周欣亮張璁王玉棟趙連梅桑梅香單保恩③

·基礎(chǔ)研究·

胃癌中DNA甲基化對miR-200c 141表達影響的研究

周欣亮①張璁②王玉棟①趙連梅②桑梅香②單保恩②③

目的：探討胃癌組織中miR-200c/141CpG島的甲基化水平與miR-200c/141表達水平和臨床病理特征的相關(guān)性。方法：運用實時定量PCR（qRT-PCR）和BS-MSP方法檢測胃癌組織和癌旁組織中miR-200c/141CpG島的表達與其基因甲基化水平。統(tǒng)計學(xué)分析miR-200c/141CpG島的甲基化水平與miR-200c/141水平和臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：miR-200c/141CpG島的甲基化水平在胃癌組織中顯著升高，miR-200c和miR-141的水平顯著降低，miR-200c/141CpG島的甲基化水平與miR-200c和miR-141的水平呈負相關(guān)。結(jié)論：胃癌組織中升高的miR-200c/141CpG島的甲基化水平誘導(dǎo)miR-200c和miR-141表達降低。

胃癌 甲基化 miR-200c miR-141 臨床病理特征

miRNAs是一類進化上高度保守的小分子非編碼RNA，長度為21～25 nt［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中表達下調(diào)的miR-200c和miR-141能夠增加乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［3］。近年來，對miRNAs識別和表達的高通量數(shù)據(jù)分析與生物信息學(xué)方法迅猛發(fā)展，其靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫更新迅速。但是，對miRNAs自身表達的調(diào)控機制研究尚不明確。近期的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化調(diào)節(jié)miR-200c/141簇在一些腫瘤和正常細胞中的表達發(fā)揮重要的作用［4］。但miR-200c和miR-141在胃癌中表達的調(diào)控機制尚不清晰。本實驗通過實時定量PCR（qRT-PCR）方法和BS-MSP方法檢測胃癌組織和癌旁組織中miR-200c/ 141上游CpG島甲基化水平和miR-200c/141的表達情況，并分析甲基化水平與miR-200c和miR-141表達水平的關(guān)系，以期闡明miR-200c/141在胃癌中表達的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2012年5月至2013年1月胃癌根治性手術(shù)切除標本64例?；颊咝g(shù)前未行任何放療及新輔助治療。每例標本采集腫瘤組織（非壞死部分）和癌旁組織（距腫瘤組織＞5 cm），取出后立即放入凍存管于液氮保存。所有標本均經(jīng)病理學(xué)診斷為胃癌。收集患者、性別、年齡、手術(shù)記錄、病理號碼、病理報告等臨床資料。共64例（1例數(shù)據(jù)丟失）患者中男性54例、女性9例，年齡40～78歲，平均（56.6±8.93）歲。按臨床病理資料進行分析，包括浸潤深度（T1、T2、T3和T4）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0、N1、N2、N3a、N3b）、遠處轉(zhuǎn)移（M0、M1）、腫瘤TNM分期（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅳ）、病理組織學(xué)分級（高-中分化和低分化）和脈管瘤栓（陰性/陽性），其中TNM分期依照第7版《AJCC癌癥分期手冊》進行。

1.1.2 主要試劑Trizol試劑、PureLink?Genomic DNA Mini Kit、實驗相關(guān)引物均購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、GoTaq?qPCR Master Mix、GoTaq?Hot Start Green Master Mix均購自美國Fementas公司；EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit、EpiTect PCR Control DNA Set均購自美國Qiagen公司；地西他濱（5-aza-2′-deoxycytidine）購自美國Sigma-Aldrich公司；所有無RNaes相關(guān)耗材均購自美國AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 CpG島的預(yù)測在線應(yīng)用MethPrimer Program和CpG Island Searcher預(yù)測miR-200c/141上游CpG島，在其上游有1個CpG島存在，位于7072547到7072693，長度為146 bp（圖1）。

1.2.2 組織中DNA的提取及DNA甲基化修飾（亞硫酸鹽處理）根據(jù)美國Invitrogen公司PureLink?Genomic DNA Mini Kit操作手冊提取組織中DNA。根據(jù)美國Qiagen公司EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit操作手冊提取DNA進行甲基化修飾。

