急性肝損傷大鼠肝組織HSP60的變化及意義

曹 東，朱美意，吳江文，周 濤，歐陽(yáng)軍

目的 觀察大鼠急性肝損傷過(guò)程中熱休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）的變化及其與肝損傷的相關(guān)性。方法 126只清潔級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為空白組（n=42）、非肝損傷組（n=42）和肝損傷組（n=42）?？瞻捉M不作任何處理；非肝損傷組大鼠進(jìn)行左腿大腿骨折處理，肝損傷組用改良型BIM-Ⅳ（biological impact machine-Ⅳ）生物撞擊機(jī)撞擊誘導(dǎo)急性肝損傷。各組處理后于6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d取血液檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase, AST）水平；之后殺鼠取肝，蘇木精—伊紅染色法（hematoxylin-eosin,HE）染色觀察肝組織病理變化；免疫組化染色檢測(cè)HSP60蛋白表達(dá)。結(jié)果 （1）空白組與非肝損傷組在上述各時(shí)間段的ALT、AST表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組及非肝損傷組相比，肝損傷組于6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d血清ALT、AST含量顯著增高（P＜0.05），且在6 h顯著升高[（104.17±4.07）U/L，（271.00±15.84）U/L]，12 h達(dá)到頂峰[（424.50±10.84）U/L，（787.70±32.68）U/L]，之后不斷下降，在3 d時(shí)恢復(fù)正常；（2）HE染色示，肝損傷組肝小葉結(jié)構(gòu)排列紊亂，氣球樣變明顯，在12 h最為明顯；（3）免疫組化HSP60染色，肝損傷組織在6 h開(kāi)始顯著高于空白組和非肝損傷組，12 h達(dá)到頂峰，1～3 d持續(xù)高于空白組和非肝損傷組，5 d時(shí)恢復(fù)正常水平；（4）HSP60蛋白表達(dá)與血清中ALT（r=0.9064，P＜0.05)、AST（r=0.9294, P＜0.05）表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論 大鼠急性肝損傷過(guò)程中HSP60的表達(dá)量有明顯的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律, 與大鼠肝臟損傷程度變化一致。

大鼠；肝損傷； HSP60；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

熱休克蛋白（ heat shock proteins, HSPs） 是生物體在受到缺氧、感染、寒冷、中毒、機(jī)械損傷等刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于微生物和動(dòng)、植物體內(nèi)[1]。1962年Ritossa將果蠅幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)溫度從25℃提高到30℃后30 min,觀察到其唾液腺染色體上出現(xiàn)了特殊的“膨突”[2]。直到1974 年，Tissieres研究證實(shí)這種現(xiàn)象是因?yàn)闇囟壬咴鰪?qiáng)了這一區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄，相應(yīng)生成了一系列蛋白質(zhì)，被命名為HSPs[3]。HSPs按照蛋白分子量不同分為五類(lèi)，分別是HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱休克蛋白[4]。早期研究證明，HSPs具有保護(hù)細(xì)胞不受刺激傷害，并促進(jìn)細(xì)胞在各種刺激引起的損傷中自我修復(fù)的功能[5]。其中HSP60是線粒體蛋白，不僅在細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞程序性死亡中起著重要的作用，而且在翻譯后的蛋白質(zhì)修飾過(guò)程中可作為分子伴侶，幫助重新折疊錯(cuò)誤構(gòu)象的多肽鏈和蛋白質(zhì)，還可以幫助清除已經(jīng)發(fā)生不可逆損傷的蛋白，具有變性蛋白優(yōu)先結(jié)合能力，從而保護(hù)細(xì)胞不受應(yīng)激傷害[6]。肝臟是人體最大的腺體，參與體內(nèi)消化、代謝、排泄、排毒及免疫等多種功能。現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展、生活方式的改變及各種暴力所致的肝損傷乃至肝病、肝衰竭嚴(yán)重影響患者預(yù)后。肝臟損傷或部分切除后，其預(yù)后主要取決于肝臟損傷后的修復(fù)再生能力。而肝臟再生能力的基礎(chǔ)是其具有的結(jié)構(gòu)與功能的可塑性，然而，肝細(xì)胞再生修復(fù)可塑性的分子機(jī)制至今仍未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)主要研究HSP60蛋白在生物撞擊誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，進(jìn)一步探討HSP60蛋白在急性肝損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 取8周齡、清潔級(jí)雌性SD大鼠126只，體重（180±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)[XJZZQ（XK）200301]。

