蘇曉恩，孔志強，朱 娟，鄧海棠，張震乾，馮文杰

(廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院骨科 526000)

論著·臨床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.016

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨中YKL-40、IL-1β的表達及相關(guān)性探討

蘇曉恩，孔志強，朱 娟，鄧海棠，張震乾，馮文杰

(廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院骨科 526000)

[摘要] 目的 研究膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(KOA)病患軟骨中甲殼質(zhì)酶(YKL-40)、白細胞介素-1β(IL-1β)的表達水平，并分析兩者相關(guān)性。方法 選擇該院骨科住院就診的符合KOA診斷的病患38例，記為觀察組。再選擇同期因膝關(guān)節(jié)外傷行膝關(guān)節(jié)鏡檢治療或膝關(guān)節(jié)骨折內(nèi)固定手術(shù)患者關(guān)節(jié)軟骨30例，記為對照組。根據(jù)KOA放射線及關(guān)節(jié)鏡下分級標準，將觀察組分為輕度組16例、中度組11例及重度組10例。對比所有病患的YKL-40、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達水平，同時進行Mankin評分、細胞死亡率的對比。結(jié)果 觀察組YKL-40、IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平及Mankin評分、細胞死亡率均顯著高于對照組，并且觀察組中輕度、中度、重度的YKL-40等指標水平呈上升水平(均P<0.05)。并且YKL-40表達水平與IL-1β水平存在顯著的正相關(guān)(r=0.738，P=0.000)。此外，YKL-40表達水平還與IL-6(r=0.819，P=0.000)、TNF-α(r=0.871，P=0.000)表達水平及Mankin評分(r=0.832，P=0.000)、細胞死亡率存(r=0.832，P=0.000)在顯著的正相關(guān)。結(jié)論 KOA病患中YKL-40、IL-1β呈高表達狀態(tài)，并且兩者呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。

骨關(guān)節(jié)炎,膝；甲殼質(zhì)酶蛋白；白細胞介素-1β

[Abstract] Objective To study the expressions of YKL-40 and IL-1β in the cartilage of knee osteoarthritis(KOA),and analysis the possible relationship between YKL-40,IL-1β in KOA.Methods Thirty-eight patients diagnosed with KOA were selected in this hospital as observation group.Then select 30 articular cartilage cases in the same period due to knee injury knee joint examination or treatment of knee joint fracture surgery patients,referred to as the control group.According to KOA radiation and arthroscopic grading standards,the observation group was divided into 16 cases of mild group,10 cases of moderate group,11 cases of severe groups.Compare the expression levels of all patients including YKL-40,interleukin-1β (IL-1β),IL-6,tumor necrosis factor-α (TNF-α),while recording Mankin score and cell mortality.Results Expression of YKL-40,IL-1β,IL-6,TNF-α,Mankin scores and rate of cell death about observation group were significantly higher than control group,the indicators above in mild,moderate,severe group showed a trend of rising(allP<0.05).And the expression levels of YKL-40 and IL-1β were significantly positive correlation(r=0.738,P=0.000).In addition,The expression levels of YKL-40 had relation with IL-6 (r=0.819,P=0.000),TNF-α (r=0.871,P=0.000) and Mankin score (r=0.832,P=0.000),cells mortality deposit (r=0.832,P=0.000).Conclusion Expression levels of YKL-40 and IL-1β were significantly increased in cartilage of knee osteoarthritis patients,and there showed a significant positive correlation between YKL-40 and IL-1β.

