馬富強楊廣宇，2（. 上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240；2. 華東理工大學上海生物制造技術協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

基于液滴微流控技術的超高通量篩選體系及其在合成生物學中的應用

馬富強1楊廣宇1，2
（1. 上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240；2. 華東理工大學上海生物制造技術協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

構建高效的合成生物學體系經常需要進行大量的篩選工作來優(yōu)化人工體系的運行效率。液滴微流控（droplet microfluidics）技術將常規(guī)篩選體系微型化，在只有皮升（pL）級體積、大小均一的反應器中對酶反應或目標代謝產物進行單細胞水平的檢測和篩選，篩選速度可高達108克隆/d，從而極大地提升了人們對催化元件乃至工程菌株優(yōu)化的能力。綜述了液滴微流控技術在合成生物學應用中的技術背景，重點闡述了目標酶反應及產物檢測的熒光信號偶聯策略，進一步介紹了液滴微流控技術在酶催化元件以及代謝通路的篩選改造方面的研究進展，并展望了該領域的發(fā)展趨勢。

液滴微流控；合成生物學；代謝途徑；酶；高通量篩選

隨著現代生物學DNA合成技術的飛速進步，大規(guī)模合成復雜代謝通路乃至微生物基因組成為現實，進而有力地推動了合成生物學的發(fā)展［1，2］。利用人工設計構建的微生物作為細胞工廠進行化學品的綠色高效生產，有望為解決人類發(fā)展面臨的資源、能源、健康、環(huán)境等若干重大問題提供解決方案。正因為如此，合成生物學在世界范圍內得到了越來越廣泛的關注，并成為生物技術的前沿學科。自從2006年加州大學伯克利分校Keasling教授研究組利用人工代謝途徑在酵母體內合成青蒿酸以來［3］，合成生物學已經在藥物分子、生物能源、功能材料、保健食品等多種重要產品的合成方面取得重要進展。截至到2015年，全世界至少已有81家公司或研究機構的116種合成生物學產品得到開發(fā)應用，總產值高達52億美元［4］，預期2025年這一產值將增長到1 000億美元［5］。

然而，由于人們對復雜生物系統(tǒng)的認識還非常有限，使得構建人工生物系統(tǒng)面臨著巨大的困難：對生物元件的性能表征和機制解析不足，導致由多種蛋白質分子形成的裝置和作用網絡行為難以預測，而當這些裝置和網絡在細胞中發(fā)揮功能時，其行為又會受到細胞內多種環(huán)境因素的影響，使得人工生物體系往往無法按照預先的行為進行工作，嚴重限制了合成生物學愿景的實現。為解決這一問題，科學家們嘗試通過定向進化技術來創(chuàng)造符合預期功能的微生物菌株。相比于常規(guī)的理性設計方法，定向進化不依賴于對生物系統(tǒng)的深入認識，而是模擬自然界達爾文進化原理，首先在實驗室中構建大容量隨機突變庫，然后在施加人工選擇壓力的條件下，從庫中篩選出極少數符合預期表型的個體，已經在多種酶基因、代謝途徑、乃至微生物的改造中取得了成功［6-9］，但定向進化成功的關鍵在于篩選方法的效率和準確性。常規(guī)篩選方法（如搖瓶篩選、孔板篩選等）存在通量較低、費時費力等缺點，獲得一株具有商業(yè)價值的生產菌株往往需要花費巨額資金成本，同時消耗大量不同領域技術人員的勞動力［9］，隨著人們對化學品綠色制造效率的要求越來越高、種類越來越復雜，這種高投入、高成本、低效的開發(fā)策略越來越難以滿足需求。