1.2.3 PCR擴增根據(jù)GoTaq?Hot Start Green Master Mix操作手冊，以亞硫酸氫鹽處理后的DNA為模板，進行PCR反應(yīng)。miR-200c/141-M（miR-200c/141甲基化引物）上游引物為：5′-GTAAATCGGTGTGTGTCGCGGG TCG-3′；下游引物為：5′-CAAACCCTCCGAAACCCCT CGACCG-3′。miR-200c/141-UM（miR-200c/141非甲基化引物）上游引物為：5′-GTAAATTGGTGTGTGTTGTG GGTTG-3′；下游引物為：5′-CAAACCCTCCAAAACCCC TCAACCA-3′。miR-200c/141-M的熱循環(huán)條件：95℃5 min預(yù)變性，95℃20 s，65℃30 s，72℃20 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸6min。miR-200c/141-UM的熱循環(huán)條件：95℃5min預(yù)變性，95℃20 s，61℃30 s，72℃20 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸6 min。各標本均設(shè)有空白對照。將PCR擴增產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，采用Gel-Proanalysis3.1軟件進行掃描觀察結(jié)果。測定目的基因光密度值（optical density，OD）。甲基化率=甲基化產(chǎn)物OD/（甲基化產(chǎn)物OD+非甲基化產(chǎn)物OD）×100%。

1.2.4 實時熒光定量PCRTRIZOL法提取組織或細胞總RNA，檢測其RNA濃度、純度和完整性，應(yīng)用Fementas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照GoTaq?qPCR Master Mix說明書推薦配制反應(yīng)溶液，將PCR反應(yīng)溶液置于ABI 7500儀器Real-time PCR儀上進行PCR反應(yīng)。相關(guān)引物序列見表1。循環(huán)設(shè)置為兩步法。數(shù)據(jù)采用RQ=2-△△Ct表示相對定量結(jié)果，以U6作為內(nèi)參，每個組織樣本重復(fù)3次。所用特異引物如下：hsa-miR-200c-RT：GTCGTATCCAGTGCGT GTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGATCCATC；hsa-miR-200c-Forward：GGCCTAATACTGCCGGGTAA T；hsa-miR-141-RT：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCATCT；hsa-miR-141-Forward：CCCGGGTAACACTGTCTGGTAA；hsa-U6-RT：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；U6-Forward：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；Universal Primer：CAGTGCGTGTCGTGGAGT。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，癌組織與癌旁組織中miR-200c/141CpG島的甲基化水平及miRNAs的水平用中位數(shù)和四分位數(shù)表示，分析其表達差異采用Wilcoxon符號秩檢驗；分析miR-200c/ 141CpG島的甲基化水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性時，兩組比較用Wilcoxon秩和檢驗，三組及以上組間差異采用Kruskal-Wallis檢驗。分析miR-200c/ 141CpG島的甲基化水平與miR-200c/141的表達水平的相關(guān)性時，采用Spearman檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 miR-200c/141CpG島在DNA中所處的位置Figure 1Locations of the hypermethylated fragment of miR-200c/141.One CpG island located at 500 bp upstream of the miR-200c/141 genomic sequence

2 結(jié)果

2.1 miR-200c和miR-141在胃癌組織中的表達水平

64例胃癌標本中（1例數(shù)據(jù)丟失），分別有50例（78.13%）和48例（76.19%）標本存在miR-200c和miR-141的表達下調(diào)。與癌旁組織相比，miR-200c和miR-141在胃癌組織中的表達顯著降低（P＜0.001，P＜0.001，圖2）。

2.2 胃癌標本中miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平

64例胃癌標本中（1例數(shù)據(jù)丟失），miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平升高率為84.13%（53/63），相較于癌旁組織，miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平在胃癌組織中顯著升高（P＜0.001，圖3）。

圖2 miR-200c和miR-141在胃癌中的表達情況Figure 2Differential expression of miR-200c and miR-141 in gastric cancer specimens

圖3 胃癌標本中miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平Figure 3Methylation status of miR-200c/141 CpG island was analyzed by bisulfite conversion-and methylation-specific PCR in gastric cancer tissue and adjacent tissue

2.3 miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。

64例胃癌患者中（1例數(shù)據(jù)丟失），miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平與患者性別、年齡、組織學(xué)分級、TNM分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓均無顯著性相關(guān)（表1）。

2.4 miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平與miR-200c和miR-141表達的相關(guān)性。

miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平與miR-200c和miR-141的水平呈負相關(guān)（表2）。

表1 胃癌中miR-200c/141CPG島甲基化水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1Correlations of the methylation status of miR-200c/141 CpG island in gastric cancer specimens with the clinicopathological feature

表2 miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平與miR-200c和miR-141表達的相關(guān)性Table 2Correlations of the expression levels of miR-200c and miR-141 in gastric cancer specimens with the expression level of TGF-β and CpG island cytosine methylation level of miR-200c/141