1.2 試劑和儀器 2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）；肝素（20 U/ml）；免疫組織化學(xué)鏈霉素卵白素（streptavidinperosidase，SP）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；HSP60抗體（一抗為單克隆抗體，型號(hào)UB59457,購(gòu)自于美國(guó)Abcam公司，相應(yīng)二抗購(gòu)于北京中杉金橋公司）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase, AST）試劑盒（北京中杉金橋公司）；BIM-Ⅳ型生物撞擊機(jī)改良型：由鋼球、鋼管、二次撞擊頭、動(dòng)物固定臺(tái)、支架等組成；多功能生理監(jiān)護(hù)儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；Sartorius電子天平（深圳朗普電子科技有限公司）；鼠板；CHK Olympus 顯微鏡 （Olympus 公司，日本）。

1.3 分組和模型制備 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前8 h禁食，不禁水，并經(jīng)普通觀察無(wú)異常后，將 126 只大鼠采用區(qū)組隨機(jī)化的方法分為3組：空白組、非肝損傷組、肝損傷組，每組 42 只；各組又隨機(jī)化分亞組6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d，每組6只；大鼠先用2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉后，取仰臥位固定于鼠板，腹部及右腹股溝部備皮。分離右股動(dòng)脈并肝素化。右股動(dòng)脈插管，通過(guò)壓力傳感器連接于多功能生理監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測(cè)心率及血壓并用于取血。插管成功后，空白組不給予任何干預(yù)措施；非肝損傷組機(jī)械外力致傷大鼠左大腿造成骨折；肝損傷組將其置于BIM-Ⅳ改良型生物撞擊機(jī)打擊頭下，采用質(zhì)量363 g的鋼球自撞擊機(jī)導(dǎo)管1 m高處以自由下落的方式對(duì)打擊頭進(jìn)行撞擊，打擊頭直徑1.2 cm。打擊頭獲得動(dòng)能和動(dòng)量，對(duì)動(dòng)物劍突與右肋弓夾角處行二次打擊致肝臟鈍性撞擊破裂傷。

撞擊過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)：撞擊動(dòng)能E=mgh，g=9.8 m/s2；撞擊動(dòng)量P=mv；撞擊速度v= 2gh≈4.427 m/s；自由落體運(yùn)動(dòng)時(shí)間T≈0.452 s；打擊面積S=πr2≈3.14×0.62=1.1304 cm2；E=0.363×9.8×1≈3.557 J，P=0.363×4.427≈1.607 kg/（m·s）。

各組大鼠于處理后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d股動(dòng)脈取血2 ml裝于促凝管中，血液室溫靜置30 min后3000 r/min離心10 min，取血清（即造模后血清）分裝4℃保存,待統(tǒng)一進(jìn)行血清指標(biāo)檢。取血后處死大鼠，分離出肝臟標(biāo)本，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋。

1.4 血清肝功能 血清ALT、AST含量測(cè)定，均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.5 肝組織病理學(xué)觀察 取肝組織石蠟塊，制備切片（4～10 μm），蘇木精—伊紅染色法（hematoxylin-eosin stainin，HE）染色，顯微鏡下觀察（×200）肝組織病理學(xué)變化。

1.6 免疫組化檢測(cè)HSP60表達(dá) 取肝組織石蠟塊，切片（4～10 μm），脫蠟后EDTA抗原修復(fù)液高壓修復(fù)法修復(fù)抗原，恢復(fù)室溫后3%的H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗 3次，血清封閉液37℃封閉30 min，加入一抗[抗體濃度1∶200，溶于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中]，4℃孵育過(guò)夜后用PBS洗滌3次，再加二抗室溫孵育30 min，用PBS洗滌3次，最后二氨基聯(lián)苯氨（diaminobezidin，DAB）顯色，HE輕度復(fù)染。脫水，透明，封片，光鏡觀察。每次實(shí)驗(yàn)均以PBS替代一抗體作為陰性對(duì)照。

