蔡盡忠

(福建省廈門華廈學(xué)院檢驗科學(xué)與技術(shù)系 361021)

20世紀80年代中期，Smith等[1]在絲狀噬菌體分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上提出了噬菌體展示技術(shù)(phage display technique)。1989年，英國Winter研究組和美國Lernard研究組同時創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術(shù)(phage antibody library technique)。1990年，McCafferty[2]在絲狀噬菌體表面成功展示具有抗原結(jié)合能力的抗體片段，進一步推動了噬菌體抗體庫技術(shù)的研究。

噬菌體抗體庫技術(shù)是利用PCR擴增出抗體的全套可變區(qū)基因，利用噬菌體表面展示技術(shù)把Fab段或單鏈抗體(ScFv)表達在噬菌體表面，并進一步通過“吸附—洗脫—擴增”方法篩選和富集特異性抗體的技術(shù)[3]。這一技術(shù)將表型與基因型聯(lián)系在一起，將抗體識別抗原的能力與噬菌體擴增的能力結(jié)合在一起，是一項極為高效的表達、篩選體系，在生物技術(shù)領(lǐng)域極具應(yīng)用前景[4]。本文綜述噬菌體抗體庫的構(gòu)建原理、技術(shù)過程及應(yīng)用。

1 噬菌體抗體庫的技術(shù)原理

噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達和篩選的技術(shù)，即將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達，展示在噬菌體顆粒的表面[5]。這樣，外源蛋白或多肽的基因型與表型統(tǒng)一在同一噬菌體顆粒內(nèi)，通過表型篩選就可以獲得相應(yīng)的編碼基因。

雖有多種外殼蛋白被用于噬菌體展示，但目前文獻報道的用于抗體分子展示的主要是PⅢ蛋白和PⅧ蛋白[6]。PⅢ蛋白位于噬菌體顆粒的尾端，含有406個氨基酸殘基，由3個結(jié)構(gòu)域組成，每個噬菌體含有3～5個副本。3個結(jié)構(gòu)域由甘氨酸富集的連接肽串聯(lián)起來，在結(jié)構(gòu)上具有高度易變性和靈活性，故其N端可以插入較大的外源片段而不影響噬菌體的結(jié)構(gòu)和功能，而且融合表達的外源片段還可保持相對獨立的結(jié)構(gòu)構(gòu)象[7]。PⅧ蛋白是噬菌體的主要外殼蛋白，含有32個氨基酸殘基，每個噬菌體含有3～5個副本。其C端與噬菌體DNA結(jié)合，構(gòu)成噬菌體包膜的內(nèi)壁，N端游離在外，可容納較小的外源片段。

噬菌體展示的抗體是在噬菌體表面表達的抗體分子Fab或ScFv，這種表達是通過Fab或ScFv與載體即噬菌體外殼蛋白(PⅢ或PⅧ蛋白)形成融合蛋白而完成。其特點是噬菌體載體既可以識別相應(yīng)抗原并與之相結(jié)合，又能夠感染宿主菌而進行再擴增，實現(xiàn)相應(yīng)融合蛋白的擴增，再經(jīng)過“吸附—洗脫—擴增”過程就能篩選并富集特異性抗體。將B細胞全套可變區(qū)基因克隆出來，組成噬菌體抗體的群體，就成為了噬菌體抗體庫[8]，而建立噬菌體抗體庫的全套方法便被稱為噬菌體抗體庫技術(shù)。它的最大特點是實現(xiàn)了直接將基因型和表型聯(lián)系在一起，可以快速而高效地從大量克隆中篩選出特異性抗體。根據(jù)抗體基因的來源和組成不同，噬菌體抗體庫可分為天然抗體庫、免疫抗體庫、半合成抗體庫和轉(zhuǎn)基因鼠抗體庫。

噬菌體抗體庫技術(shù)的產(chǎn)生依賴于三項實驗技術(shù)的發(fā)展：一是簡并引物的設(shè)計成功及從雜交瘤細胞中擴增出全套抗體可變區(qū)基因的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增技術(shù)的創(chuàng)建；二是從大腸桿菌分泌有結(jié)合功能的免疫球蛋白分子片段的成功；三是噬菌體表面展示技術(shù)的建立。

應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)制備抗體的優(yōu)勢在于：①方法簡單快速高效，不經(jīng)過雜交瘤技術(shù)和不需復(fù)雜的基因工程技術(shù)，制備一株抗體僅需幾周時間；②抗體篩選范圍廣，可對百萬至億萬個分子進行選擇；③用不同的抗原進行篩選，可同時獲得幾種不同的抗體。

