文 飛，母應(yīng)春，李靜雯，趙 旭，唐素婷，楊旭卉，蘇 偉*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

羊肝蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究

文 飛，母應(yīng)春，李靜雯，趙 旭，唐素婷，楊旭卉，蘇 偉*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

為優(yōu)化羊肝蛋白酶解工藝條件及探討其體外抗氧化活性，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用堿性蛋白酶酶解羊肝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化羊肝蛋白的酶解工藝條件。結(jié)果表明，羊肝蛋白最佳酶解條件為酶解溫度51℃、pH 8.5、酶解時(shí)間4.1 h、加酶量0.40%。在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得羊肝酶解液實(shí)際水解度為（40.31±0.24）%。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，羊肝酶解產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，其清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）和DPPH自由基的IC50值分別為17.01 mg/mL、13.21 mg/mL和10.42 mg/mL，并具有一定的還原能力。

羊肝；蛋白；酶解；抗氧化活性

我國(guó)每年對(duì)羊肉的需求量達(dá)數(shù)百萬噸，隨著對(duì)羊肉需求量和羊肉加工企業(yè)的增多，羊肉加工過程不可避免產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物常被加工成飼料或被丟棄，不僅產(chǎn)品附加值低，而且污染環(huán)境，資源未得到充分利用。羊肝為羊肉加工過程中的副產(chǎn)物之一，其營(yíng)養(yǎng)豐富，除含蛋白質(zhì)外，還含有鐵、磷、鈣、尼克酸及維生素A等營(yíng)養(yǎng)元素，并具有明目和止血的作用[1-2]。因此，如何對(duì)羊肝進(jìn)行深加工，提高其附加值是亟待解決的問題。

酶解法制備蛋白因其反應(yīng)時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和可控、水解效率高等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于多肽的制備。KECHAOU E S等[3-5]分別通過酶解內(nèi)臟的方式獲得了生物活性肽；劉旺旺等[6]利用微生物發(fā)酵法制備羊胎盤多肽的工藝及體外清除自由基能力的研究；韓志慧等[2]以羊肝為原料，研究了制作羊肝羹的工藝。而優(yōu)化羊肝酶解條件及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性方面的報(bào)道鮮見。

隨著人工合成抗氧化劑的使用，如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）和丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）對(duì)機(jī)體雖能起到一定的抗氧化作用，但研究表明，人工合成抗氧化劑存在不安全性，使用過量會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致癌作用，因此，利用酶解技術(shù)來制備安全、高效的天然抗氧化劑成為了研究熱點(diǎn)。王艷梅等[7]利用堿性蛋白酶酶解黃緣盒龜肉，研究其體外抗氧化活性，得到的酶解產(chǎn)物具有良好地清除羥基自由基、超氧陰離子、DPPH自由基和過氧化氫能力，還具有一定的還原能力、亞油酸氧化抑制能力。尹利瑞等[8]采用蛋白酶酶解鯉魚魚鱗得到具有清除DPPH自由基、羥基自由基能力和一定還原能力的膠原蛋白肽。徐懷德等[9]分別利用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶來酶解甲魚蛋白，得到3種酶解產(chǎn)物都具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥基自由基能力和還原能力。

為提高羊肉加工過程中副產(chǎn)物資源利用率，本研究以羊肝為原料，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化羊肝蛋白酶解工藝條件，并研究其酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性，以期為羊肝副產(chǎn)物的深加工及提高羊肝資源加工利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肝：貴州省晴隆縣海權(quán)清真肉羊食品加工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國(guó)Sigma公司；中性蛋白酶（酶活力40萬U/g）、Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，酶活力40萬U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力80萬U/g）、胰蛋白酶（酶活力4萬U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax-190酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；LGJ-10D冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)有限公司；SER148脂肪測(cè)定儀：意大利威爾普儀器有限公司；KDN系列消化爐、KDN-08系列凱氏定氮儀：浙江托普科學(xué)儀器有限公司；SX-4-10型箱式電阻爐：天津泰斯特儀器公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 羊肝酶解液的制備工藝流程

1.3.2 蛋白酶種類的篩選

選擇中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)羊肝進(jìn)行單酶酶解，并根據(jù)酶制劑使用說明，在各蛋白酶最適pH值和酶解溫度條件下進(jìn)行水解，分別考察中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)羊肝蛋白水解度的影響。4種酶最適酶解條件見表1。

表1 羊肝蛋白酶解工藝參數(shù)Table 1 Enzymatic hydrolysis process parameters of sheep liver proteins

