趙彥華，劉洪巖，丁正峰，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京 210017）

江蘇省河蟹主養(yǎng)區(qū)微孢子感染情況調(diào)查報(bào)告

趙彥華，劉洪巖，丁正峰，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京 210017）

2015年7月江蘇省興化及周邊鹽城地區(qū)河蟹養(yǎng)殖大范圍爆發(fā)河蟹肝胰腺壞死病，經(jīng)調(diào)查研究確認(rèn)為微孢子蟲感染。采用PCR的方法對江蘇省河蟹主要養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖塘口進(jìn)行抽樣調(diào)查，對所采集的河蟹標(biāo)本進(jìn)行微孢子蟲感染情況調(diào)查。結(jié)果表明：抽樣的八個河蟹主要養(yǎng)殖區(qū)，均有微孢子蟲感染情況，其中以興化和鹽城的河蟹微孢子蟲感染情況最為嚴(yán)重。

河蟹；感染；微孢子蟲；調(diào)查報(bào)告

河蟹學(xué)名為中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國名貴的淡水養(yǎng)殖品種之一。同時河蟹也是蟹類養(yǎng)殖中病害最為嚴(yán)重的一種，每年4—10月均有發(fā)病，7—9月是發(fā)病的高峰季節(jié)[1]。

微孢子蟲（Microsporidian）作為一種真核生物專門寄生于細(xì)胞中，是一類古老的細(xì)胞內(nèi)寄生物。宿主范圍比較廣泛，能夠感染人類、水生甲殼類以及昆蟲等多種生物。自1857年Nageli首次發(fā)現(xiàn)家蠶微粒子病病原生物Nosema bombycis后,人們對其進(jìn)行了大量研究，特別是近年來，免疫缺陷患者體內(nèi)微孢子蟲的發(fā)現(xiàn)，更加引起了生物學(xué)界和醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[2]。微孢子蟲種類繁多，在顯微鏡下觀察包囊形狀也各異，如球形、紡錘形和橢圓形，其中以球形較為常見[3]。國內(nèi)對于水生動物微孢子蟲的研究較少，主要集中在家蠶的微孢子蟲的研究上。然而，近些年來在水產(chǎn)養(yǎng)殖中頻發(fā)微孢子蟲病，嚴(yán)重威脅著一些經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖[4]。

河蟹的養(yǎng)殖從20世紀(jì)80年代以來飛速發(fā)展，進(jìn)入21世紀(jì)后，其產(chǎn)業(yè)得到了迅猛的發(fā)展[5]。江蘇作為河蟹的主要養(yǎng)殖區(qū)，年產(chǎn)值可達(dá)到200億，成為支撐江蘇水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要支柱。河蟹一旦感染疾病，在發(fā)病初期癥狀較輕，甚至不表現(xiàn)出明顯癥狀，一旦蟹病大規(guī)模流行，就較難控制[6]。然而自2015年入夏后，興化和鹽城等地出現(xiàn)大批量養(yǎng)殖河蟹死亡的情況，主要表現(xiàn)為活力下降，不進(jìn)食，開蟹蓋后可見內(nèi)臟及肝胰腺發(fā)白、壞死等情況，也就是養(yǎng)殖戶俗稱的“水癟子”病，經(jīng)研究表明為微孢子蟲感染所致。因而本調(diào)查采用丁正峰等[7]建立的河蟹微孢子蟲PCR檢測方法對江蘇省其他河蟹主要養(yǎng)殖區(qū)微孢子蟲感染情況進(jìn)行抽樣調(diào)查。