微流控芯片（microfluidic chip）技術，又稱為芯片實驗室（Lab-on-a-chip）或微全分析系統(tǒng)（miniaturized total analysis systems），是指通過微加工技術將常規(guī)實驗室的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成在只有幾平方厘米尺寸的芯片中，從而實現微型化、自動化和集成化的技術體系。美國《Business2.0》雜志將微流控技術列為“改變世界”的七大技術之一，《Nature》雜志也稱這一技術可能成為“這一世紀的技術”［10］。微流控芯片技術的發(fā)展所催生的液滴微流控（droplet microfluidics）篩選技術以其超高通量、高靈敏度、定量準確的功能，為合成生物學中催化元件、代謝途徑乃至菌株的篩選問題的解決提供了良好的解決方案。本文綜述了液滴微流控篩選技術在合成生物學領域應用的主要進展，重點關注了微反應器中目的產物分子與熒光信號偶聯的策略這一核心問題，并介紹了近年來液滴微流控篩選技術在催化元件（酶）和代謝途徑的優(yōu)化改造方面的應用實例，對未來的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 液滴微流控體系篩選技術原理

液滴微流控技術是微流控芯片技術領域的一個重要發(fā)展方向，其原理是通過特殊的微通道設計，對微米級尺度的微液滴（粒度CV值低于3%）進行大量制備、混勻、融合、分割、孵育、檢測、分選等操作（圖1），從而完成一系列復雜的樣品處理過程［11］。由于微液滴良好的生物相容性，可以作為微反應器進行細胞擴增、恒化培養(yǎng)、細胞裂解、DNA擴增、體外蛋白質表達、酶反應等操作，為合成生物學定向進化的篩選通量問題的解決提供了契機。在一個典型的液滴微流控的篩選體系中，科學家能利用皮升級（pL）體積的微液滴作為反應器，將酶基因、人工構建的代謝途徑、基因表達產物等包裹在其中，利用特定的熒光探針對其進行顯色（圖2），再借助于商品化的流式細胞儀或微流控檢測/分選芯片，對這些微液滴進行高效的分析與分選［12-14］。由于這種技術體系可以在極高的速度下工作，其篩選通量高達108/d，顯著地提高了人們對生物體系進行高通量篩選的能力，為設計高效的酶、代謝途徑乃至微生物菌株提供了有力的工具。

與常規(guī)分析體系相比，基于液滴微流控的高通量篩選體系具有兩個獨特的優(yōu)勢：（1）極大提升了人們對于大規(guī)模樣品的分析能力，微流控體系處理微液滴的速度可高達108/d，在合成生物學家進行催化元件、代謝途徑乃至菌株的高通量篩選時，可以極大地提升效率；（2）由于每個微液滴的體積只有皮升級，相比于常規(guī)的微升至毫升級反應體系縮小了百萬倍以上，對試劑的需求量大大降低，在一些昂貴樣品的分析中具有更加明顯的優(yōu)勢。

2 微液滴篩選的熒光偶聯策略

現有的液滴微流控篩選體系主要使用熒光信號來對代謝產物進行定量，這主要是由于熒光檢測具有很高的靈敏度，非常適合作為皮升級微反應器的檢測信號。因此利用液滴微流控技術進行高通量篩選，首先需要解決的一個關鍵問題是將需要分析的生物活性轉換為可檢測的熒光信號，這是開發(fā)液滴微流控篩選系統(tǒng)所面臨的核心問題。目前常用的熒光信號進行偶聯的策略主要有以下幾種（圖3）。

圖1 微流控液滴操縱技術

圖2 基于液滴微流控的超高通量篩選體系原理圖

2.1 用于酶活性檢測的熒光底物

熒光底物是探測酶活性的靈敏手段，其本身無熒光或只有很低的熒光信號，而其酶促反應產物則具有很強的熒光信號，可以根據反應前后熒光強度的變化對酶活性進行定量分析（圖3-A）。目前已經有多種商品化熒光底物可用于酶活性檢測，包括糖苷酶［15，16］、酯酶/脂肪酶［17］、蛋白酶［18］、過氧化物酶［19］、巰基內酯酶［20］等。除此之外，也有人利用熒光共振能量轉移原理（FRET）設計了熒光探針，利用酶反應前后底物熒光波長的強烈變化來探測酶活性，已經在蛋白酶［21-23］、酯酶/脂肪酶［24］、β-內酰胺酶［25］、神經節(jié)苷脂降解酶［26］等酶活性中得到了應用。

