 mg/g時，蛇床子素提取率增加的趨勢有所平緩。因此酶用量宜選擇在 10 mg/g 左右。

2.1.4酶解溫度對蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0，在一定酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）下酶解120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)酶解溫度低于50 ℃時，蛇床子素提取率隨著酶解溫度的升高而增加，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃時，蛇床子素提取率達(dá)到最大。隨著酶解溫度的進(jìn)一步升高，蛇床子素提取率有所下降。這是因為低于生物酶的最適溫度時，溫度升高可促進(jìn)生物酶活性的增強(qiáng)，而高于生物酶的最適溫度時可引起酶蛋白的變性，從而降低生物酶的催化活力。因此酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

2.1.5酶解時間對蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，在復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為 50 ℃ 的條件下酶解一定時間（60、120、180、240、300 min）后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，酶解時間在60～120 min時，蛇床子素提取率隨著酶解時間延長而明顯升高。當(dāng)酶解時間超過120 min時，蛇床子素提取率增加的趨勢有所平緩。因此酶解時間宜選在120 min左右。

2.1.6酶解pH值對蛇床子素提取率的影響準(zhǔn)確稱取 10 g 蛇床子粉末，加300 mL蒸餾水，復(fù)合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃，在一定pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）的條件下酶解120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結(jié)果見圖7。

2響應(yīng)面分析響應(yīng)曲面陡峭程度可反映各個因素及因素交互作用對蛇床子素提取率影響的強(qiáng)弱。由圖8可知，在各個因素中，酶用量對蛇床子素提取率的影響最大，酶解pH值的影響次之，酶解溫度和酶解時間的影響均較小；交互作用中，酶用量與酶解溫度、酶解溫度和酶解pH值的交互作用對蛇床子素提取率影響較強(qiáng)，而酶用量與酶解時間、酶用量與酶解pH值、酶解溫度與酶解時間、酶解時間與酶解pH值交互作用的影響較弱，與上述方差分析結(jié)果一致。

2.2.3最佳工藝條件及模型驗證經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，得到酶法提取蛇床子中蛇床子素的最佳工藝條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.44 mg/g、酶解溫度45.99 ℃、酶解時間124.64 min、酶解pH值4.58，蛇床子中蛇床子素的理論提取率為95.43%。為驗證方法的可行性，采用上述條件對蛇床子中蛇床子素進(jìn)行提取，考慮到試驗操作的可控性，將得到的優(yōu)化條件修正為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時間 125 min、酶解pH值4.6，進(jìn)行3組平行試驗，測定蛇床子素的實際平均提取率為95.13 %，試驗結(jié)果與模型預(yù)測相對誤差僅為 0.3%，較為接近，驗證了響應(yīng)曲面法回歸模型的合理性。通過本試驗結(jié)果與已經(jīng)報道的文獻(xiàn)結(jié)果[8-11]對比，可知生物酶解技術(shù)可有效提高蛇床子中蛇床子素的提取率，不僅可減少有機(jī)溶劑的使用，同時極大地縮短了提取時間，可為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

3結(jié)論

通過單因素試驗、Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，得到優(yōu)化的酶法提取蛇床子中蛇床子素的工藝提取條件為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時間125 min、酶解pH值 4.6，在此條件下蛇床子素的提取率可達(dá)95.13 %，

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