1.3.3 單因素試驗(yàn)

利用1.3.2節(jié)中篩選出來的堿性蛋白酶對(duì)羊肝進(jìn)行酶解。在料液比1∶3（g∶mL）條件下，研究酶解時(shí)間（1h、2h、3h、4 h、5 h、6 h）、酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）、pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）和加酶量（酶與底物質(zhì)量比）（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對(duì)羊肝蛋白水解度的影響。

1.3.4 蛋白水解度測(cè)定

羊肝酶解液中氨基氮含量和羊肝樣品中總氮含量分別采用甲醛電位滴定法[10]和凱氏定氮法測(cè)定，水解度（degree of hydrolysis，DH）計(jì)算公式如下：

1.3.5 分析檢測(cè)方法

蛋白質(zhì)的測(cè)定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)測(cè)定》中凱氏定氮法；脂肪的測(cè)定：參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》中索氏抽提法；水分的測(cè)定：參照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法；灰分的測(cè)定：參照GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》中灼燒法。

1.3.6 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酶解溫度（X1）、pH（X2）、酶解時(shí)間（X3）、加酶量（X4）為自變量，水解度（Y）為響應(yīng)值，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見表2。

表2 酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for enzymatic hydrolysis conditions optimization

1.3.6 羊肝酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定[10]

取一定量羊肝凍干粉于試管中用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度羊肝酶解液。準(zhǔn)確稱取7.92 mg DPPH，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶解并定容至100 mL，配制成0.2 mmol/mL DPPH-乙醇溶液。取羊肝酶解液2.0 mL與2.0 mL DPPH乙醇溶液混合搖勻，常溫下避光反應(yīng)30 min后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)為Ai；再取羊肝酶解液2.0 mL與2.0 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液混合搖勻，在波長(zhǎng)517 nm處的測(cè)定吸光度值，讀數(shù)計(jì)為Aj；取2 mL DPPH乙醇溶液加上2 mL蒸餾水混合搖勻測(cè)定波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值，讀數(shù)計(jì)為Ac；空白為2mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液加入2mL蒸餾水，調(diào)零。以維生素C（vitaminC，VC）為陽性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-(Ai－Aj)/Ac]×100%

1.3.7 羊肝酶解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測(cè)定

參照趙強(qiáng)忠等[12]的方法略微修改，采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱取37.8 mg鄰苯三酚，用0.01 mol/L HCl溶解并定容至100 mL，配制成濃度為3 mmol/L的鄰苯三酚溶液，并用超純水配制一定質(zhì)量濃度的羊肝酶解液，取0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）4.5 mL于25℃水浴保溫20 min，取出后立即加入羊肝酶解液2 mL、蒸餾水3 mL及鄰苯三酚0.5 mL（試驗(yàn)前于25℃保溫）后迅速搖勻，分別取200 μL于96孔板上，用酶標(biāo)儀恒溫下每隔30 s在波長(zhǎng)325 nm測(cè)定其吸光度值（A325nm），反應(yīng)4.0 min后結(jié)束。計(jì)算樣品抑制鄰苯三酚自氧化的速率V樣（即每分鐘光吸收的平均變化率）?？瞻坠苤幸?.01 mol/L的HCl代替羊肝酶解液，反應(yīng)啟動(dòng)后4.0 min內(nèi)，計(jì)算鄰苯三酚自氧化速率V自。以VC為陽性對(duì)照。O2-·的清除率計(jì)算公式如下：

1.3.8 羊肝酶解產(chǎn)物還原力的測(cè)定[13]

取先配制好的不同質(zhì)量濃度的羊肝酶解液1 mL于試管中，加入2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液和2.0 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），混勻后在50℃水浴中保溫30 min，然后加入2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸，混合后3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL超純水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，混勻后于50℃水浴中保溫10 min，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值。以超純水代替羊肝酶解液作為空白對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè)平行，吸光度值越大，表示還原能力越強(qiáng)。以VC為陽性對(duì)照。1.3.9羊肝酶解產(chǎn)物對(duì)羥自由基(·OH)清除率的測(cè)定[14]

取1 mL先配制好的不同質(zhì)量濃度羊肝酶解液，依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混合均勻后靜置30 min，以超純水為參比，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值（A1）。取1 mL蒸餾水代替FeSO4溶液，測(cè)得吸光度值（A2）。取1 mL蒸餾水代替羊肝酶解液，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)得吸光度值（A0）。以VC為陽性對(duì)照。·OH的清除率計(jì)算公式如下：