目前絕大多數熒光底物都是為宏觀體系下比色皿中或96孔板中的酶活性檢測所開發(fā)的，大都是基于熒光素、香豆素、試鹵靈等疏水性較強熒光基團的衍生物。然而，在用于微液滴體系中的時候，由于微液滴的油水相界面并不是嚴格的物理隔離，這些疏水的熒光基團在微液滴中保留性較差，會快速擴散到油相中［27，28］或通過臨界膠束傳遞的方式在臨近微液滴之間快速擴散［29，30］，造成不同反應體系的交叉干擾，影響酶活性檢測的準確性。為解決這一問題，研究者們通過引入極性較強的磺酸基或羧基修飾，大大提高了熒光信號在微液滴中的穩(wěn)定性，使香豆素在微液滴中泄漏的半衰期從2.1 s提高到2.8 d以上。目前這種策略已經成功用于氧化酶［31］、內酰胺酶［32］及葡萄糖苷酶［33］的熒光底物設計。近期，本課題組又進一步提出了液滴熒光捕獲（Fluorescence droplet entrapment，FDE）的底物設計策略，提出自身具有較高疏水性、但在酶反應后會釋放高親水性熒光基團的底物可能更加適合微液滴體系的酶活性檢測［34］。具有FDE效應的底物可以通過油相擴散到微液滴中進行酶反應，而產生的強親水性熒光產物具有較好的液滴保留穩(wěn)定性，因此能夠同時增加酶反應可控性并降低熒光背景，從而實現更加準確的酶活性定量。基于FDE熒光底物設計策略，我們已經提出了包括糖苷酶、蛋白酶、酯酶、脂肪酶等重要酶活性檢測的熒光底物結構，有望為一系列重要酶活性的液滴微流控高效篩選方法建立鋪平道路［34］。

圖3 液滴微流控體系的熒光信號偶聯策略

2.2 酶聯熒光探針偶聯代謝產物檢測

許多重要的小分子代謝產物都無法直接通過熒光進行檢測，成為利用液滴微流控體系進行代謝途徑和微生物菌株篩選的瓶頸。利用多酶級聯反應可以間接將這些小分子物質轉換為熒光信號，為解決這一問題提供有效途徑。典型的策略是通過特異性識別目標代謝產物的氧化還原酶，可以催化目標化合物的氧化反應生成過氧化氫或NADH，再利用相應的偶聯酶及熒光探針將過氧化氫或NADH轉化為熒光信號，從而實現目標代謝產物的熒光偶聯（圖3-B）。例如，Hammar等［35］采用乳酸脫氫酶將乳酸氧化為丙酮酸，同時將NAD+還原為NADH，再利用商品化的NADH熒光顯色試劑盒（Cayman Chemical公司生產）將NADH轉化為熒光信號（圖3-E），并用于從乳酸產生軍的紫外誘變庫中篩選高產菌株；Wang等［36］采用乳酸氧化酶將乳酸氧化生成過氧化氫，再利用過氧化物酶（如辣根過氧化物酶）和過氧化氫相應的熒光探針（如Invitrogen公司的Amplex UltraRed 探針）將過氧化氫轉化為紅色熒光物質試鹵靈（resorufin）（圖3-D），作者利用該顯色方法能夠將極少量的產乳酸細胞從大量背景細胞中有效富集；類似地，Abalde-Cela等［37］采用乙醇氧化酶將乙醇氧化生成過氧化氫，再進一步將過氧化氫轉化為試鹵靈，利用該體系也能夠將產乙醇菌株從大量背景細胞中有效富集。目前，多酶偶聯策略已經可以實現對微反應器中的乳酸［35，36］、乙醇［37］、木糖［36］、葡萄糖［38，39］等多種產物進行定量。隨著更多專一性氧化酶的開發(fā)和利用，這一體系有潛力擴展至各種糖類、氨基酸、脂類及激素類代謝產物的定量，從而為多種重要代謝途徑和菌株定向進化提供有效的篩選方法。

