王惠珍+連中學(xué)+陸國(guó)弟+黃鈺芳+崔治家+李金田+杜弢

[摘要]通過(guò)廣泛收集產(chǎn)自甘肅省渭源縣、漳縣、岷縣、宕昌縣、隴西縣等地黨參種苗30份，測(cè)定其根長(zhǎng)、根粗、單根重，然后K聚類分析，依據(jù)聚類結(jié)果將種苗劃分為3個(gè)等級(jí)，以不同等級(jí)為處理進(jìn)行田間試驗(yàn)，研究不同等級(jí)黨參種苗與藥材產(chǎn)量及質(zhì)量的關(guān)系，為制定黨參種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。研究結(jié)果顯示，一級(jí)苗出苗最快，產(chǎn)量最高，且顯著的高于二級(jí)苗和三級(jí)苗（P<0.05）；一級(jí)苗炔苷含量最高，顯著高于三級(jí)苗（P<0.05）；三級(jí)苗多糖含量最高，顯著高于二級(jí)苗和一級(jí)苗（P<0.05）。因此從黨參藥材產(chǎn)量、質(zhì)量及投入成本綜合分析，黨參移栽應(yīng)選擇根長(zhǎng)>15.6 cm，根粗>2.7 mm，單根重>0.56 g的種苗為宜。

[關(guān)鍵詞]黨參；種苗等級(jí)；產(chǎn)量；黨參炔苷；多糖

[Abstract]The study is aimed to research the relationship between the seedling grade ofCodonopsis pilosula and yield and quality of medicinal materials， so as to provide basis for establishing seedling standard. Thirty seedlings ofC. pilosula were collected from the main production areas in Gansu province， such as Weiyuan， Minxian， Zhangxian， Dangchang and Longxi， root length and diameter and weight of all the samples were measured. According to the clustering results， seedlings were divided into 3 levels， and field experiments were conducted with three levels seedling， yield and quality were tested in laboratory. Results have showed that emergence of grades 1 was faster than that of grades 2 and 3. Yield of grades 1 was significantly higher than that of grades 2 and 3 （P<0.05）. Propargyl glycoside content of grades 1 was the highest， and significantly higher than that of grades 3. Polysaccharide content of grades 3 was the highest and significantly higher than that of grades 1 and 2 （P<0.05）. So considering yield， quality and investment cost of C. pilosula， planting seedlings ofC. pilosula should select that root length>15.6 cm， root diameter>2.7 mm， root weight>0.56 g.

[Key words]Codonopsis pilosula； seedling grade； yield； propargyl glycoside； polysaccharide

doi：10.4268/cjcmm20162111

黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.為桔梗科黨參屬多年生草質(zhì)藤本植物，以其色白、形直、質(zhì)細(xì)、肉實(shí)和藥效穩(wěn)定者為佳。具有補(bǔ)中益氣，健脾益肺的功效^[1]。近年來(lái)，關(guān)于黨參研究主要集中在栽培技術(shù)^[2]、品種選育^[3]、不同產(chǎn)區(qū)質(zhì)量比較^[4-7]、藥材貯藏加工^[8-11]等方面。黨參除應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生外，更被廣泛應(yīng)用于保健、藥膳等領(lǐng)域^[12]，需求量逐年增加。因此規(guī)范黨參種苗市場(chǎng)，制定黨參種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。鑒于此，本研究以國(guó)家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育基地建設(shè)為契機(jī)，通過(guò)不同產(chǎn)區(qū)黨參種苗質(zhì)量指標(biāo)（根長(zhǎng)、根粗、單根重等）測(cè)定—K聚類分級(jí)—田間試驗(yàn)，對(duì)不同等級(jí)種苗所產(chǎn)藥材產(chǎn)量及構(gòu)成因素、藥效成分等做定量比較分析，為制定黨參種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，也對(duì)規(guī)范黨參種苗市場(chǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)材料為不同產(chǎn)地黨參C.pilosula（渭黨2號(hào)）種苗30份，分別來(lái)自甘肅省臨洮縣（2份）、渭源縣（11份）、宕昌縣（1份）、漳縣（9份）、岷縣（4份）、隴西縣（3份）等地，每份5 kg。