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(cartilage of rnee osteoarthritis,KOA)在臨床上是一種慢性炎癥疾病，在老年人群中發(fā)病率相對較高[1]。KOA發(fā)生機制復雜，并且在軟骨細胞合成、分解代謝水平處于較低狀態(tài)，使得軟骨細胞的再生能力明顯下降。因此需要對重要的相關(guān)因子進行深入研究為臨床上進一步治療提供依據(jù)。其中甲殼質(zhì)酶(YKL-40)又被稱為人軟骨糖蛋白39，能對軟骨損傷程度作出較好的反應[2]。IL-1β是炎性反應的重要因子，其分泌量的增加會破壞組織及集體的功能[3-4]。鑒于此，本文對KOA患者YKL-40、IL-1β水平的檢測及相關(guān)性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2015年6月在本科室住院就診的符合KOA診斷的病患38例，記為觀察組。所有病患均確診為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎同時排除類風濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、感染性關(guān)節(jié)炎等其他疾病。包括男21例，女17例。年齡在43～75歲，平均(59.3±5.12)歲。再選擇同期因膝關(guān)節(jié)外傷行膝關(guān)節(jié)鏡檢治療或膝關(guān)節(jié)骨折內(nèi)固定手術(shù)患者關(guān)節(jié)軟骨同時排除骨關(guān)節(jié)炎病變的病患30例，記為對照組。其中男18例，女12例。年齡40～78歲，平均(59.7±5.17)歲。兩組人員在年齡、性別等基本資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。根據(jù)KOA放射線及關(guān)節(jié)鏡下分級標準[1]，關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷分級(Outerbridge)，Ⅰ度：表面輕度的水泡(軟化和腫脹)；Ⅱ度：直徑小于1 cm的毛糙和淺表潰瘍、纖維化；Ⅲ度：損傷直徑大于1 cm深潰瘍，無軟骨下骨暴露；Ⅳ度：全厚撕裂合并軟骨下骨暴露。X線片下軟骨損傷分級按照Kellgren-Lawrence (K-L)分級標準進行分級,0級：正常；Ⅰ級：關(guān)節(jié)間隙無變窄，可疑骨贅或微小骨贅；Ⅱ級：關(guān)節(jié)間隙可疑變窄，有明顯的輕度骨贅；Ⅲ級：關(guān)節(jié)間隙明顯狹窄，骨質(zhì)有硬化性改變，中度多發(fā)骨贅形成；Ⅳ級：關(guān)節(jié)間隙明顯狹窄，嚴重硬化性改變及明顯關(guān)節(jié)畸形，有大量骨贅形成。將入組患者分為3組。輕度組：K-L分級0～1級合并軟骨Ⅰ度損傷；中度組：K-L分級Ⅱ級和/或軟骨Ⅱ～Ⅲ度損傷；重度組：K-L分級Ⅲ～Ⅳ級和/或軟骨Ⅳ度損傷將觀察組分為輕度組16例、中度組11例及重度組10例。

1.2 方法

1.2.1 標本獲取與保存 所獲軟骨標本均在手術(shù)后1 h內(nèi)進行處理:首先肉眼觀察大體標本并進行記錄，然后切取全層軟骨標本，修切成1.0 cm×0.8 cm×0.5 cm大小，用4%中性多聚甲醛固定72 h后置于-70 ℃深低溫冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標本處理 試驗前取出標本，緩慢復溫至室溫，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，載玻片用10%的多聚賴氨酸處理，5 μm切片以備染色。其中YKL-40、IL-1β均采用免疫組織化學法檢測。

1.2.3 病變情況評估 采用Mankin評分標準對病變情況進行評估，并在記錄后統(tǒng)計對比。

1.2.4 細胞凋亡率 采用TUNEL法染色檢測軟骨細胞凋亡率，在顯微鏡下觀察結(jié)果。隨機選取10個細胞統(tǒng)計陽性細胞數(shù)，其中細胞凋亡率=凋亡細胞/(凋亡細胞數(shù)+未凋亡細胞數(shù))×100%。使用Olympus BX-51電光源(熒光)顯微鏡，選取不同視野觀察并照相，顯微圖像分析系統(tǒng)(SamplePCI)測定軟骨內(nèi)反應產(chǎn)物吸光度值，采集到關(guān)節(jié)軟骨圖像隨機選取6個區(qū)域測定吸光度值，計算均值。

2 結(jié) 果

2.1 不同病患中YKL-40、IL-1β表達水平對比 觀察組YKL-40、IL-1β表達水平均顯著高于對照組，并且觀察組中輕度、中度、重度的YKL-40、IL-1β表達水平呈上升趨勢(均P<0.05)，見表1。

表1 不同病患中YKL-40、IL-1β表達水平對比

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與觀察組輕度比較；c:P<0.05,與觀察組中度比較。

2.2 不同病患中IL-6、TNF-α表達水平對比 觀察組IL-6、TNF-α表達水平均顯著高于對照組，并且觀察組中輕度、中度、重度的IL-6、TNF-α表達水平呈上升趨勢(均P<0.05)，見表2。

表2 不同病患中IL-6、TNF-α表達水平對比

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與觀察組輕度比較；c:P<0.05,與觀察組中度比較。

2.3 不同病患中Mankin評分、細胞死亡率對比 觀察組Mankin評分、細胞死亡率均顯著高于對照組，并且觀察組中輕度、中度、重度的Mankin評分、細胞死亡率呈上升趨勢(均P<0.05)，見表3。

表3 不同病患中Mankin評分、細胞死亡率對比±s)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與觀察組輕度比較；c:P<0.05,與觀察組中度比較。

2.4 YKL-40與其他指標的相關(guān)性分析 YKL-40表達水平與IL-1β水平存在顯著的正相關(guān)。此外，YKL-40表達水平還與IL-6、TNF-α表達水平及Mankin評分、細胞死亡率存在顯著的正相關(guān)。見表4。

