龍章德，陳皓睿，劉 鴻*，鄒克興，孫建生，李季剛，薛 云，申佩弘*

(1.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，廣西 南寧 530001；2.廣西大學 生命科學與技術(shù)學院，廣西 南寧530005)

利用果膠降解菌塔賓曲霉GYC 501改善梗絲品質(zhì)及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

龍章德1，陳皓睿2，劉 鴻1*，鄒克興1，孫建生1，李季剛1，薛 云1，申佩弘2*

(1.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，廣西 南寧 530001；2.廣西大學 生命科學與技術(shù)學院，廣西 南寧530005)

煙草梗絲中含有大量果膠、纖維素等細胞壁物質(zhì)，造成吸味不好，對其在煙制品中的應用造成了阻礙。本研究旨在利用GYC 501的發(fā)酵酶液處理煙草梗絲，以降解其中以果膠為主的多糖，改善吸味。本研究首先建立了一種測定煙草梗絲中果膠含量相對簡易的方法，并從發(fā)酵時間、緩沖液濃度、緩沖液pH值、發(fā)酵溫度、酶的使用量入手，先進行單因素優(yōu)化實驗再進行正交實驗,以優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果顯示：使用塔賓曲霉(Aspergillustubingensis) GYC 501在煙草梗絲培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后所得到的發(fā)酵液對煙草梗絲進行發(fā)酵處理，得到最優(yōu)發(fā)酵條件：酶使用量為1536 U，發(fā)酵時間為12 h，溫度為42 ℃，緩沖液pH為4.8，緩沖液濃度為0.3 mol/L，梗絲含水量為50%。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下,梗絲果膠降解率最佳，為34.97%。

煙草梗絲；塔賓曲霉；果膠酶；條件優(yōu)化；正交試驗

煙草梗絲在加入酶后其品質(zhì)有一定程度的提升，不光是吸味的改善[1]，還能提升煙梗在成煙中的填充率[2]。酶的優(yōu)點是有效降低化學反應勢能差，同時效率較化學法高很多，而且污染少、利用率高。利用酶解技術(shù)提高煙梗質(zhì)量的報道并不多，肖瑞云等利用多種多糖水解酶研究了不同組合的復合酶對煙梗吸味的影響，發(fā)現(xiàn)主要的影響是煙氣協(xié)調(diào)性指標的改善較為明顯[3]。張見等的研究更深入，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)各因素對煙梗還原糖含量影響顯著性排序是：水分>纖維素酶Ⅰ>果膠酶Ⅱ>溫度>果膠酶Ⅰ，優(yōu)化條件后半乳糖醛酸含量約為原來的10倍，果膠降解顯著[4-5]。徐達等的研究同樣具有相似的效果，梗絲水解后水溶性總糖含量提高了23.31%，果膠含量降低了17.26%[6]。也有報道將生香酵母接種于滅菌后的煙梗提取液上，在30 ℃下發(fā)酵2 d,結(jié)果表明發(fā)酵后的煙梗提取液中的可溶性糖，特別是葡萄糖含量明顯降低，同時有機酸含量增加,酸值提高，葡萄糖含量的降低對煙產(chǎn)品來說是不利的，雖然香氣有所提高但并不能說改善了煙梗質(zhì)量[7]。

利用酶解與發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)今提高煙草梗絲質(zhì)量的熱點，本研究擬利用從茶葉中獲得的塔賓曲霉(Aspergillustubingensis) GYC 501，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，降低梗絲中果膠含量，改善梗絲品質(zhì)。同時研究建立一套草酸銨浸提法測定煙梗果膠含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙草梗絲：來源于煙廠生產(chǎn)原料，空白膨脹梗絲(初始含水量12%)。

GYC 501發(fā)酵培養(yǎng)基：1.5 g煙草梗絲，加入50 mL蒸餾水，115 ℃濕熱滅菌30 min，取出冷卻后即可用于發(fā)酵。

含鹽酸的無水乙醇：將11 mL濃鹽酸與1 L無水乙醇混合。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測煙草中果膠的方法 本方法中的果膠含量測定部分來自國標法(GB/T 10742─2008)。