1.7 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為HSP60蛋白染色陽(yáng)性。結(jié)果由2位病理醫(yī)師獨(dú)立判定評(píng)分，在高倍鏡下隨機(jī)取五個(gè)視野，免疫組化得分（immunoreactivity score，IS）由染色面積×染色強(qiáng)度來(lái)判斷。A為染色面積，按切片中顯色細(xì)胞比例評(píng)分，1分為顯色細(xì)胞占切片中細(xì)胞總數(shù)的1/3 以下；2 分為1/3～2/3細(xì)胞顯色；3分為2/3 以上細(xì)胞顯色。B為染色強(qiáng)度，按切片中細(xì)胞顯色有無(wú)及深淺評(píng)分，0分為細(xì)胞無(wú)著色；1分為顯色淺黃色；2分為顯色深黃色；3分為顯色棕褐色。每例樣本IS積分=A×B，按積分高低區(qū)分，＜1分為陰性（－）；2～4分為陽(yáng)性（+）；＞5分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x ±s表示，其中符合正態(tài)分布的計(jì)量資料,三組間差異比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行。正態(tài)分布資料采用Pearson相關(guān)，非正態(tài)分布資料采用Spearman相關(guān)分析。所有檢驗(yàn)以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組處理對(duì)大鼠肝功能影響 為觀察誘導(dǎo)的急性肝損傷鼠肝臟功能的動(dòng)態(tài)變化，用生化法檢測(cè)大鼠血清ALT、AST水平?？瞻捉M、非肝損傷組及肝損傷組大鼠在處理后6、12 h及1、2、3、5、7 d時(shí)血清ALT、AST水平的變化，見(jiàn)表1。在各個(gè)時(shí)間段，非肝損傷組大鼠肝臟ALT、AST水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在6 h時(shí)，肝損傷組ALT、AST水平較空白組及非肝損傷組有顯著升高（P＜0.05），并且在12 h時(shí)ALT水平達(dá)到高峰（P＜0.05），提示造模成功；在 1、2 d時(shí)，肝損傷組ALT、AST水平有所下降，但仍顯著高于空白組及非肝損傷組 （P＜0.05），3 d時(shí)肝損傷組ALT、AST表達(dá)仍高于空白組及非肝損傷組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；5、7 d時(shí)ALT、AST表達(dá)恢復(fù)正常水平，其他組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 三組處理后大鼠肝臟組織病理學(xué)的變化 為了進(jìn)一步確定肝組織損傷情況，采用HE染色檢測(cè)肝組織病理?yè)p傷情況，結(jié)果顯示，空白組和非肝損傷組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常、排列整齊；肝損傷組6 h時(shí)肝小葉結(jié)構(gòu)排列紊亂，鏡下肝細(xì)胞腫脹氣球樣，肝細(xì)胞點(diǎn)狀和小片狀壞死；肝損傷組12 h時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)展為大片狀壞死，由圖可見(jiàn)本研究成功地建立了急性肝損傷模型（圖1）。

2.3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織HSP60的表達(dá) 采用免疫組化技術(shù)觀察急性肝損傷大鼠肝臟HSP60表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（圖2、圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組和非肝損傷組大鼠肝臟中HSP60均有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，但兩組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝損傷組大鼠在處理后6 h的HSP60表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），12 h達(dá)到高峰（P＜0.05）； 1、2、3 d時(shí)肝細(xì)胞特異性染色明顯減弱，但仍高于空白組和非肝損傷組（P＜0.05）；5、7 d時(shí)HSP60表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。

表1 三組處理后大鼠的血清ALT、AST表達(dá)

圖1 三組急性肝損傷大鼠肝臟病理切片（HE×200）

圖2 三組處理后大鼠肝臟組織HSP60蛋白表達(dá)（免疫組化染色×200）

圖3 三組處理后大鼠肝臟組織HSP60蛋白表達(dá)免疫組化評(píng)分

2.4 HSP60與肝損傷的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示：HSP60表達(dá)與肝損傷大鼠血清中ALT之間存在顯著的正相關(guān)（r=0.9064, P＜0.05，圖4），同時(shí)HSP60與肝損傷大鼠血清AST也呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.9294, P＜0.05，圖5）。