1.3.10 數(shù)據(jù)分析與處理

每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并利用Origin 8.5和Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肝基本組分分析

由表3可知，羊肝的蛋白質(zhì)含量為17.61%左右，因此，羊肝粗蛋白可用于酶解制備多肽的蛋白源。

表3 羊肝基本組分分析Table 3 Analysis of the basic components of sheep liver

2.2 蛋白酶的篩選

蛋白酶的種類不同，其作用位點(diǎn)及其所結(jié)合的底物特性也有所不同[15]，4種蛋白酶對(duì)羊肝進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖1。

圖1 酶的種類對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme types on hydrolysis degree of sheep liver enzymatic hydrolysates

由圖1可知，各蛋白酶對(duì)羊肝的酶解能力不相同，依次為堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶，即堿性蛋白酶酶解羊肝的水解度最高，達(dá)12.43%。因此，選用堿性蛋白酶作為最佳用酶，進(jìn)行后續(xù)酶解工藝條件優(yōu)化及抗氧化活性研究。

2.3 羊肝酶解工藝的單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶解溫度對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響

圖2 酶解溫度對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of sheep liver enzymatic hydrolysates

由圖2可知，在40～50℃溫度范圍內(nèi)，水解度隨著酶解溫度的增加而增大，當(dāng)溫度為50℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值，為34.40%；繼續(xù)升高酶解溫度，水解度呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)前期，酶與底物接觸頻繁，酶活力較高，水解度開始增加，而當(dāng)溫度超過了該蛋白酶的最適溫度，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，從而酶活力降低，酶與底物作用位點(diǎn)的結(jié)合受到抑制[16]，使得水解度開始下降。因此，選擇酶解溫度50℃為宜。

2.3.2 pH值對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響

圖3 pH值對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis degree of sheep liver enzymatic hydrolysates

由圖3可知，當(dāng)pH值在7.0～8.5時(shí)，羊肝酶解產(chǎn)物的水解度呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值為8.5時(shí)，水解度達(dá)到最大值，為36.13%；此后由于pH值增大不適合酶的最佳作用條件，使得蛋白質(zhì)分子的某些基團(tuán)解離受到限制[17-18]，從而水解效果開始下降。因此，選擇pH 8.5為宜。

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of sheep liver enzymatic hydrolysates

由圖4可知，水解度隨著酶解時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，酶解時(shí)間在1～4 h范圍內(nèi)，水解度增大較快；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，水解度為22.74%，此后進(jìn)一步延長(zhǎng)酶解時(shí)間，水解效果變化不大。因此，選擇酶解時(shí)間4 h為宜。

2.3.4 加酶量對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響

由圖5可知，在0.2%～0.4%范圍內(nèi)，隨著加酶量增加，水解度呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。當(dāng)加酶量為0.4%時(shí)，水解度達(dá)到最大值，為38.69%；此后隨著酶添加量的增加，水解度開始下降，這是由于底物的蛋白結(jié)合位點(diǎn)被逐漸占據(jù)，中間復(fù)合物也達(dá)到飽和狀態(tài)[19]。因此，選擇加酶量0.4%為宜。

圖5 加酶量對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on hydrolysis degree of sheep liver enzymatic hydrolysates

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)結(jié)果如表4所示，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments

使用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到自變量（X1、X2、X3、X4）與水解度（Y）之間的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為：

Y=39.08+0.45X1+0.17X2+0.35X3-0.033X4-0.45X1X2-0.15X1X3-0.047X1X4-0.26X2X3-0.30X2X4-0.48X3X4-1.10X12-1.84X22-1.03X32-1.02X42

由表5方差分析結(jié)果可知，水解度的模型確定系數(shù)R2=0.954 0，校正系數(shù)R2Adj=0.908 0，模型的P值＜0.000 1，說明模型達(dá)極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.821 6＞0.05，影響不顯著，表明回歸方程與實(shí)測(cè)值之間擬合較好；一次項(xiàng)X1、X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42對(duì)水解度的影響均極顯著（P＜0.01），而交互作用項(xiàng)X1X2、X3X4對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由表5中各因素的P值可知，各因素對(duì)羊肝水解度的影響大小依次為酶解溫度（X1）＞酶解時(shí)間（X3）＞pH（X2）＞加酶量（X4）。