2 噬菌體抗體庫的構(gòu)建過程

構(gòu)建噬菌體抗體庫主要可以分為以下3個步驟：

2.1 擴增全套抗體基因 獲取已經(jīng)過免疫的人外周血淋巴、脾、扁桃腺、淋巴結(jié)組織或骨髓細胞，從中提取總RNA或基因組DNA。理論上每個靜止期B細胞可產(chǎn)生100個拷貝的Ig mRNA，而增殖期的漿細胞可產(chǎn)生300個。因此，免疫接種可明顯提高Ig mRNA和編碼抗原結(jié)合部位V區(qū)基因的數(shù)量。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增技術(shù)獲得建庫所需的全套抗體基因[9～12]。

抗體基因擴增的5′端引物的設(shè)計通常是根據(jù)成熟抗體V區(qū)外顯子的框架1區(qū)(FR1)或前導(dǎo)區(qū)的保守序列，而3′端引物的設(shè)計則主要依據(jù)抗體絞鏈區(qū)(J區(qū))的保守序列。根據(jù)已有的抗體庫基因序列庫(Kabat database， V-base， IMGT等)，設(shè)計簡并引物。分別對抗體 cDNA或DNA擴增后，將擴增產(chǎn)物予以混合。若制備ScFv抗體基因片段，須設(shè)計接頭(linkers)DNA，如[Gly4-Ser]3的編碼寡核苷酸，制備VH-linker-VL基因連接物，進行下一步的基因克隆與表達[13，14]。

2.2 構(gòu)建合適的噬菌體表面展示載體 噬菌體抗體庫技術(shù)使用的載體是在已有的噬菌?；A(chǔ)上改建的。這些載體都具備必需的元件, 包括啟動子、大腸桿菌前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合部位、供外源基因插入的多克隆位點以及絲狀噬菌體M13的外殼蛋白基因。pcomb3是一個經(jīng)常用于噬菌體建庫的載體，它除了保留原載體中的前導(dǎo)序列及供外源基因插入的多克隆位點外，還引入來自M13噬菌體LacZ啟動子、操縱子及用于控制輕鏈基因的帽子結(jié)合位點等。對其進一步拼接編碼M13噬菌體外殼蛋白的gⅢ基因，并在克隆位點上加入來自于pbluescript的填充片段便構(gòu)成了4029 bp的pcomb3。使用載體構(gòu)建抗體基因庫時，可將獲得的全套重鏈和輕鏈基因以適當?shù)膬?nèi)切酶消化后，克隆進載體的相應(yīng)酶切位點。經(jīng)過隨機重排組合將這些基因插入到噬菌體或噬菌粒表達載體多克隆位點中。經(jīng)克隆進入載體的重、輕鏈基因間的配對也存在著很大的隨機性，這可以豐富抗體庫的內(nèi)涵，增加抗體庫的多樣性。

2.3 將抗體基因庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌備用 在建庫過程中由于PCR擴增，半合成寡核苷酸的引入以及多步酶學(xué)反應(yīng)等因素產(chǎn)生的重復(fù)克隆、無效克隆及克隆數(shù)丟失，使庫容量偏小。因此，噬菌體抗體庫的大小與大腸桿菌轉(zhuǎn)化率明顯相關(guān)。通過優(yōu)化實驗條件，提高限制性內(nèi)切酶的酶切與連接效率；選擇合適的載體與目的基因的比例；選用轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細胞，能提高單次連接和轉(zhuǎn)化的效率。再通過增加連接與轉(zhuǎn)化的次數(shù)，就能使400 μL感受態(tài)的大腸桿菌經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化，至少有108個細胞可被噬菌粒載體轉(zhuǎn)染。這與體內(nèi)抗體庫獨特型數(shù)目一致。如果噬菌粒在體外包裝后則還可以明顯增加轉(zhuǎn)染大腸桿菌的數(shù)量。因此，電穿孔是一種理想而有效的增加大腸桿菌抗體庫數(shù)量的手段。