3 討 論

圖4 HSP60表達(dá)與肝損傷大鼠血清中ALT呈正相關(guān)性（Person相關(guān)）

圖5 HSP60表達(dá)與肝損傷大鼠血清AST呈正相關(guān)性（Person相關(guān)）

急性肝損傷是由于各種肝臟相關(guān)疾病、藥物性肝損傷、大量飲酒、鈍性撞擊等所誘導(dǎo)的急性病變，如不及時(shí)治療可發(fā)展為急性肝功能衰竭，病死率高[7]。因此，早期診斷、治療急性肝功能損傷在臨床上具有十分重要的意義。急性肝損傷可刺激機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)各種信號(hào)分子的傳導(dǎo)從而增強(qiáng)機(jī)體的保護(hù)能力[8]。近年研究表明，預(yù)熱和缺血預(yù)處理都會(huì)使肝臟組織HSP增加，HSPs在肝臟應(yīng)激中起保護(hù)作用[9，10]。如在受熱刺激的肉雞肝臟中，HSP90累積，提高肝臟的耐熱性[11]。大鼠經(jīng)熱休克處理24 h后，其心、肝、腦、肺、腎等五種組織中的HSP70含量均較正常對(duì)照組顯著增加。在肝臟手術(shù)切除創(chuàng)傷研究中發(fā)現(xiàn)，HSP70表達(dá)的量與創(chuàng)傷程度呈正相關(guān)，因此，HSP70可作為評(píng)斷手術(shù)創(chuàng)傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)。HSP70在大鼠酒精性肝損傷中同樣具有重要的保護(hù)作用。相對(duì)于HSP70而言，HSP60作為熱休克蛋白家族重要的一員，其在肝臟損傷及修復(fù)過(guò)程中的變化及作用卻一直未被研究。因此，本研究制備了生物撞擊機(jī)撞擊誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的模型，觀察空白組、非肝損傷組和肝損傷組大鼠肝臟組織的病理變化，檢測(cè)了各組大鼠血清 ALT、AST 的變化趨勢(shì)及肝組織中HSP60的動(dòng)態(tài)表達(dá)，從而探討HSP60在生物撞擊誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷和肝再生中的作用。肝臟病理組織學(xué)結(jié)果和各組血清ALT、AST的變化趨勢(shì)進(jìn)一步證明了大鼠急性肝損傷的病理過(guò)程中伴隨著肝臟的再生修復(fù)過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，HSP60的表達(dá)量也隨著急性肝損傷的加重，呈現(xiàn)出一定變化規(guī)律，說(shuō)明HSP60可能與肝臟的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制存在密切聯(lián)系。

ALT、AST主要分布于肝組織肝細(xì)胞的細(xì)胞漿和線粒體中，而血清中ALT、AST含量很少。當(dāng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損或壞死時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加并導(dǎo)致線粒體損傷，胞質(zhì)中ALT、AST大量流出，血清中ALT、AST水平就明顯升高，提示肝細(xì)胞破壞，所以ALT、AST是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,肝損傷組采用生物撞擊法處理大鼠，與空白組比較,血清中ALT、AST含量顯著增高,提示肝細(xì)胞受損嚴(yán)重；而肝損傷組與非肝損傷組比較, ALT、AST 的增加，并且非肝損傷組ALT、AST水平與空白組無(wú)差別，說(shuō)明ALT、AST升高主要由肝損傷引起，從而排除生物撞擊引起其他組織損傷對(duì)ALT、AST水平的影響。進(jìn)一步肝組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝損傷組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞及肝細(xì)胞腫脹、壞死，空白組和非肝損傷組肝組織正常。