等高線圓形狀表示兩者交互作用不顯著，橢圓形則表示交互作用顯著[20-21]。圖6中顯示了各因素之間的交互作用對(duì)羊肝水解度三維響應(yīng)面及等高線圖的影響。由圖6可知，酶解溫度與pH、酶解時(shí)間與加酶量的等高線圖形狀呈橢圓形且排列緊密，說明酶解溫度與pH、酶解時(shí)間與加酶量之間交互作用顯著，這與表5方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)表4中的響應(yīng)值Y的結(jié)果，通過Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)方程進(jìn)行求解，得到酶解羊肝蛋白工藝的最佳條件為：酶解溫度50.96℃、pH 8.51、酶解時(shí)間4.09 h、加酶量0.39%，在此工藝條件下理論上水解度為40.02%。為了驗(yàn)證最優(yōu)酶解條件，考慮到試驗(yàn)設(shè)備和實(shí)際操作的可行性，將優(yōu)化所得最佳酶解條件修正為：酶解溫度51℃、pH 8.5、酶解時(shí)間4.1 h、加酶量0.40%。在上述確定的最優(yōu)酶解條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到羊肝酶解液的水解度為（40.31±0.24）%，與理論值相差不大，說明二次多項(xiàng)式模型擬合度較好。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

圖6 酶解溫度、pH、酶解時(shí)間和加酶量的交互作用對(duì)羊肝酶解產(chǎn)物水解度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between hydrolysis temperature,pH,hydrolysis time and enzyme addition on hydrolysis degree of sheep liver enzymatic hydrolysates

2.5 羊肝酶解產(chǎn)物的抗氧化活性研究

2.5.1 清除羥自由基（·OH）的能力

在自由基體系中，·OH是一種對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的活性氧自由基，能引起機(jī)體發(fā)生多種疾病[22]。在優(yōu)化條件下酶解羊肝蛋白，測(cè)定酶解產(chǎn)物羥自由基清除率，結(jié)果見圖7。

圖7 羊肝酶解液與VC對(duì)·OH的清除作用Fig.7 Scavenging effect of sheep liver enzymatic hydrolysate and VC on·OH

由圖7可知，羊肝酶解液清除·OH的能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)酶解液質(zhì)量濃度為18 mg/mL時(shí)，羊肝酶解產(chǎn)物對(duì)·OH清除率為49.62%，與王運(yùn)改等[23]酶解鮰魚皮明膠制備抗氧化肽清除·OH的結(jié)果大體一致。對(duì)羊肝酶解液質(zhì)量濃度（y1）和VC質(zhì)量濃度（y2）分別進(jìn)行·OH清除率（x）與質(zhì)量濃度之間的擬合，得到兩者的擬合方程分別為y1=2.224x+12.19（R2=0.9760），y2=19.103lnx+89.825（R2= 0.9831），通過方程可以得到羊肝酶解液和VC清除·OH的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為17.01 mg/mL和0.74 mg/mL。與VC相比，羊肝酶解液的IC50值較高，約為VC的22.97倍，表明羊肝酶解液清除·OH的能力較VC弱（IC50值越低，表明抗氧化活性越強(qiáng)），但具有一定的抗氧化能力。

2.5.2 清除超氧陰離子自由基（O2-·）的能力

人體內(nèi)存在一定數(shù)量的超氧陰離子，不發(fā)生化學(xué)變化時(shí)對(duì)人體無害，但與羥基自由基（·OH）結(jié)合后的產(chǎn)物易導(dǎo)致細(xì)胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷，破壞人類機(jī)體功能[22]。在優(yōu)化條件下酶解羊肝蛋白，測(cè)定酶解產(chǎn)物O2-·清除率，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，羊肝酶解液與VC清除O2-·的能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)羊肝酶解液質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為64.78%。對(duì)羊肝酶解液質(zhì)量濃度（y1）和VC質(zhì)量濃度（y2）分別進(jìn)行超氧陰離子自由基清除率（x）與質(zhì)量濃度之間的擬合，得到兩者擬合方程為y1=2.992 1x+10.474（R2=0.944 3），y2=22.638ln（x）+93.792（R2=0.945 2），通過方程得到兩者的IC50值分別為13.21 mg/mL和1.52 mg/mL。與VC相比，羊肝酶解液清除超氧陰離子的能力較VC弱，其IC50值約為VC的8.71倍，表明在一定質(zhì)量濃度下羊肝酶解產(chǎn)物具有清除超氧陰離子的能力。

