李曉林周威莊以彬路福平殷華（. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

3，4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的生物合成

李曉林1，2周威2莊以彬2路福平1殷華2
（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

3，4-二羥基扁桃酸是許多藥物和香料合成的重要中間體，具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的活性。旨在實(shí)現(xiàn)3，4-二羥基扁桃酸在大腸桿菌中的從頭合成。通過在大腸桿菌MG1655/ΔA中過表達(dá)來源于天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）的對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）和大腸桿菌的羥化酶（HpaBC）基因，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料生物合成3，4-二羥基扁桃酸；并經(jīng)IPTG和蛋白誘導(dǎo)溫度初步優(yōu)化后，搖瓶發(fā)酵36 h 3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L。

大腸桿菌；3，4-二羥基扁桃酸；生物合成；對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）；羥化酶（HpaBC）

3，4-二羥基扁桃酸，英文名3，4-Dihydroxymandelic acid（DHMA），是多種醫(yī)藥（如磺胺增效劑3，4，5-三甲氧基嘧啶，TMP）、香料（如香草基杏仁酸、香蘭素）合成的重要中間體［1-3］，其本身也是一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑，如DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其自由基清除活性是維生素C、維生素E、抗氧劑264（butylated hydroxytoluene）的4倍［4］。目前，3，4-二羥基扁桃酸主要通過化學(xué)方法來合成，如以鄰苯二酚與乙醛酸為原料，在堿性條件下縮合而實(shí)現(xiàn)合成［2，5］。然而，這種化學(xué)合成的方法收率低，產(chǎn)生大量的堿性廢液，造成環(huán)境污染。利用微生物合成的方法將有效避免化學(xué)合成中復(fù)雜條件的控制以及環(huán)境污染等問題，因而受到越來越多研究人員的關(guān)注。大腸桿菌由于其遺傳背景清晰，遺傳操作技術(shù)簡單，易于大規(guī)模化液體發(fā)酵生產(chǎn)，作為天然化合物的異源合成宿主越來越受到重視。近年來，許多來源于酪氨酸合成途徑的芳香族衍生物，如咖啡酸、沒食子酸、黑色素、丹參素、羥基酪醇等已實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的生物合成［6-8］，3，4-二羥基扁桃酸在微生物中異源生物合成方法尚未見報(bào)道。對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）基因存在于萬古霉素類抗生素生物合成基因簇中，是一種Fe2+依賴型的雙加氧酶，能將對(duì)羥基苯丙酮酸芐基脫羧和羥基化生成對(duì)羥基扁桃酸［9-12］。來源于大腸桿菌的羥化酶（HpaBC）被報(bào)道是一個(gè)雙組份的單氧化酶，具有較大的底物寬泛性，能催化單羥基酚和二羥基酚類化合物苯環(huán)發(fā)生羥化反應(yīng)，如催化對(duì)羥基苯乙酸、苯酚、酪氨酸（tyrosine）及香豆酸（coumanic acid）等底物［13，14］。本研究以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的酪氨酸高產(chǎn)的大腸桿菌為出發(fā)菌株，引入來源于天藍(lán)色鏈霉菌M145（Streptomyces coelicolor）的對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）和大腸桿菌的羥化酶（HpaBC），催化酪氨酸合成中間體對(duì)羥基苯丙酮酸（4HPP）合成3，4-二羥基扁桃酸，所構(gòu)建的合成途徑如圖1所示。

圖1 3，4-二羥基扁桃酸合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）、MG1655，天藍(lán)色鏈霉菌M145（S. coelicolor）和質(zhì)粒pTrcHisB均為本實(shí)驗(yàn)室保存。其中pTrcHisB質(zhì)粒中trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子拼合的強(qiáng)啟動(dòng)子，受lacI阻遏蛋白調(diào)控，需要IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 Phusion超保真DNA聚合酶購自New England Biolabs 公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ購自Fermentas公司；T4連接酶購自TaKaRa Biotechnology公司；3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)品購自天津希恩思生化科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自北京索萊寶生物科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉 10 g/L；M9培養(yǎng)基：磷酸氫二鈉12.8 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，氯化鈉 0.5 g/L，氯化銨1 g/L，葡萄糖2 g/L，硫酸鎂0.24 g/L，氯化鈣11.1 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 基因擴(kuò)增 hpaBC（GenBank：AM946981.2）擴(kuò)增：以E. coli BL21基因組DNA為模板，hpaBCF-BamHI和hpaBC-R-EcoRI為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hpaBC-F-BamHI：5'-CGCGGATCCCATGAAACCAGA AGATTTC-3'（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)），hpaBCR-EcoRI：5'-CCGGAATTCTTAAATCGCAGCTTCCAT TTC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)）；PCR參數(shù)：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠電泳回收目的片段。