1.2 儀器與試劑

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；AE260型1/10萬(wàn)電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；SK250H型超聲波清洗器（上海科島超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司）。黨參炔苷對(duì)照品由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所（批號(hào)MUST-14121311）提供；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。葡萄糖：D-無(wú)水葡萄糖由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所提供（批號(hào)MUST-15011214）；濃硫酸、苯酚均為分析純。

1.3 種苗分級(jí)

每份隨機(jī)選取100株進(jìn)行種苗質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定，求其平均值，見(jiàn)表1。采用K聚類分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分級(jí)，得3個(gè)等級(jí)，見(jiàn)表2。

1.4 田間試驗(yàn)地點(diǎn)與方法

本試驗(yàn)分別于2014年和2015年在黨參主產(chǎn)區(qū)甘肅省渭源縣清源鎮(zhèn)實(shí)施。2014年重點(diǎn)測(cè)定黨參生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、藥材產(chǎn)量及質(zhì)量，2015年僅測(cè)定藥材產(chǎn)量及質(zhì)量。

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素為黨參種苗等級(jí)，設(shè)3個(gè)水平，見(jiàn)表2。一級(jí)苗、二級(jí)苗和三級(jí)苗，各3次重復(fù)，小區(qū)面積為100 m²，共3×3=9個(gè)處理小區(qū)。試驗(yàn)地土壤肥力均勻一致（2014年為黃芪茬，2015年為蠶豆茬）。施肥種類、施肥量和田間管理措施均同產(chǎn)區(qū)常規(guī)種植，按株行距5 cm×20 cm于2014年4月5—6日和2015年4月10—11日移栽。移栽密度為6.7萬(wàn)株/畝（1畝≈667 m²）。

1.5 試驗(yàn)地降雨量分布情況

試驗(yàn)?zāi)攴萁涤炅考胺植记闆r見(jiàn)圖1，從中看出，2015年總降雨量（377.1 mm）比2014年（485.3 mm）降低22.3%，2014年雨量分布與作物需水量相吻合，而2015年7月及以前降雨量與作物需水量相吻合，8月根系膨大期處于干旱狀態(tài)，且之后雨量一直較少。因此將2014年定為黨參生長(zhǎng)正常供水年份，2015年定為干旱年份。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 農(nóng)藝性狀指標(biāo)測(cè)定

出苗率和出苗速度（%）通過(guò)田間出苗數(shù)和出苗時(shí)間來(lái)確定。

根長(zhǎng)（cm）、根粗（cm）和單根鮮/干重（g）在出苗后約30 d取樣測(cè)定1次。將黨參植株從土壤中完整挖出，用刻度尺測(cè)定根長(zhǎng)、游標(biāo)卡尺測(cè)定根粗，用百分之一天平測(cè)定其單根鮮重，然后放于105 ℃烘箱中殺青30 min后再調(diào)整為80 ℃烘至恒干，測(cè)其單根干重。

1.6.2 藥材產(chǎn)量測(cè)定

收獲期每小區(qū)采集3個(gè)樣點(diǎn)，每樣點(diǎn)采集20株進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定，最后計(jì)算單根重，然后根據(jù)密度換算為每公頃產(chǎn)量（kg·hm^-2）。

1.6.3 黨參炔苷含量測(cè)定

1.6.3.1 色譜條件 色譜柱Agilent SB-C18柱（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（28∶72）；檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm；流速1.0 mL·min^-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

1.6.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷對(duì)照品5.20 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1.3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.068 g·L^-1的對(duì)照品溶液。

1.6.3.3 樣品溶液的制備 將不同月份的藥材分別進(jìn)行粉碎，過(guò)4號(hào)篩。精密稱取各樣品2.0 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，超聲提取40 min，濾過(guò)，濃縮，甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，得供試品溶液。