1 材料及方法

1.1 樣本采集

本次調(diào)查研究樣品采集時間為2015年7—11月，采集地點(diǎn)是江蘇省南京、常州、蘇州、泰興、無錫、鹽城、揚(yáng)州、鎮(zhèn)江等地的河蟹養(yǎng)殖塘口，每個地方挑選2~4個不同的養(yǎng)殖戶，每個養(yǎng)殖戶采集河蟹30只，規(guī)格大約50 g每只，具體樣本采集情況見表1。江蘇省河蟹養(yǎng)殖方式主要為精養(yǎng)模式，塘口養(yǎng)殖前采用生石灰潑灑消毒，放苗時間一般為2月下旬，放養(yǎng)的蟹種規(guī)格比較齊全，體質(zhì)強(qiáng)壯，活動性強(qiáng)，無明顯可見病害。所有樣品采集時均活力旺盛，采集后采用不同容器分裝，采集當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，處理時所采集樣本均處于存活狀態(tài)。

表1 微孢子蟲普查地區(qū)分布情況表

1.2 樣本處理

樣本實(shí)驗(yàn)室處理時，分別標(biāo)注采集地點(diǎn)和養(yǎng)殖戶，分離河蟹肝胰臟用于實(shí)驗(yàn)研究，部分河蟹開殼后可見明顯肝胰腺有發(fā)白現(xiàn)象，取樣時方法嚴(yán)謹(jǐn)，防止不必要的交叉感染。

1.3 檢測方法

根據(jù)需要配制實(shí)驗(yàn)所需裂解液（100 mmol/L NaCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，25 mmol/L EDTA，pH值8.0，2%SDS，0.5%N-laurylsar-cosine；0.5 mg/mL蛋白酶K）；然后取河蟹肝胰臟100 mg于離心管中，使其破碎，加1 m L裂解液，混合均勻后65℃水浴1 h，加入5 mol/LNaCl，使得NaCl最終濃度為0.7 mol/L，緩慢加入10%體積的CTAB/Na－Cl，混勻后65℃水浴10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混均抽提，無水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，干燥后DNA即可溶于0.1×TE緩沖液中，放于4℃貯存。

實(shí)驗(yàn)室檢測采用的PCR檢測方法：上游引物為MF1：5'-CCGGAGAGGGAGCCTGAGA-3'，下游引物為MR1：5'-GACGGGCGGTGTGTACAAA-3'，以被測樣本DNA為模板，以MF1/MR1為正向和反向引物，進(jìn)行片段擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為引物MF1（10mM）0.5μL，引物MF2（10mM）0.5μL，EX 10X Buffer2μL，dNTPs（2.5 mM）2μL，EX Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2μL，模板DNA1μL，去離子水13.8 μL，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃變性4 min；接著35個循環(huán)的95℃1 min，58℃30 s，72℃1min；最后是72℃延伸5min，4℃保存。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL反應(yīng)產(chǎn)物，以DNA Ladder作為分子量標(biāo)準(zhǔn)在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，當(dāng)陰性對照無條帶，陽性對照和樣品均在931 bp大小處出現(xiàn)條帶，即可判定為陽性。

2 結(jié)果與分析

調(diào)查結(jié)果顯示，江蘇省河蟹主要養(yǎng)殖區(qū)微孢子蟲感染普遍存在，在普查的13個縣（市、區(qū)）共33個養(yǎng)殖戶中，共抽取中華絨螯蟹990只，其中有449只感染微孢子蟲，陽性率達(dá)到45%，其中興化的感染率最高達(dá)到77%，其次為鹽城感染率達(dá)到68%，具體感染情況見表2。

微孢子蟲普查地區(qū)具體地理位置如圖1所示，采集位置分別為南京、常州、蘇州、無錫、泰州、鹽城、揚(yáng)州及鎮(zhèn)江，河蟹的主要養(yǎng)殖區(qū)集中在江蘇省蘇南地區(qū)，并且各個地區(qū)均查出微孢子蟲感染，尤其以鹽城和泰州的感染較為嚴(yán)重。

3 小結(jié)