hmaS（GenBank：AJ223998.1）擴(kuò)增：甘油保存的天藍(lán)色鏈霉菌孢子稀釋10-3，取100 μL稀釋液涂于MS固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h。收集菌絲于40 μL DMSO中，并放置-80℃冰箱進(jìn)行簡單凍融，作為PCR模板；PCR引物為hmaS-F-EcoRI：5'-CC GGAATTCaagaggtataggatcccATGCCGCCCAGTGACA TC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)，小寫字母為核糖體識(shí)別位點(diǎn)RBS區(qū)），hmaS-R-HindIII：5'-CCCA AGCTTTCATCGGCCGGCCACTTC-3'（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)）；PCR參數(shù)：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠電泳回收目的片段。

1.2.2 質(zhì)粒及重組菌構(gòu)建 以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)pTrcHisB質(zhì)粒和hpaBC分別進(jìn)行酶切；通過凝膠電泳回收載體及基因片段；以載體與基因片段摩爾數(shù)比為1∶3進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC。然后用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶對(duì)pTrcHisB-hpaBC和帶RBS的hmaS PCR片段進(jìn)行酶切、連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS，其中hpaBC與 hmaS在PTrc啟動(dòng)子調(diào)控下共轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS至MG1655/ΔA，獲得重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS。MG1655/ΔA［15］是本實(shí)驗(yàn)室在大腸桿菌E. coli K-12 MG1655的基因組中敲除了tyrR、pykA、pykF及pheA四個(gè)基因的突變株［16，17］，以增強(qiáng)前體4HPP的合成。

1.2.3 重組菌發(fā)酵培養(yǎng) 挑取MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株單克隆于5 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)12 h；按體積比為1∶50 轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于30℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，蛋白誘導(dǎo)時(shí)間為12 h；4 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入50 mL M9發(fā)酵培養(yǎng)基（含葡萄糖2%）進(jìn)行重懸，然后于30℃繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取樣測(cè)定3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。

1.2.4 3，4-二羥基扁桃酸HPLC、LC-MS分析鑒定 取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心10 min，收集上清。HPLC檢測(cè)系統(tǒng)是島津液相色譜儀；檢測(cè)條件為：HPLC流動(dòng)相A = 水（含0.1%甲酸），B=甲醇；流速= 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-15 min 2% B，16-30 min 2% B到100% B；進(jìn)樣量30 μL；液相色譜柱為 Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測(cè)波長為254 nm。

LC-MS檢測(cè)：配有紫外檢測(cè)器的安捷倫1260系統(tǒng)和配有ESI離子源探針的bruker microQ-TOFⅡ質(zhì)譜儀，檢測(cè)條件包括：Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測(cè)波長為254 nm；流動(dòng)相A=水（含0.1%甲酸），B=甲醇；流速= 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-15 min 2 % B，16-30 min 2% B 到100% B；進(jìn)樣量20 μL；ESI負(fù)離子源，分子量掃描范圍50-800。