1.6.3.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1，5，10，15，20，25 μL進(jìn)樣，按色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=1 041.0x-3.759 7，r=0.999 7（n=6）。黨參炔苷在0.068～1.700 μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.6.3.5 黨參炔苷含量測(cè)定 依據(jù)1.6.3.3項(xiàng)下條件制備各樣品溶液，按照色譜條件進(jìn)行黨參炔苷含量測(cè)定。

1.6.4 黨參多糖含量測(cè)定

1.6.4.1 黨參多糖的提取與精制 將采自不同生長(zhǎng)時(shí)期的黨參藥材樣品于60 ℃烘干，粉碎，過(guò)4號(hào)篩。稱取各樣品粉末50 g，加95%乙醇回流1 h，濾過(guò)，濾渣加水250，150 mL，超聲提取2次，每次30 min，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮后用氯仿萃取3次，除去蛋白質(zhì)。濾液中加入無(wú)水乙醇，使含醇量達(dá)到80%，冰箱靜置過(guò)夜，抽濾，沉淀物先后用無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，60 ℃烘干至恒重，即得精制黨參多糖。

1.6.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50.0 mg，置100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得。

1.6.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取1.6.4.2項(xiàng)下制備的黨參多糖50.0 mg，置25 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得。

1.6.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL分別置20 mL具塞試管中，依次加水補(bǔ)足至4 mL，分別加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，并迅速加入濃硫酸5 mL，常溫放置25 min，以蒸餾水同法制成空白溶液于490 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）對(duì)樣品濃度（c）進(jìn)行回歸，回歸方程為A=0.724 4c-0.048 3，r=0.999 5。

1.6.4.5 多糖含量測(cè)定 精密量取1.6.4.3項(xiàng)下制備的供試品溶液各1.0 mL，按照1.6.4.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定各樣品的吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間出苗率與種苗等級(jí)的關(guān)系

出苗率和出苗速率是衡量種苗質(zhì)量的重要指標(biāo)，2014，2015 2年的出苗率均在98%以上，但出苗速率與種苗大小有很大關(guān)系，種苗越大，出苗越早，速率越快，一級(jí)苗僅持續(xù)8 d左右時(shí)間就達(dá)到98%以上，而二級(jí)苗和三級(jí)苗出苗晚，且速度較慢，約持續(xù)12～15 d，見(jiàn)表3。

2.2 根系生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)與種苗等級(jí)的關(guān)系

不同等級(jí)種苗根系生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，根長(zhǎng)、根粗及單根鮮/干重均隨生長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，但種苗等級(jí)不同，增加幅度不同。根長(zhǎng)和根粗增加量從大到小依次為三級(jí)苗、二級(jí)苗和一級(jí)苗，單根鮮重增加量依次為二級(jí)苗、三級(jí)苗和一級(jí)苗，單根干重增加量依次為一級(jí)苗、二級(jí)苗和三級(jí)苗；根長(zhǎng)、根粗、單根鮮干重的累積速率從大到小依次為三級(jí)苗、二級(jí)苗和一級(jí)苗。說(shuō)明種苗越小，生長(zhǎng)速率越快，見(jiàn)表4。

2.3 藥材產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素與種苗等級(jí)的關(guān)系

黨參根長(zhǎng)、根粗、單根重是藥材產(chǎn)量形成的主要因素。不同等級(jí)黨參種苗所產(chǎn)藥材產(chǎn)量及其構(gòu)成因素見(jiàn)表5。從中看出，根長(zhǎng)、根粗、單根鮮/干重等產(chǎn)量構(gòu)成因素均為一級(jí)苗顯著高于二級(jí)苗和三級(jí)苗（P<0.05），二級(jí)苗和三級(jí)苗間差異不顯著。藥材出干率3個(gè)等級(jí)無(wú)顯著差異。