在無菌環(huán)境下將GYC 501孢子接入GYC 501發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，取出后先用一層紗布過濾，再用濾紙(快速型)過濾，得到GYC 501發(fā)酵酶液。之前的研究表明：GYC 501發(fā)酵液每1 mL酶液的酶活為192 U(將50 ℃反應30 min，每毫升酶液每小時水解蘋果果膠生成1 mg半乳糖醛酸的能力定義為一個酶活力單位)。將上一步得到的酶液加入到檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中(體積比例7∶3)，混合均勻后，均勻噴施于15 g煙梗上，加入后梗絲含水量為一定數(shù)值，恒溫培養(yǎng)箱中放置，分不同時間取出。 將處理過的(或未處理的空白對照)煙梗加入到800 mL 1%草酸銨溶液中，100 ℃水浴鍋中抽提3 h，隔0.5 h混勻一次。取出，使用16層紗布過濾液體部分，將殘渣留于瓶底，得抽提液。再次用200 mL 1%草酸銨溶液在相同條件下抽提0.5 h，將兩次抽提液混合，定容至1 L，混合均勻。 取50 mL上一步所得液體，立即加入180 mL含鹽酸的無水乙醇，混勻后過夜沉淀，濾紙過濾，烘干后稱重，計算粗果膠含量。

1.2.2 GYC 501發(fā)酵液降解梗絲的條件優(yōu)化 本實驗初始梗絲處理條件為：酶加入量1536 U(7.98 mL GYC 501發(fā)酵酶液)，加入發(fā)酵液后，用pH 5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將梗絲含水量調(diào)節(jié)為50%，緩沖液終濃度為0.1 mol/L，恒溫培養(yǎng)的溫度為37 ℃，處理時間分別為1、2、4、6、12、24、36、48、72 h，以確定處理時間。

此階段使用上一部分實驗建立的方法模型對GYC 501發(fā)酵液以及煙草梗絲的緩沖液pH、緩沖液濃度、處理梗絲的含水量、發(fā)酵溫度以及酶用量這5個條件，進行優(yōu)化處理。

1.2.2.1 緩沖液pH 分別配制檸檬酸、檸檬酸鈉緩沖液，按比例混合，pH 3.6按14.9∶5.1，pH 4.2按12.3∶7.7，pH 4.8按9.2∶10.8，pH 5.4按6.4∶13.6，pH 6.0按3.8∶16.2比例混合。發(fā)酵方法同1.2.1。

1.2.2.2 緩沖液濃度 按6.4∶13.6混合檸檬酸、檸檬酸鈉，終濃度設置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，緩沖液濃度為0時使用蒸餾水代替。發(fā)酵方法同1.2.1。

1.2.2.3 梗絲含水量 將GYC 501發(fā)酵液濃縮1倍，將緩沖液配制成pH 5.4，并與一定量的酶液混合，終濃度為0.1 mol/L，使最終加入的酶量為1536 U，最終含水量分別調(diào)至30%、35%、40%、45%、50%。其它條件與1.2.1中的相同。

1.2.2.4 溫度 使用1.2.2.3的條件將1.2.1中的發(fā)酵溫度調(diào)整為32、37、42、47 ℃。

1.2.2.5 酶用量 使用1.2.2.3的條件將酶用量調(diào)整為768、1536 、2189 、4378 U。

1.2.3 梗絲降解條件的正交優(yōu)化 在果膠降解工藝的單因素優(yōu)化之后，為確定多因素對梗絲果膠降解率的顯著影響，挑選溫度、緩沖液pH值、緩沖液濃度、處理時梗絲含水量這4個因素進行三水平正交試驗，條件設置如表1。

表1 正交試驗設計

溫度選擇在32、37、42 ℃是因為較低的溫度不利于酶發(fā)揮作用，而高于42 ℃會降低煙草梗絲的質(zhì)量；緩沖液pH條件根據(jù)上述單因素試驗制定；緩沖液濃度條件也是根據(jù)上述試驗制定；處理時梗絲含水量不超過50%，是根據(jù)煙草梗絲處理過程含水量的限制決定的。酶用量為1536 U，處理時間為12 h。

1.2.4 正交最優(yōu)解的驗證 從1.2.3正交試驗結(jié)果中得出可能的最優(yōu)組合：溫度為42 ℃，緩沖液pH為4.8，緩沖液濃度為0.3 mol/L，處理時梗絲含水量為50%。遂使用此條件驗證正交最優(yōu)解。酶用量為1536 U，處理時間為12 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 梗絲降解實驗