1.2.5 3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制濃度為10 mg/mL 3，4-二羥基扁桃酸母液，即稱取3，4-二羥基扁桃酸10 mg，加入蒸餾水至終體積為1 mL。分別取5、1、15和20 μL 3，4-二羥基扁桃酸母液，加入蒸餾水至終體積為1 mL，配制成濃度為50、 100、150和200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。取30 μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，制作3，4-二羥基扁桃酸濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化及液體發(fā)酵產(chǎn)量變化 蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：按上述培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中蛋白誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置16℃、30℃和37℃；IPTG濃度優(yōu)化：按以上培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中IPTG終濃度分別0.1、0.5和1 mmol/L；以優(yōu)化后的條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中一定時(shí)間取樣，用于測(cè)定菌體生長量、底物葡萄糖消耗及3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化。其中菌體生物量測(cè)定發(fā)酵液OD600，葡萄糖濃度用生物傳感分析儀（SBA-40E）測(cè)定，3，4-二羥基扁桃酸濃度測(cè)定通過HPLC的峰面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算。各設(shè)3個(gè)處理。

2 結(jié)果

2.1 載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS的構(gòu)建及驗(yàn)證

擴(kuò)增得到hmaS及hpaBC片段大小分別為1.1 kb和2.1 kb（圖2-A）。重組載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切驗(yàn)證，得到大小為1.1、2.1和4.4 kb三條帶（圖2-B），與理論大小一致，并送金唯智測(cè)序公司進(jìn)行了DNA測(cè)序驗(yàn)證。質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS如圖2-C所示。

圖2 載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS構(gòu)建

2.2 3，4-二羥基扁桃酸重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的構(gòu)建

MG1655/ΔA是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的MG1655敲除株，破壞了酪氨酸合成途徑的負(fù)調(diào)基因和競爭途徑基因如tyrR、pheA、pykA和pykF。將載體pTrcHisB-hpaBC-hmaS轉(zhuǎn)化至MG1655/ΔA，獲得3，4-二羥基扁桃酸重組菌株MG1655/ΔA/pTrc-BCS。

2.3 發(fā)酵液中3，4-二羥基扁桃酸HPLC檢測(cè)及LC-MS鑒定

對(duì)重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，取24 h的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，在7.6 min處有新化合物的產(chǎn)生，與3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時(shí)間（Rt）一致。3，4-二羥基扁桃酸分子量為184，LC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示7.6 min 峰的［M-H］-= 183，［2M-H］-= 367，確定該峰對(duì)應(yīng)的化合物為3，4-二羥基扁桃酸。

圖3 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS發(fā)酵液HPLC檢測(cè)及LC-MS結(jié)果

2.4 蛋白誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)產(chǎn)量的影響

為進(jìn)一步提高3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量，本研究對(duì)蛋白誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化篩選。根據(jù)3，4-二羥基扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算產(chǎn)量，y=0.000 100 696x+33.967 1（r2=0.999 01），其中x為峰面積，y為樣品濃度。結(jié)果（圖4）表明，蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃時(shí)，3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量最高，是30℃的1.3倍，是37℃的2倍；在蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃，發(fā)酵時(shí)間為24 h等相同條件下，在IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)，3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量最高為207 mg/L。

HmaS及HpaBC蛋白表達(dá)情況如圖5所示。16℃誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行總蛋白和菌體超聲破碎后，取上清蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE電泳。目的蛋白HpaBC（HpaB分子量為58.8 kD，HpaC分子量為18.5 kD）和HmaS（分子量為38.6 kD）在總蛋白和上清蛋白中的表達(dá)無明顯差異，HpaBC的兩個(gè)組分條帶較為明顯，hmaS基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)量很低，在電泳圖中顯示不明顯，推測(cè)可能其來源于鏈霉菌，GC含量較高，影響了蛋白表達(dá)量。

2.5 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的發(fā)酵試驗(yàn)

重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS搖瓶發(fā)酵，蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃，IPTG濃度為0.5 mmol/L，在發(fā)酵0、2.5、4.5、6、12、24、36、48和60 h進(jìn)行取樣，測(cè)定菌體生長密度（OD600）、底物葡萄糖的消耗量及產(chǎn)物3，4-二羥基扁桃酸生成量。結(jié)果（圖6）顯示，發(fā)酵4.5-36 h，菌體快速生長，葡萄糖的消耗逐漸增加，3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量快速增加，至36 h時(shí)3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L，葡萄糖總消耗量為14.7 g/L。在36 h菌體生長開始進(jìn)入穩(wěn)定期，葡萄糖消耗速率減慢，3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。