2.3 生物傳感器代謝產物檢測

利用微生物自身的遺傳調控機制來感應代謝產物的技術，稱為生物傳感器（biosensors）［9］。轉錄調控因子（transcriptional regulator，TR）是應用十分廣泛的生物傳感器，由一系列調控DNA序列及其編碼的調控蛋白組成，DNA序列本身或其編碼的蛋白質能夠響應特定的代謝產物，當沒有代謝產物存在時，由于調控序列本身的特殊二級結構或調控蛋白與DNA結合而阻遏了下游基因的表達；有代謝產物存在時，代謝產物與調控序列或調控蛋白結合，破壞原有的DNA二級結構或調控蛋白構象，進而解除對其下游基因表達的阻遏。例如，常見的乳糖操縱子，由該操縱子編碼的阻遏蛋白能夠與啟動子序列結合，阻遏下游蛋白的轉錄翻譯，當阻遏蛋白與乳糖結合后發(fā)生構象改變，釋放出啟動子序列，最終啟動下游蛋白的表達［40］。微生物體內存在各種不同類型的轉錄調控因子，因而能夠為不同代謝分子的熒光檢測提供豐富的工具［41-43］。另一種生物傳感器是基于mRNA水平調控的核糖體開關（riboswitch），核糖體開關是位于RNA 5'末端的非翻譯區(qū)序列，能夠形成二級結構，阻礙其下游的核糖體結合位點（ribosome-binding site，rbs）與核糖體的結合，進而阻礙下游基因的翻譯；當核糖體開關與特定的代謝分子結合后，二級結構發(fā)生變化，釋放出核糖體結合位點，最終解除對下游基因翻譯的抑制［44，45］。將熒光蛋白基因置于生物傳感器調控序列的下游，可以通過熒光蛋白的表達量來反映出代謝產物的濃度，從而能夠實現目標產物與熒光信號的偶聯（圖3-C），結合流式細胞儀的FACS功能，可以分選出熒光信號強、目標產物產量高的菌株，該策略能夠在催化元件性能提升［46，47］以及高產菌株鑒定［48，49］中發(fā)揮重要作用。例如，Cheng等［46］利用精氨酸響應的生物傳感器，提高了精氨酸脫亞胺酶的活性及對底物的親和力，突變體能夠催化在生理環(huán)境下濃度極低的精氨酸，對腫瘤細胞生長具有顯著的抑制作用；Siedler等［47］利用能夠響應NADPH的SoxR傳感器，建立了NADPH依賴型酶的篩選體系，并運用該體系提高NADPH依賴型乙醇脫氫酶的催化活性；Binder等［49］采用來源于Corynebacterium glutamicum的傳感器LysG來檢測賴氨酸的濃度，通過FACS篩選從宿主全基因組突變庫中獲得了L-賴氨酸的高產菌株并進一步鑒定出了相關的突變基因型。最近，清華大學張翀、邢新會教授課題組開發(fā)了中間產物傳感器輔助的推-拉策略（intermediate sensorassisted push-pull strategy），作者采用L-色氨酸生物傳感器來探測脫氧紫色桿菌素（deoxyviolacein）生物合成途徑的重要中間體——L-色氨酸，利用該體系分別對中間體前后兩個合成模塊進行優(yōu)化，首先通過篩選提高L-色氨酸的產量，然后篩選L-色氨酸高轉化率的菌株，最終成功將脫氧紫色桿菌素的產量提高了4.4倍［50］。