塔賓曲霉GYC 501的發(fā)酵液處理梗絲的效果良好(圖1)，1 h的降解效率就已經(jīng)達到18.65%，12 h能達到27.2%，而隨著時間的增加，36 h之后降解效率不再增加，說明發(fā)酵液中的酶活性在12 h后開始迅速降低。酶活性降低的主要因素有：其一，果膠被分解產(chǎn)生半乳糖醛酸，其為酸性物質(zhì)，當其生成量達到一定值時，緩沖液已經(jīng)無法承受巨大的pH變化，溶劑系統(tǒng)pH不再適合酶發(fā)揮作用，或者變性；其二，隨著時間變化，高溫環(huán)境下的酶緩慢失活。遂下述實驗采用12 h作為發(fā)酵終點。

2.2 梗絲降解的條件優(yōu)化

2.2.1 緩沖液pH pH為6的緩沖液處理效果最好(圖2)，但總體來說緩沖液pH對降解效率影響相對較小。根據(jù)之前的研究[8]，GYC 501的生長pH為偏酸性，所以下述實驗緩沖液pH維持在5.4。

圖2 GYC 501發(fā)酵液在不同pH下對梗絲的降解效果

2.2.2 緩沖液濃度 如圖3所示，緩沖液濃度為0 mol/L即無緩沖液時的降解效率為18.39%，效果最差；0.2 mol/L效果最好，為34.46%。由于過高的緩沖液濃度對煙草吸味影響極大，而缺少緩沖液則會影響酶正常發(fā)揮作用，遂以下實驗的緩沖液濃度維持0.1 mol/L不變。

2.2.3 梗絲含水量 含水量的數(shù)據(jù)(圖4)顯示，含水量對梗絲降解率影響巨大，含水量越大，果膠降解效率越好，但含水量過大不利于儲存等后續(xù)處理，所以選擇50%的含水量用于實驗。

2.2.4 溫度 在圖5中的溫度范圍內(nèi)，溫度對酶解的影響并不大，但是過高的溫度造成酶的失活，降低降解效率；以37 ℃為最佳。下述實驗采用37 ℃為發(fā)酵溫度。

圖3 GYC 501發(fā)酵液在不同緩沖液濃度下對梗絲的降解效果

圖4 GYC 501發(fā)酵液在不同梗絲含水量下對梗絲的降解效果

圖5 GYC 501發(fā)酵液在不同溫度下對梗絲的降解效果

2.2.5 酶用量 本實驗表明(圖6)，并非酶用量越大發(fā)酵效果越好，在設定條件下，酶加入量2189 U處理效果(果膠降解率32.38%)與4378 U的處理效果(果膠降解率32.64%)幾乎沒有差別。

圖6 GYC 501不同酶用量對梗絲的降解效果

2.3 梗絲降解條件的正交優(yōu)化

正交試驗顯示：基于設計的4種因素的取值范圍，它們對煙草梗絲降解效率影響的大小順序為：處理時梗絲含水量>緩沖液pH>溫度>緩沖液濃度。從實驗結(jié)果中得出可能的最優(yōu)組合：溫度為42 ℃，緩沖液pH為4.8，緩沖液濃度為0.3 mol/L，處理時梗絲含水量為50%。

正交試驗中，在組合實驗號為3(表2)的條件下達到的最佳梗絲果膠降解效果(果膠降解率為33.52%)與2.2.5優(yōu)化后的降解效果(果膠降解率為32.38%)相近，但是該條件下使用的酶用量僅為1536 U(2.2.5優(yōu)化后采用的酶用量為2189 U)，可見經(jīng)過合理的正交優(yōu)化設計，在提高梗絲果膠物降解效果的情況下，避免了過高的酶用量，而酶加入量的提高將直接使梗絲抽吸效果大打折扣。但是實際處理條件要根據(jù)煙梗抽吸結(jié)果做出一定妥協(xié)。

表2 正交試驗結(jié)果L9(34)

2.4 正交最優(yōu)解的驗證

正交最優(yōu)解的驗證實驗得到的梗絲果膠物降解率為34.97%，所以根據(jù)正交試驗推測的最優(yōu)組合為：溫度42 ℃，緩沖液pH 4.8，緩沖液濃度0.3 mol/L，處理時梗絲含水量50%。