圖4 DHMA發(fā)酵條件初步優(yōu)化

圖5 蛋白SDS-PAGE電泳圖

圖6 重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS菌株生長、底物葡萄糖消耗以及DHMA產(chǎn)量曲線

3 討論

本研究在菌株MG1655/ΔA中成功實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基扁桃酸合酶（HmaS）和4-羥基苯丙酮酸3-羥化酶（HpaBC）基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中以葡萄糖為原料生物合成3，4-二羥基扁桃酸，并初步確定了合適的蛋白誘導(dǎo)的條件，即蛋白誘導(dǎo)溫度為16℃、IPTG的濃度為0.5 mmol/L，使3，4-二羥基扁桃酸的產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L，首次實(shí)現(xiàn)3，4-二羥基扁桃酸在微生物中的異源生物合成。

本研究中，把表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisB-hpaBC-hmaS轉(zhuǎn)化至MG1655，發(fā)酵結(jié)果顯示，3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量僅為10 mg/L左右（數(shù)據(jù)未顯示）。推測(cè)野生株MG1655的4HPP的合成量低可能是影響3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量的重要因素。為了增強(qiáng)前體的合成，實(shí)驗(yàn)選用了本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的菌株MG1655/ΔA，在MG655基因組上敲除了4個(gè)基因——tyrR、pykA、pykF及pheA。tyrR是芳香族氨基酸合成的負(fù)調(diào)控基因，敲除后會(huì)解除前體合成途徑的負(fù)調(diào)控。pheA敲除阻斷了競爭途徑苯丙氨酸的合成，促使分支酸積累，分支酸在酶促作用下合成4HPP。敲除pykA、pykF基因，可促使PEP生成更多的莽草酸合成前體DAHP（3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸），增強(qiáng)前體4HPP合成。通過提高前體的合成，重組菌MG1655/ΔA/pTrc-BCS的3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量提高到野生株中的20多倍。

本研究中所用hmaS基因DNA序列為直接從鏈霉菌中PCR獲得，并沒有進(jìn)行密碼子優(yōu)化，其在大腸桿菌中蛋白表達(dá)量較低，亦可能是影響3，4-二羥基扁桃酸的重要因素之一，進(jìn)一步的工作中可以對(duì)DNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提高3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。另外3，4-二羥基扁桃酸生物合成與酪氨酸的生物合成有共同的前體——對(duì)羥基苯丙酮酸（4HPP），4HPP可以在細(xì)胞內(nèi)酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TyrB）催化下生成酪氨酸［18，19］，因而酪氨酸與3，4-二羥基扁桃酸的合成之間存在前體競爭，敲除酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TyrB）基因阻斷酪氨酸的合成，有可能進(jìn)一步提高3，4-二羥基扁桃酸產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究在大腸桿菌MG1655/ΔA中構(gòu)建了3，4-二羥基扁桃酸生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料生物合成3，4-二羥基扁桃酸。

［1］Yagi K, Nagatsu T, Nagatsu I, et al. Condensation product of ethylenediamine with noradrenaline or 3, 4-dihydroxymandelic acid［J］. Nature, 1960, 23（1）：310-311.

［2］宋巖, 王恒國, 高洪杰, 等. 3, 4-二羥基扁桃酸的合成［J］. 化工科技, 2008, 16（6）：43-45.

［3］Rod F, Humphrey PR, Maureen MD, et al. Rang & Dale's pharmacology［M］. ISBN 0-443-06911-5, 2007.

［4］Ley JP, Engelhart K, Bernhardt J, et al. 3, 4-Dihydroxymandelic acid, a noradrenalin metabolite with powerful antioxidative potential［J］. Agric Food Chem, 2002（50）：5897-5902.

［5］Bj?rsvik HR, Liguori L, Minisci F, et al. High selectivity in the oxidation of mandelic acid derivatives and in O-methylation of protocatechualdehyde：new processes for synthesis of vanillin, iso-vanillin, and heliotropin［J］. Organic Process Research & Development, 2000, 4：534-543.