3 噬菌體抗體庫的篩選

噬菌體抗體庫的篩選包括淘篩和鑒定。淘篩(panning)是指噬菌體抗體庫與選擇的抗原共同孵育，通過幾輪洗脫中斷噬菌體-抗原反應(yīng)(不影響噬菌體的感染能力)，棄去未結(jié)合的噬菌體，收集結(jié)合的噬菌體。具體的步驟：①噬菌體吸附靶抗原；②反復(fù)洗滌去除非特異性結(jié)合；③洗脫并收集與抗原結(jié)合的噬菌體；④再次感染大腸桿菌，使特異的噬菌體抗體淘篩。經(jīng)過一輪這樣的“吸附—洗脫—擴增”的淘篩，可使特異性抗體的噬菌體富集20～1000倍。若每一輪淘篩按50倍的富集率計算，經(jīng)過4輪淘篩，可使噬菌體抗體的富集率達108以上，篩選出占庫容量僅為1/108的噬菌體抗體，噬菌體抗體庫技術(shù)借助這種高效篩選系統(tǒng)，能夠方便地對庫容量在108以上的抗體進行篩選。這種極強的篩選能力是早期的抗體庫技術(shù)所望塵莫及的[15～17]。

目前，已經(jīng)根據(jù)篩選的不同要求發(fā)展出了多種篩選方法，包括：固相淘篩(將抗原固定于免疫管或制成親和柱進行免疫淘選)、捕獲淘篩(將靶抗原特異的單抗或多抗固定于固相表面，隨后加入靶抗原進行淘選)、完整細胞淘篩(用完整細胞對抗體庫進行淘選)、組織淘篩和器官淘篩等。這些方法均有成功的報道，為噬菌體抗體的淘篩增添了新的途徑。

要獲得高親和力的噬菌體抗體，抗體庫的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在篩選過程中，噬菌體種類、固相介質(zhì)表面的抗原密度或溶液中抗原的濃度和清洗時間三種因素對篩選的效率影響較大。當篩選較小的抗體庫(107～108克隆)時，在前幾輪采用中等的嚴緊度有利于避免高親和力低表達克隆的丟失，而較大的抗體庫則可采用較高嚴緊度以較快地富集親和性克隆。

4 噬菌體抗體庫技術(shù)的應(yīng)用

近年來，噬菌體抗體庫已成為基因工程抗體研究的熱點之一，并被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。利用噬菌體抗體庫技術(shù)已經(jīng)獲得了大量針對病原微生物的抗體，如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、風(fēng)疹病毒、流感嗜血桿菌、破傷風(fēng)毒素以及嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)病毒等[18～21]。這些噬菌體抗體中，許多具有臨床診斷和治療的應(yīng)用前景。以抗體庫技術(shù)為工具，了解機體受病原微生物感染時所激發(fā)的體液免疫反應(yīng)格局，為疫苗設(shè)計和發(fā)病機制的研究提供依據(jù)。

來源于病人的噬菌體抗體，在基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)上真實地反映機體的免疫狀態(tài)。利用這類單抗可以分析自身抗原的表位結(jié)構(gòu)；以人自身抗體為探針分析自身免疫疾病患者血清中自身抗體的“表位指紋”，有助于了解B細胞表位和疾病表現(xiàn)之間的關(guān)系。通過分析自身抗體可變區(qū)的編碼基因，能夠了解此類抗體的基因取用規(guī)律。利用腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原篩選噬菌體抗體庫，能夠得到特異性人單抗。將其接在腫瘤壞死因子和其他淋巴因子上，用于腫瘤的免疫治療，增強抗腫瘤活性；而將其接上同位素則可用于腫瘤顯像分析[22]。

噬菌體抗體庫技術(shù)與單抗技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于能夠制備人單抗，從而避免了鼠單抗應(yīng)用于人體時而引發(fā)的免疫反應(yīng)。而且，通過體外親和力成熟技術(shù)和動力學(xué)常數(shù)篩選技術(shù)，能夠?qū)τ嘘P(guān)抗體進行改造，從中得到特異性和動力學(xué)特性均較好的抗體。

5 結(jié)語

噬菌體抗體庫技術(shù)是抗體工程發(fā)展進程的一個里程碑。經(jīng)過不斷努力，目前噬菌體抗體庫技術(shù)已經(jīng)比較成熟，并已經(jīng)在世界范圍內(nèi)推廣和應(yīng)用，在分子生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生了廣泛的影響。

但是此技術(shù)目前還有許多問題尚待解決。例如，如何實現(xiàn)抗體的全分子表達，如何獲得庫容量大、特異性高、敏感性強的抗體庫以及如何提高抗體的產(chǎn)量等?？梢韵嘈?，隨著各種優(yōu)化方法的建立，噬菌體抗體庫技術(shù)將為治愈某些嚴重危害人類健康的疾病帶來希望。