2.4 其他熒光偶聯策略

除上述列舉的熒光偶聯策略，人們還針對一些特殊的應用開發(fā)了更加多樣化的熒光偶聯策略。Pitzler等［51］針對肌醇六磷酸酶（phytase）的活性設計了基于熒光凝膠的毛-核（fur-shell）熒光偶聯方法。該方法利用酶偶聯反應產生的羥基自由基引發(fā)poly（ethyleneglycol）-acrylate的聚合反應（Fenton’s reaction），同時將熒光分子嵌合在聚合物中，從而以宿主細胞為核心，形成一層熒光凝膠的“毛”供檢測。Larsen等［52］開發(fā)了DNA聚合酶的通用性酶活性熒光偶聯策略：他們通過將單鏈DNA模板的5'末端共價連接熒光基團，再合成與5'端互補的寡核苷酸并連接上熒光淬滅基團，形成淬滅子（DNA-quencher）。在DNA復制之前，熒光基團處于淬滅狀態(tài)，在聚合酶鏈式反應后，淬滅子與模板的結合被新合成的DNA片段取代，釋放出熒光信號，熒光信號的強度反映了目標酶的催化效率。此外，Fischlechner等［53］開發(fā)了凝膠殼微球（gel-shell beads）的技術來實現常規(guī)微液滴的熒光信號偶聯功能；Woronoff等［54］開發(fā)了活性調節(jié)翻譯（activity-fed translation，AFT）的酶活性熒光偶聯策略，酶催化產生的產物能夠啟動微反應器中無細胞轉錄翻譯（in vitro transcription and translation，IVTT）體系，進而合成反映酶活性高低的熒光蛋白。新的熒光偶聯策略的開發(fā)，將不斷擴展液滴微流控技術在合成生物學領域的應用范圍。

3 液滴微流控技術在催化元件篩選中的應用

由各類酶分子構成催化網絡為細胞提供生理活動所需的能量、合成或降解其他生物分子、傳遞和處理各種信號等，是構成復雜生命過程的基礎［55］。利用液滴微流控技術進行高通量篩選，可以助力定向進化或宏基因組技術獲得符合預期性質的新酶資源，為合成生物學提供優(yōu)良的催化元件。

2010年，Agresti等［19］率先利用液滴微流控體系對辣根過氧化物酶進行了定向進化，通過對107個展示在酵母細胞表面的突變體進行篩選，成功將初始催化效率已經很高的商品化酶活性又提高了10倍。整個進化歷程篩選時間累計只有10 h，比常規(guī)的孔板法提高1 000倍；消耗試劑總體積150 μL，比孔板法降低100萬倍以上，充分顯示出液滴微流控體系作為新一代超高通量篩選體系的巨大優(yōu)勢。之后，來自不同研究組的科研人員進一步對液滴微流控超高通量篩選系統(tǒng)進行了一系列的技術改進和體系優(yōu)化，Kintses等［56］開發(fā)了微反應器中的細胞破碎技術，將單細胞和細胞裂解試劑同時包裹進微反應器，從而使該系統(tǒng)可以用于胞內酶的檢測篩選；Hosokawa等［57］和Colin等［58］分別將該系統(tǒng)擴展到從宏基因組中發(fā)掘新酶資源，鑒定出了一系列新酶基因；本課題組與美國密歇根大學Katsuo Kurabayashi教授課題組合作，建立了雙色熒光液滴微流控篩選體系，可以同時檢測酶對兩種熒光底物的催化活性，進而可以對酶的立體選擇性、區(qū)位選擇性、底物特異性等復雜性質進行改造。應用該體系，我們成功將嗜熱酯酶對S型異丙基布洛芬底物的立體選擇性提高了700倍（Ma，Yang等，未發(fā)表）。

目前，利用液滴微流控體系已成功對各類酶的不同性質進行了改造。表1總結了利用液滴微流控技術進行酶性質改造或從宏基因組中發(fā)掘新酶資源的實例（截至2016年9月）。