［6］Kong SY, Oksik C, Lee JK, et al. Artificial biosynthesis of phenylpropanoic acids in a tyrosine overproducing Escherichia coli strain［J］. Microbial Cell Factories, 2012（11）：1-9.

［7］ Mu?oz AJ, Hernández-Chávez G, Anda R, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for improving L-3, 4-dihydroxyphenylalanine（L-DOPA）synthesis from glucose［J］. Microbiol Biotechnol, 2011, 38：1845-1852.

［8］Juminaga D, Baidoo EE, Redding-Johanson AM, et al. Modular engineering of L-tyrosine production in Escherichia coli［J］. Appl Environ Microbiol, 2012, 78：89-98.

［9］Hubbard BK, Thomas MG, Walsh CT. Biosynthesis of L-phydroxyphenylglycine, a non-proteinogenic amino acid constituent of peptide antibiotics［J］. Chemistry & Biology, 2000, 12：931-942.

［10］Tomasz B, Arianna B, Per EM. 4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase：a hybrid density functional study of the catalytic reaction mechanism［J］. Biochemistry, 2004, 43：12331-12342.

［11］Hojati Z, Milne C, Harvey B, et al. Structure, biosynthetic origin, and engineered biosynthesis of calcium-dependent antibiotics from Streptomyces coelicolor［J］. Chemistry & Biology, 2002, 11：1175-1187.

［12］葉玉成, 劉雙平, 張梁, 等. 對(duì)羥基扁桃酸合酶基因的克隆表達(dá)及催化特性［J］. 微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41（1）：8-16.

［13］Pierre L, Agnes A, Comte A, et al. Hydroxytyrosol from tyrosol using hydroxyphenylacetic acid-induced bacterial cultures and evidence of the role of 4-HPA 3-hydroxylase［J］. Research in Microbiology, 2009, 160：757-766.

［14］Lin Y, Yan Y. Biotechnological production of plant-specific hydroxylated phenylpropanoids［J］. Biotechnology and Bioengineering, 2014, 9（111）：1895-1899.

［15］Bai Y, Bi H, Zhuang Y, et al. Production of salidroside in metabolically engineered Escherichia coli［J］. Scientific Reports, 2014, 4：6640.

［16］Bongaerts J, Kr?mer M, Müller U, et al. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds［J］. Metabolic Engineering, 2001, 3：289-300.

［17］Polen T, Kramer M, Wubbolts M, et al. The global gene expression response of Escherichia coli to L-phenylalanine［J］. Journal of Biotechnology, 2005, 115：221-237.

［18］Liu S, Liu R, El-Rotail AMM, et al. Heterologous pathway for the production of L-phenylglycine from glucose by E. coli［J］. Biotechnology, 2014, 186：91-97.

［19］Seiki K, Katsura I, Ogawa T, et al. Aromatic amino acid aminotransferase of Escherichia coli：nucleotide sequence of the tyrB gene［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1985, 133：134-139.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Biosynthesis of 3，4-dihydroxymandelic Acid in an Engineered Escherichia coli Strain

LI Xiao-lin1，2ZHOU Wei2ZHUANG Yi-bin2LU Fu-ping1YIN Hua2
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

3，4-dihydroxymandelic acid，an important pharmaceutical and spices intermediate，possesses strong antioxidative and radical scavenging activities. To achieve the de novo biosynthesis of 3，4-dihydroxymandelic acid in Escherichia coli，the genes of hydroxymandelate synthase（HmaS）from Streptomyces coelicolor and 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase（HpaBC）from E. coli were cloned into pTrcHisB and overexpressed in an engineered E. coli strain MG1655/ΔA. After induction of IPTG and optimization of the inducing temperature，the yield of 3，4-dihydroxymandelic acid reached 240 mg/L in shake flask after 36 hours fermentation，laying a foundation for the large-scale fermentation production of 3，4-dihydroxymandelic acid .

Escherichia coli；3，4-dihydroxymandelic acid；biosynthesis；HmaS；HpaBC

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.015

2016-03-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31400026）

李曉林，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)，E-mail：li_xl@tib.cas.cn；周威為本文并列第一作者

殷華，女，博士，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)；E-mail：yin_h@tib.cas.cn