HSP60是熱休克蛋白家族的一員，是一種線粒體蛋白，也是在機(jī)體損傷刺激導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)中起保護(hù)作用的一類(lèi)高度保守的蛋白質(zhì)[13]。HSP60在大鼠睪丸的缺血－再灌注后，表達(dá)高于正常水平，而相應(yīng)的細(xì)胞凋亡減少，因此推測(cè)HSP60在缺血狀態(tài)應(yīng)激高表達(dá)，暫時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)機(jī)體以減少損傷，這共同說(shuō)明HSP60在機(jī)體損傷過(guò)程中起保護(hù)作用[14]。這可能與HSP60的各種重要生物學(xué)保護(hù)功能有關(guān)[15]：（1）分子伴侶作用，HSP10通過(guò)結(jié)合HSP60來(lái)調(diào)節(jié)其與底物的結(jié)合及三磷酸腺苷（adenosinetriphosphatase，ATP）酶的活性，從而幫助重新折疊錯(cuò)誤構(gòu)象的多肽鏈和蛋白質(zhì)，并且?guī)椭宄l(fā)生不可逆損傷的蛋白，使細(xì)胞不受應(yīng)激傷害。（2）抗細(xì)胞凋亡的作用，有直接和間接兩種方式。直接作用是指HSP60影響線粒體內(nèi)的凋亡相關(guān)因子，抑制線粒體凋亡通路的激活；間接作用為HSP60通過(guò)維持正常的呼吸鏈運(yùn)作，減少自由基的產(chǎn)生從而抑制凋亡。（3）抗氧化作用，應(yīng)激時(shí)氧自由基增多，通過(guò)氧化脂質(zhì)會(huì)對(duì)生物膜的液態(tài)性、流動(dòng)性、通透性產(chǎn)生影響，而對(duì)細(xì)胞及亞細(xì)胞器如線粒體、溶酶體等造成破壞。HSP60與脂膜結(jié)合，防止自由基對(duì)脂膜的損傷。另外，HSP60可直接釋放和增加內(nèi)源性過(guò)氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平，催化氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)從而清除氧自由基。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在急性肝損傷中，HSP60表達(dá)量與肝損傷進(jìn)程密切相關(guān)：6、12 h, 肝損傷組ALT、AST不斷增加，說(shuō)明肝損傷逐漸加重，HSP60的表達(dá)量逐漸上升，可能是其對(duì)肝臟保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)的表現(xiàn)。12 h后，血清標(biāo)記物ALT、AST和組織觀察肝臟的損傷程度也逐漸降低，HSP60的表達(dá)量開(kāi)始下降，說(shuō)明可能隨著肝損傷逐漸得到修復(fù)，HSP60的保護(hù)作用下降；肝損傷在第3天恢復(fù)至正常，HSP60蛋白在第5天恢復(fù)正常，說(shuō)明在肝損傷恢復(fù)正常過(guò)程中，HSP60的保護(hù)作用也逐漸消失。在整個(gè)急性肝損傷過(guò)程中, HSP60的表達(dá)量也隨著肝損傷的加重或修復(fù)，呈現(xiàn)出一定變化規(guī)律，說(shuō)明HSP60可能與肝臟的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制有關(guān)。綜上所述，在生物撞擊處理誘導(dǎo)的急性肝損傷過(guò)程中，肝臟產(chǎn)生HSP60增多與肝損傷程度呈正相關(guān)，因此HSP60可作為急性肝損傷的分子標(biāo)記物，并可能在肝損傷過(guò)程中起保護(hù)作用，但其在肝損傷修復(fù)過(guò)程中的具體作用機(jī)制，仍有待深入研究。

[1]陳明帥，徐 超，宋新超.熱休克蛋白的研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2016, 20（1）：44-53. DOI: 10.13326/j. jea.2016.1116.

[2]Luo J, Shen W L, Montell C. TRPA1 mediates sensation of the rate of temperature change in Drosophila larvae [J]. Nat Neurosci, 2017, 20（1）: 34-41. DOI: 10.1038/nn.4416.

[3]喻荷淋，陳 雋.熱休克蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013, 42（5）：585-587. DOI: 10.3969/j.issn.1671-8348.2013.05.042.

[4]栗振義，龍瑞才.植物熱激蛋白研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào), 2016, 32（2）: 7-13. DOI: 10.13560/j.cnki.biotech. bull.1985.2016.02.003.

[5]Yan Z, Wei H, Ren C, et al. Gene expression of Hsps in normal and abnormal embryonic development of mousehindlimbs [J]. Hum Exp Toxicol, 2015, 34（6）: 563-574. DOI: 10.1177/0960327114555927.

[6]Shi J, Fu M, Zhao C, et al.Characterization and function analysis of Hsp60 and Hsp10 under different acute stresses in black tiger shrimp, Penaeus monodon [J]. Cell Stress and Chaperones, 2016, 21（2）: 1-18. DOI: 10.1007/s12192-015-0660-6.

[7]齊 芬，任曉非，許建明.急性藥物性肝損傷的臨床研究[J].安徽醫(yī)藥, 2016, 20（8）: 1603-1605. DOI: 10.3969/j.issn.1008-1704.2016.05.003.

[8]陳欣黎，孟 強(qiáng)，劉克辛. STAT3信號(hào)通路在肝損傷保護(hù)中的作用[J].世界華人消化雜志, 2014（8）: 1051-1057. DOI: 10.11569/wcjd.v22.i8.1051.