藥材產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果顯示，2014年和2015年均為一級(jí)苗顯著高于二級(jí)苗和三級(jí)苗（P<0.05），2014年一級(jí)苗比二級(jí)和三級(jí)苗分別高42.3%，21.7%，2015年分別高93.2%，83.6%。從此看出，產(chǎn)量與產(chǎn)量構(gòu)成因素隨種苗等級(jí)的變化趨勢(shì)一致，且一級(jí)苗抵御逆境脅迫的能力強(qiáng)于二級(jí)苗和三級(jí)苗。

將藥材產(chǎn)量構(gòu)成因素與種苗質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)量構(gòu)成因素的增加量和增長(zhǎng)速率隨種苗的增大而減小。三級(jí)苗生產(chǎn)藥材鮮重是種苗鮮重的28.0倍（2014年）和7.3倍（2015年），顯著高于一級(jí)苗（12.0倍和2.7倍）和二級(jí)苗（8.9倍和3.1倍）。

2.4 藥效成分與種苗等級(jí)的關(guān)系

2014年和2015年黨參炔苷和多糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，黨參炔苷含量與種苗等級(jí)均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)程度分別為R²=0.999 7和R²=0.903 5；多糖與種苗等級(jí)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。相關(guān)程度分別為R²=0.994 3和R²=0.641 9。表6結(jié)果還顯示，2015年黨參質(zhì)量?jī)?yōu)于2014年，這可能是干旱（2015）利于藥效成分的轉(zhuǎn)化積累所致。

3 討論與結(jié)論

有研究者在重樓^[13]、土沉香^[14]、金釵石斛^[15]等藥用植物中采用單一指標(biāo)或少數(shù)指標(biāo)進(jìn)行種苗分級(jí)。而本試驗(yàn)參考李瑞杰等^[16]對(duì)素花黨參的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)以及已經(jīng)制定的黨參種苗檢驗(yàn)規(guī)程，以苗長(zhǎng)，苗粗，單根重作為分級(jí)指標(biāo)，采用K聚類進(jìn)行分級(jí)。然后通過(guò)大田試驗(yàn)確定黨參種苗等級(jí)的優(yōu)劣。本研究結(jié)果顯示，一級(jí)苗出苗早且速度快，能快速適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的變化，產(chǎn)量高。而三級(jí)苗雖增長(zhǎng)速率快，出干率高，但產(chǎn)量低，二級(jí)苗介于一級(jí)苗和三級(jí)苗之間。2014，2015年試驗(yàn)結(jié)果一致。

藥效成分是衡量藥材質(zhì)量好壞的主要因素，本研究結(jié)果顯示，黨參炔苷含量隨種苗增大而增加，與本課題組在甘草中甘草酸隨種苗等級(jí)的變化趨勢(shì)一致^[21]，而多糖含量變化與炔苷相反，這與甘草中甘草苷隨種苗等級(jí)的變化趨勢(shì)一致^[21]，可能原因：種苗越大，生長(zhǎng)越快，需能越多，導(dǎo)致光合產(chǎn)物首先分解釋放能量，產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為炔苷等化合物，故炔苷含量增加，多糖含量降低。本研究還得出，黨參藥材中炔苷和多糖含量并不成正比，這與前人^[22]在黨參藥材品質(zhì)間的相關(guān)性研究結(jié)果一致。2015年黨參藥材中炔苷和多糖含量明顯高于2014年，說(shuō)明干旱有利于黨參炔苷和多糖含量轉(zhuǎn)化積累，這與水分脅迫有利于藥效成分積累相一致^[17-20]。

綜上所述，從黨參藥材產(chǎn)量、質(zhì)量、成本（從投入成本考慮，三級(jí)苗約1 785株/kg、二級(jí)苗約650株/kg、一級(jí)苗約395株/kg，且種苗市場(chǎng)一級(jí)苗價(jià)格高）等方面綜合考慮，黨參種植應(yīng)選根長(zhǎng)大于15.6 cm，根粗大于2.7 mm，單根重大于0.56 g的種苗為宜。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]