圖8 羊肝酶解液與VC對(duì)O2-·的清除作用Fig.8 Scavenging effect of sheep liver enzymatic hydrolysate and VC on O2-·

2.5.3 清除DPPH自由基的能力

在優(yōu)化條件下酶解羊肝蛋白，測(cè)定酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率，結(jié)果見圖9。

圖9 羊肝酶解液與VC對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of sheep liver enzymatic hydrolysate and VC on DPPH free radical

由圖9可知，在一定范圍內(nèi)，羊肝酶解液和VC清除DPPH自由基的能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)羊肝酶解液的質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率為79.36%，而VC質(zhì)量濃度在3 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到94.75%。對(duì)羊肝酶解液質(zhì)量濃度（y1）和VC質(zhì)量濃度（y2）分別進(jìn)行DPPH自由基清除率（x）與質(zhì)量濃度之間的擬合，得到擬合方程分別為y1=3.209x+16.552（R2=0.984 1），y2=34.491x+22.892（R2=0.986 2），通過方程得到兩者IC50值分別為10.42mg/mL和0.79mg/mL。與VC相比，羊肝酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力較弱，但羊肝酶解產(chǎn)物已表現(xiàn)出良好的抑制DPPH自由基的能力，說明羊肝酶解產(chǎn)物具有一定的抗氧化能力。

2.5.4 羊肝酶解產(chǎn)物的還原能力

還原力在波長(zhǎng)700 nm處的吸光度值大小可以反映出樣品的抗氧化活性強(qiáng)弱。吸光度值越大，表明還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性就越強(qiáng)[24-25]。在優(yōu)化條件下酶解羊肝蛋白，測(cè)定其還原能力，結(jié)果見圖10。

圖10 羊肝酶解液與VC的還原能力Fig.10 Reduction capacity of sheep liver enzymatic hydrolysate and VC

由圖10可知，羊肝酶解液和VC在波長(zhǎng)700 nm處的吸光度值都隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，VC質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，其吸光度值為0.743；而羊肝酶解液質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，其吸光度值為0.445，約為VC吸光值的一半左右，表明羊肝酶解液要達(dá)到低質(zhì)量濃度下VC的還原能力，需要12.5倍質(zhì)量濃度的羊肝酶解產(chǎn)物。與VC相比，羊肝酶解液的還原力一般，但也表明了羊肝酶解產(chǎn)物具有一定的還原能力。

3 結(jié)論

本研究選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等4種酶對(duì)羊肝蛋白進(jìn)行酶解，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最高，確定酶解用酶為堿性蛋白酶。并且在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法，獲得羊肝蛋白的最佳酶解條件為酶解溫度51℃、pH 8.5、酶解時(shí)間4.1 h、加酶量0.40%，在該條件下，羊肝酶解液的水解度為（40.31±0.24）%。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，羊肝酶解產(chǎn)物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的抗氧化能力和還原能力，若將其進(jìn)一步分離純化研究，可成為一種潛在的天然抗氧化劑。其清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的IC50值分別為17.01 mg/mL、13.21 mg/mL和10.42 mg/mL。試驗(yàn)為提高羊肝深加工及開發(fā)生物活性肽提供了理論依據(jù)，但有關(guān)羊肝酶解液中抗氧化活性成分的分離純化與鑒定、抗氧化機(jī)理以及體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。

[1]李黎，馬儷珍，唐燕.明目羊肝口服液關(guān)鍵工藝優(yōu)化參數(shù)研究[J].食品科技，2012，37（5）：92-95.

[2]韓志慧，隋姣，馬儷珍.明目羊肝羹的工藝技術(shù)研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：254-258.

[3]KECHAOU E S,DUMAY J,DONNAY-MORENO C,et al.Enzymatic hydrolysis of cuttlefish(Sepiaofficinalis)andsardine(Sardina pilchardus)viscera using commercial proteases:Effects on lipid distribution and amino acid composition[J].J Biosci Bioeng,2009,107(2): 158-164.

[4]BARKIA A,BOUGATEF A,KHALED H B,et al.Antioxidant activities of sardinelle heads and/or viscera protein hydrolysates prepared by enzymatic treatment[J].J Food Biochem,2010,34:303-320.

[5]郭芳，方婷，陳錦權(quán).鮑魚臟器酶解工藝條件的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2015，34（12）：101-104.

[6]劉旺旺，侯銀臣，程永霞，等.羊胎盤多肽的制備及其清除自由基能力的研究[J].中國(guó)釀造，2014，33（9）：89-93.