[9]張 翌，蔡 遜，潘明新. 供肝缺血預(yù)處理保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2011, 25（3）: 181-183.

[10]韓效帆, 張培建.熱休克蛋白70保護(hù)肝缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)普通外科雜志, 2013, 22（1）: 98-103. DOI: 10.7659/j.issn.1005-6947.2013.01.023.

[11]雷 蕾, 鮑恩東.急性熱應(yīng)激肉雞組織中Hsp90的表達(dá)與應(yīng)激損傷[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41（11）：3816-3821. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.11.050.

[12]雷 箴，溫 韜.松果菊苷對(duì)刀豆蛋白A所致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及對(duì)細(xì)胞外組蛋白的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2016, 41（2）: 97-102. DOI: 10.11855/j. issn.0577-7402.2016.02.03.

[13]張國(guó)銳,王元星.誘導(dǎo)熱休克蛋白70形成預(yù)處理對(duì)心肌保護(hù)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2016, 32（14）: 2199-2201. DOI: 10.3969/j.issn.1009-5519.2016.14.029.

[14]周利敏,姚冬梅.小鼠睪丸缺血-再灌注損傷過(guò)程中Hsp60的變化及其作用[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，8（6）: 640-643. DOI: 10.3969/j.issn.1674-2257.2013.06.002.

[15]Speciale A, Chirafisi J, Saija A. Nutritional antioxidants and adaptive cell responses: an update [J]. Current Molecular Med, 2011, 11（9）: 770-789. DOI：10.2174/ 156652411798062395.

（2016-11-30收稿 2016-01-10修回）

（本文編輯 羅發(fā)菊）

Changes and significance of hepatic HSP60 in acute liver injury in rats

CAO Dong, ZHU Meiyi, WU Jiangwen, ZHOU Tao, and OUYANG Jun. Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Medical College, Shihezi University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Shihezi 832000, China

OUYANG Jun, E-mail：ouyang-jzk@163.com

Objective This study was designed to observe the changes of heat shock protein 60 (HSP60) in the development of acute hepatic injury and analyze the relationship between HSP60 and acute hepatic injury in rats. Methods 126 SD rats were randomly allocated into three groups: blank control group, non-liver injury group and liver injury group. Rats in the control group received no injury, rats in the non-liver injury group received a left leg fracture and rats in the liver injury group received an acute hepatic injury induced by a modified biological impact machine-IV(BIM-Ⅳ). Blood samples from the three groups were collected at 6 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 5 days and 7 days to determine the alanine aminotransferase (ALT) and aspartate transaminase (AST) levels. The samples were cut and the livers of rats were disected soon after, and pathomorphological changes of liver tissue samples were examined under a microscope by means of hematoxylin-eosin (HE) stainning. Immunohistochemical staining was also used to detect the changes of HSP60 during acute liver injury in rats. Results (1) The levels of ALT and AST in non-hepatic injury group did not significantly change compared to the control group at each time point as mentioned above（P＞0.05）. Compared with the blank group and non-liver injury group, the serum ALT and AST levels in liver injury group were significantly higher at 6 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 5 days and 7 days respectively (P＜0.05 ), and they increased significantly at the 6 hour mark [(104.17±4.07) U/L, (271.00±15.84) U/L] and peaked at 12 hours [(424.50±10.84) U/L, (787.70±32.68) U/L], then went down and returned normal levels on the 3rd day. (2) HE staining showed inflammatory cell infiltration and cell degeneration in hepatic injury group, the damage was most marked at 12 hours. (3) The immunohistochemical staining showed the levels of HSP60 in the hepatic injury group was significantly increased compared to the control group at both the 6 and 12 hour mark and reached the its highest level at 12 hours. The expression of HSP60 went down on the 1st, 2nd, and 3rd day, but was still higher than the control group until the 5th day, when it returned to the basal level. (4) There was significant correlation between the level of HSP60 and ALT (r=0.9064, P＜0.05) and AST (r=0.9294, P＜0.05). Conclusions The expression of HSP60 significantly changes during acute liver injury, which is consistent with the change of degree of liver injury in rats.

rats; hepatic injury; heat shock protein 60; alanine aminotransferase; aspartate aminotransferase

R332；R364

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.02.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81560312）

832000，新疆維吾爾自治區(qū)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科

歐陽(yáng)軍，E-mail：ouyang-jzk@163.com