從本次調(diào)查報(bào)告可以看出，在江蘇省河蟹的主要養(yǎng)殖區(qū)，均有微孢子蟲感染情況存在，尤其是興化市和鹽城市，微孢子蟲感染率較高，這也和2015年河蟹“水癟子”病發(fā)病呈現(xiàn)正相關(guān)性。河蟹微孢子蟲大范圍感染，部分專家認(rèn)為可能與近年來大規(guī)模養(yǎng)殖，水質(zhì)污染嚴(yán)重有關(guān)。個別養(yǎng)殖戶為了私人利益，違背繁殖規(guī)律，早育早繁，導(dǎo)致蟹苗的抗病力差，成活率低[8]。河蟹養(yǎng)殖密度過高必然會導(dǎo)致投餌量、蟹體的排泄物及水中的有機(jī)質(zhì)增加，從而也為微孢子蟲的傳播創(chuàng)造了條件[9]。同時，由于養(yǎng)殖密度的加大，養(yǎng)殖水體內(nèi)源性污染加重，病原微生物大量滋生，養(yǎng)殖環(huán)境呈現(xiàn)惡化趨勢[10]。養(yǎng)殖環(huán)境的變化以及河蟹本身抵抗力的下降造成病害大范圍傳播，從而促使養(yǎng)殖戶不規(guī)范的使用藥物進(jìn)行治療，最終形成一個惡性循環(huán)。

因而，制定一個科學(xué)合理的選藥和用藥制度對于河蟹的養(yǎng)殖具有重要的意義。養(yǎng)殖動物長期處于不良環(huán)境中，機(jī)體易受到損傷，病害發(fā)生頻率增加

[11]。目前河蟹的許多傳染性疾病因缺乏相關(guān)的防治對策的研究而未能得到及時防治，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。針對河蟹微孢子蟲病，目前尚無有效的治療方法，但是可以按照殺滅寄生蟲的方法給予適當(dāng)?shù)闹委?，放養(yǎng)前要徹底清塘消毒、把好蟹種質(zhì)量關(guān)、合理控制放養(yǎng)密度、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理；在蛻殼處于“軟殼”階段時，密度不要過大，以免加重互相打斗[13]；使用無公害藥物定期或不定期地進(jìn)行水體消毒，也可使用微生態(tài)制劑來改善和穩(wěn)定池塘環(huán)境[14]。還可以從提高河蟹抗病力入手，針對河蟹飼料添加營養(yǎng)因子，提高其抗病力，從而抵抗微孢子蟲的感染。

表2 2015年7月—2016年1月江蘇省中華絨螯蟹微孢子蟲普查情況

圖1 微孢子蟲普查地區(qū)地理位置分布圖

[1]楊先樂，黃志華，陳力.中華絨螯蟹病害的流行態(tài)勢及其對產(chǎn)業(yè)發(fā)展的思考[J].淡水漁業(yè)，2010（40）：74-79.

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Investigation report ofm icrosporidian infection on Chinese m itten crab in Jiangsu main cultivation areas

Zhao Yanhua，Liu Hongyan，Ding Zheng feng，Sun Meng ling，Xue Hui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Chinesemitten crab；infection；microsporidian；investigation report

S945

：A

：1004-2091（2017）01-0011-04

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.003

2016-05-23）

河蟹“水癟子”病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用示范（Y2016-25）

趙彥華（1986-），女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事水產(chǎn)病害研究.E-mail：njzhaoyanhua@163.com

薛暉（1968-），男，研究員級高級工程師.E-mail：jsxuehui@163.com

Abstradt:An epidemic of hepatopancreatic necrosis disease（HPND）occurred in Chinese mitten crab in Xinghua and Yancheng of Jiangsu province in July，2015.We confirmed it was microsporidian infection caused the HPND after some researches.We used PCR method to know the infection on Chinesemitten crab in Jiangsu main cultivation areas and completed an investigation report.The results showed that the crabswere infected by microsporidian in all the eightareas，especially in Xinghua and Yancheng.