3 討論

梗絲由于多糖類物質(zhì)含量高，引起吸味不佳，能應用到煙草加工中的量非常有限，造成了浪費。本研究利用本實驗室前期從煙梗中篩選到的能高效降解果膠的真菌GYC501對梗絲進行針對性的發(fā)酵，目的就是減少多糖含量，增加香氣的前體物質(zhì)還原性糖含量。利用微生物發(fā)酵酶液來低成本降解煙梗多糖物質(zhì)的相關(guān)研究較少。郝輝等成功利用微紫青霉(Penicilliumjanthinellumsw 09)降解煙梗41.35%的果膠，但其產(chǎn)酶培養(yǎng)基成本高昂[9]，而本實驗利用的發(fā)酵培養(yǎng)液中只含有煙梗、水兩種成分，能顯著降低酶法降解的成本。

目前測定煙草中果膠含量的方法經(jīng)常采用非常繁瑣的色譜法，甚至動用掃描顯微鏡, 只有少數(shù)采用草酸銨浸提法[10-11]。本項目采用草酸銨抽提、酸性乙醇沉淀的化學方法收集果膠以對降解效果進行評價，有望解決測定成本過高、耗時長的問題。通過發(fā)酵條件及檢測條件的優(yōu)化，提高了GYC501對梗絲的發(fā)酵效率，從而有效提高煙梗及梗絲的品質(zhì)，增加其在卷煙配方中的適用性。

4 結(jié)論

本研究使用GYC 501在煙草梗絲培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后所得到的發(fā)酵液對煙草梗絲進行發(fā)酵處理，經(jīng)優(yōu)化后得到了最佳的發(fā)酵條件：在酶使用量為1536 U的情況下，溫度為37 ℃，緩沖液pH為4.8，緩沖液濃度為0.3 mol/L，梗絲含水量為50%。在此條件下，梗絲果膠降解率最佳，為34.97%；最終發(fā)酵效果良好，梗絲降解率從27.2%優(yōu)化到34.97%，正交優(yōu)化后酶的使用量較單因素優(yōu)化后減少了50%。菌株GYC 501對于改善梗絲質(zhì)量有較好的應用前景，下一步將檢測評吸效果及煙氣成分，了解利用GYC501發(fā)酵后對梗絲成分及吸味的具體影響。

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(責任編輯：許晶晶)

Application of Pectin-degrading FungusAspergillustubingensisGYC 501 in Improvement of Tobacco Cut-stem Quality and Optimization of Its Fermentation Conditions

LONG Zhang-de1, CHEN Hao-rui2, LIU Hong1*, ZOU Ke-xing1,SUN Jian-sheng1, LI Ji-gang1, XUE Yun1, SHEN Pei-hong2*

(1. China Tobacco Guangxi Industrial Limited Company, Nanning 530001, China;2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

There are a large amount of cell wall substances such as pectin and cellulose in tobacco stem, and these substances cause bad smoking quality, thus tobacco stem application is limited in manufacture. This research treated tobacco cut-stem with the fermentation liquid ofAspergillustubingensisGYC 501 to degrade the polysaccharides (mainly being pectin) in it and to improve its smoking quality. A relative simple method for measuring the pectin content in tobacco cut-stem was built. The fermentation conditions (fermentation time, buffer solution concentration, buffer solution pH-value, fermentation temperature, pectinase application rate, and so on) of tobacco cut-stem were optimized by single-factor experiment and orthogonal test. The fermentation liquid ofA.tubingensisGYC 501, which was obtained by culturing this fungus in the tobacco cut-stem liquid medium for 48 h, was applied to ferment the tobacco cut-stem. The optimal fermentation conditions were obtained as follows: pectinase application rate 1536 U, fermentation time 12 h, fermentation temperature 42 ℃, buffer solution pH 4.8, 0.3 mol/L buffer solution, cut-stem moisture content 50%. Under the above optimum fermentation conditions, the degrading rate of pectin in tobacco cut-stem was the highest, reaching 34.97%.

Tobacco cut-stem;Aspergillustubingensis; Pectinase; Fermentation conditions optimization; Orthogonal test

2016-11-23

廣西科技廳科技攻關(guān)項目(桂科攻15118006)。

龍章德(1970─)，男，高級農(nóng)藝師，博士，從事煙葉原料研究。*通訊作者：劉鴻、申佩弘。

Q815

A

1001-8581(2017)02-0095-04