表4 YKL-40與其他指標的相關(guān)性分析

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)觀察組YKL-40、IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平及Mankin評分、細胞死亡率均顯著高于對照組，并且觀察組中輕度、中度、重度的YKL-40等指標水平呈上升趨勢。說明KOA病患YKL-40、IL-1β等細胞因子水平及細胞死亡率明顯上升，并且隨著KOA病變程度加深而增加。首先，YKL-40是其mRNA或者蛋白質(zhì)在炎性反應、細胞退化過程中高度表達，所以其分泌量的大小與細胞活性存在很大聯(lián)系。YKL-40在真核細胞的細胞質(zhì)中都有產(chǎn)生，是一種對軟骨具有保護作用的因子。并且YKL-40能促進細胞生長，同時抑制細胞凋亡[5]。而在KOA病患病情加重的時候YKL-40水平會顯著上升，筆者認為這可能與軟骨組織在受到生物力學或者生物化學的刺激迅速反應后產(chǎn)生更多的YKL-40。IL-1β是IL-1家族成員之一，IL-1則在淋巴細胞、軟骨相關(guān)的靶細胞上都有存在[6-7]。IL-1β在KOA發(fā)生過程中是通過不同路徑加快了軟骨的分解代謝，同時對軟骨的合成代謝具有顯著抑制作用。并且IL-1β還與IL-6、TNF-α等炎癥因子有誘導作用，促進炎性介質(zhì)的大量釋放。而IL-1β、IL-6、TNF-α都會對組織造成不同的傷害，進而加重病情。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)：YKL-40表達水平與IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平及Mankin評分、細胞死亡率均存在顯著的正相關(guān)。說明YKL-40水平與IL-1β、IL-6、TNF-α等因子同時上升，并且隨著YKL-40水平的上升Mankin評分、細胞死亡率也上升。IL-1β在引起多種炎癥因子的釋放后對組織造成不同程度的破壞，進而使得細胞凋亡比例逐漸上升。這就在很大程度上加速了軟骨的分解，加重了病情。而YKL-40是作為一個保護因子存在的，其作用與生長因子類似。主要是通過各種信號的傳導來促進軟骨細胞的增殖，同時降低炎性反應。并且促進生長、分化、重建，抑制細胞凋亡。所以YKL-40與IL-1β、IL-6、TNF-α表現(xiàn)相反的作用，相互抑制的情況同步變化。

本組試驗是以放射線及關(guān)節(jié)鏡下診斷對患者進行KOA分級分組，未能從不同年齡段中對試驗結(jié)果進行分組分析。然而KOA發(fā)病率隨著著年齡增長而增高。機械力學因素和遺傳因素在KOA發(fā)病中起重要作用，另一個基本的危險因素是年齡，雖然隨著年齡增長軟骨的成分和結(jié)構(gòu)改變不可避免，但KOA并不是普遍發(fā)生的。關(guān)節(jié)軟骨老化性的改變包括關(guān)節(jié)面的軟化、抗張強度的降低及基質(zhì)的僵硬，這些改變歸因于細胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu)的改變[8-10]。在不受到干擾情況下，正常軟骨細胞保持靜止狀態(tài)，并且隨著年齡增長其增殖的潛能下降。KOA軟骨細胞凋亡增加還是克隆增加問題上還存在爭議，有研究表明老化過程中氧化劑可以改變軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體的軟骨基質(zhì)蛋白積聚導致軟骨基質(zhì)合成減少，最后軟骨細胞凋亡[11]。

綜上所述，KOA變化中YKL-40、IL-1β顯著上升，并且隨著病情的加重而逐漸增加。同時，YKL-40與IL-1β表達水平出現(xiàn)明顯的正相關(guān)。體內(nèi)外的研究表明軟骨細胞可以產(chǎn)生一些細胞因子和化學因子，也可對關(guān)節(jié)組織和關(guān)節(jié)液一些細胞因子和化學因子產(chǎn)生反應。然而這些因子的產(chǎn)生機制和因果關(guān)系還不是很明確，和異常的機械力學和氧化應激可能有關(guān)[12]，YKL-40目前更多是作為反映KOA炎癥程度的標記物。此類細胞因子在KOA發(fā)病中起到重要作用，已成為KOA值得期待的一個治療靶目標。

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The expressions and related discussion of YKL-40 and IL-1β in the cartilage of knee osteoarthritis

SuXiaoen,SunZhiqiang,ZhuJuan,DengHaitang,ZhangZhenqian,FengWenjie

(DepartmentofOrthopaedics,theFirstPeople′sHospitalofZhaoqingcity,Zhaoqing,Guangdong526000)

osteoarthritis,knee;YKL-40;interleukin-1β

蘇曉恩(1981-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事臨床骨科工作及研究。

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1671-8348(2017)04-0480-03

2016-09-25

2016-10-23)