3 討論

miR-200c和miR-141為miR-200家族的兩個成員，成簇表達，轉(zhuǎn)錄為一個多順反子的原始miRNA轉(zhuǎn)錄物miR-200c/141，位于人第12（12p13.31）常染色體上［5］。miR-200c和miR-141在多種惡性腫瘤中存在表達異常［6-10］，近期研究表明，miR-200c和miR-141能夠通過抑制ZEB1和ZEB2的表達促進乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，促進腫瘤的發(fā)展，發(fā)揮抑癌基因的作用［3］。miR-200c和miR-141可作為生物靶點進行抗腫瘤治療。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c和miR-141在胃癌組織中的表達顯著降低。提示miR-200c和miR-141可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。miR-200c和miR-141在腫瘤中發(fā)揮的功能及其機制研究較多，但miR-200c和miR-141在胃癌中的表達調(diào)控機制尚不明確。

人類miRNAs基因多數(shù)位于易于發(fā)生點突變、染色體易位和染色體缺失的區(qū)域［11-12］，miRNAs的表達可受到表觀遺傳學(xué)因素的影響，如DNA甲基化［13］。Wu等［14］研究發(fā)現(xiàn)miR-429啟動子區(qū)CpG島的高甲基化抑制其在腎透明細胞癌中的表達；Yang等［15］發(fā)現(xiàn)miR-129-2基因上游的高甲基化率抑制其在膠質(zhì)瘤細胞中的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中miR-200c/141轉(zhuǎn)錄起始位置附近存在一個CpG島，miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平相較于癌旁組織顯著升高，且miR-200c/ 141上游CpG島的甲基化水平與miR-200c和miR-141的水平呈負相關(guān)。

BS-MSP是一種快速、實用的基因甲基化檢測方法，靈敏度高、特異性強，能同時檢測多個CpG位點的甲基化情況，對于深入研究腫瘤相關(guān)基因表達調(diào)控機制具有重要意義，可以較好地揭示啟動子區(qū)CpG島所包含的表觀遺傳學(xué)信息，以明確DNA甲基化模式在基因差異表達機制中的作用。既往研究中，BSMSP法僅能對腫瘤組織中CpG島甲基化情況進行定性分析［16］。本研究中首次應(yīng)用BS-MSP法對胃癌組織中miR-200c/141上游CpG島的甲基化水平進行半定量分析，數(shù)據(jù)更精準、可靠，與在MSP的基礎(chǔ)上研發(fā)的MethyLight技術(shù)相類似。

綜上所述，胃癌組織中升高的miR-200c/141 CpG島的甲基化水平能夠使miR-200c和miR-141的表達降低。本研究運用BS-MSP法對CpG島的甲基化進行半定量分析，其結(jié)果及實驗方法的運用將有利于從分子水平揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的病因，以期為胃癌的治療提供可靠的生物靶點。

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（2016-09-23收稿）

（2017-01-12修回）

MiR-200c/141 methylation inhibits the expression of miR-200c and miR-141 in gastric cancer

Xinliang ZHOU1,Cong ZHANG2,Yudong WANG1,Lianmei ZHAO2,Meixiang SANG2,Baoen SHAN2,3

1Oncology Department,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;2Research Center,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;3Tumor Research Institute of Hebei,Shijiazhuang 050011,China

Baoen SHAN;E-mail:jsyyxyk2014@163.com

Objective:This work aims to detect the levels of miR-200c/141 methylation and miR-200c/141 in gastric cancer tissue and investigate the relationship between miR-200c/141 expression and clinical parameters.Methods:The methylation status of miR-200c/ 141 CpG island and miR-200c/141 in gastric cancer tissue specimens was evaluated by qRT-PCR or BS-MSP method.We analyzed the relationship among the methylation status of miR-200c/141 CpG island,expression level of miR-200c or miR-141,and clinical parameters.Results:The status of miR-200c/141 CpG island methylation in gastric cancer tissue was significantly higher compared with that in paracarcinoma tissue.MiR-200c and miR-141 were markedly decreased in gastric cancer tissue compared with those in adjacent tissue.MiR-200c/141 CpG island methylation was negatively related with the expression of miR-200c and miR-141 in gastric cancer specimens.Conclusion:The upregulation of miR-200c/141 CpG methylation inhibits miR-200c/141 expression in gastric cancer tissue.

gastric cancer,methylation,miR-200c,miR-141,clinicopathological feature

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.02.119

①河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（石家莊市050011）；②科研中心；③河北省腫瘤研究所

單保恩baoenshan1962@126.com

周欣亮專業(yè)方向為腫瘤的精準治療及非編碼RNA在腫瘤中的作用機制等基礎(chǔ)研究。

E-mail：zhouxlhappy@hotmail.com