[7]王艷梅，萬全，賴年悅，等.黃緣盒龜肉的酶解工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37（4）：622-630.

[8]尹利端，黃靜，王立志.鯉魚魚鱗膠原蛋白肽抗氧化活性研究[J].明膠科學(xué)與技術(shù)，2015，35（3）：133-136.

[9]徐懷德，殷金蓮，陳沁.甲魚酶解產(chǎn)物抗氧化功能的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007，7（4）：25-32.

[10]趙謀明，張佳男，吳長(zhǎng)平，等.大豆肽的制備及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物特性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31（2）：138-144.

[11]XIE Z J,HUANG J R,XU X M,et al.Antioxidant activity of peptides isolated from alfalfa leaf protein hydrolysate[J].Food Chem,2008,111 (2):370-376.

[12]趙強(qiáng)忠，劉丹.秋刀魚抗氧化肽制備及其抗氧化活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（10）：165-171.

[13]李俊江，潘道東，郭宇星，等.鵝肉蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2012，33（3）：126-130.

[14]李桂峰，王向東，趙國(guó)建，等.酶解雙孢菇蛋白制備抗氧化肽的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（5）：37-43.

[15]胡學(xué)智，王俊.蛋白酶生產(chǎn)和應(yīng)用的進(jìn)展[J].工業(yè)微生物，2008，38（4）：49-61.

[16]徐曼，馬寒冰，李錚，等.響應(yīng)面法優(yōu)化豆粕蛋白酶解條件[J].中國(guó)釀造，2013，32（3）：56-60.

[17]劉艷，段振華，羅偉，等.無花果蛋白酶酶解牡蠣肉的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36（18）：182-185.

[18]羅偉，段振華，萬斌，等.貽貝煮汁液酶解工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（3）：39-43.

[19]宋茹，馮婷立，謝超.海產(chǎn)小雜魚抗氧化肽制備工藝[J].食品科學(xué)，2011，32（12）：29-33.

[20]肖懷秋，李玉珍，林親錄，等.Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化冷榨花生粕酶解制備花生肽工藝[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2014，29（10）：106-111.

[21]李玉珍，肖懷秋，楊濤，等.響應(yīng)面優(yōu)化低值豆粕液態(tài)制備多肽工藝[J].大豆科學(xué)，2012，31（4）：649-654.

[22]張艷萍，戴志遠(yuǎn)，張虹.貽貝蛋白的酶解及其酶解物的抗氧化活性研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12（1）：10-18.

[23]王運(yùn)改，林琳，李明輝，等.鮰魚皮明膠抗氧化肽的制備工藝研究[J].食品科學(xué)，2010，31（19）：254-258.

[24]王雪芹，邢榮娥，劉松，等.鮐魚蛋白酶解工藝優(yōu)化及酶解物的抗氧化活性測(cè)定[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（5）：1023-1028.

[25]郭善廣，榮婧，郭利平，等.羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解超濾產(chǎn)物的抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械，2014，30（1）：179-183.

Optimization of hydrolysis conditions of sheep liver proteins and antioxidant activities of its hydrolysates

WEN Fei,MU Yingchun,LI Jingwen,ZHAO Xu,TANG Suting,YANG Xuhui,SU Wei*(College of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

In order to optimize the sheep liver enzymolysis technology and explore itsin vitroantioxidant activity,using hydrolysis degree as evaluation index,sheep liver was hydrolysed by alkaline protease.On the basis of single factor experiments,the enzymatic hydrolysis conditions of sheep liver proteins were optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum enzymatic hydrolysis conditions were as follow: hydrolysis temperature 51℃,pH 8.5,hydrolysis time 4.1 h and enzyme addition 0.40%.Under the conditions,through three validation tests,the actual hydrolysis degree of sheep liver hydrolysates was(40.31±0.24)%.The results ofin vitroantioxidant experiments showed that sheep liver hydrolysates had a certain antioxidant activities.The IC50of its scavenging hydroxyl radical,superoxide anion and DPPH free radical were 17.01 mg/ml, 13.21 mg/ml and 10.42 mg/ml,respectively.Sheep liver hydrolysates had a certain reduction capacity.

sheep liver;protein;hydrolysis;antioxidant activity

TS251.95

0254-5071（2017）01-0157-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.033

2016-08-29

貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（研理工2016057）；黔西南州科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2016-1-117）

文飛(1987-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。

*通訊作者：蘇偉(1974-)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。