表1 液滴微流控技術酶性質改造及新酶發(fā)現實例

4 液滴微流控技術在代謝產物檢測與篩選中的應用

液滴微流控技術還可以對細胞所產生的特定代謝產物進行定量分析與篩選（圖3-B），因此在人工代謝途徑和微生物菌株的定向進化中都具有重要的應用。更重要的是，由于微反應器具有對單細胞進行區(qū)室化的功能，不同基因型的細胞可以在微反應器中獨立地進行生理活動，產生的分泌型代謝產物在各自的微反應器中積累而不會相互干擾，因此液滴微流控技術特別適用于對分泌型代謝產物進行精確的定量，比常規(guī)的單細胞生物傳感器具有更為廣闊的應用范圍。如在重要工業(yè)酶蛋白的生產菌株產量優(yōu)化方面，Sjostrom等［62］對表達α-淀粉酶的酵母菌株進行了紫外誘變，并利用液滴微流控技術進行了篩選，最終獲得了α-淀粉酶表達量提高兩倍的穩(wěn)定高產菌株。在此基礎上，Huang等［63］通過進一步篩選獲得了表達量提高6倍的菌株，并結合全基因組超高通量測序技術，鑒定出了突變菌株基因組中與蛋白高分泌表達相關的330個基因。這將有助于加深人們對酵母中蛋白質合成與分泌的生理生化機制的進一步理解，進而促進高效蛋白質合成途徑的理性構建。在對分泌型小分子代謝產物的表達量進行定量和篩選方面，Wang等［36］分別利用液滴微流控篩選平臺開發(fā)了針對酵母菌株胞外木糖消耗能力和大腸肝菌分泌生產乳酸能力的篩選方法。該技術平臺首先將單細胞工程菌連同培養(yǎng)基包裹在微反應器中，不同的微反應器經過2 d的孵育進行細胞培養(yǎng)，呈現了不同的營養(yǎng)物質消耗及代謝產物分泌狀態(tài)。通過與包含熒光探針的檢測試劑進行融合，能夠對微反應器中木糖、乳酸等目標檢測物進行定量分析，幫助篩選得到具有符合預期生物活性的菌株。作者利用該體系，成功地鑒定出了決定木糖高消耗性狀的關鍵基因型［36］，并為進行其它小分子代謝產物的檢測與篩選指明了方向。

表2總結了利用液滴微流控技術進行代謝途徑或全基因組定向進化的實例（截至2016年9月）。值得注意的是目前液滴微流控技術在合成生物學篩選方面的應用主要集中于方法體系的建立，而對代謝通路進行實際篩選的實例仍較少。隨著該體系的進一步成熟，將會產生越來越多的合成生物學應用實例。

表2 液滴微流控技術酶性質改造及新酶發(fā)現實例

5 展望

液滴微流控篩選體系以其超高通量、定量準確、試劑消耗低等優(yōu)點，在酶催化元件、代謝途徑、乃至菌株的定向進化方面體現了重要的應用潛力，推動了合成生物學的持續(xù)發(fā)展。近年來，多學科交叉技術的匯聚和融合，也使得液滴微流控篩選體系進一步向縱深發(fā)展，如目前已可以在微流控芯片上進行DNA片段組裝、宿主細胞轉化、細胞培養(yǎng)、重組蛋白表達等復雜操作，這一方面大大減少了工作量，更有利于提高實驗結果的重現性，提升工作效率。另一方面，科學家們也嘗試將其它非標記的檢測手段整合到液滴微流控體系中，以進一步擴展篩選體系的通用性，如質譜（mass spectrometry）［65，66］、表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）［67］、小角度X射線衍射（small angle X-ray scattering，SAXS）［68］、熒光偏振（fluorescence anisotropy）［69］、熒光極化（fluorescence polarization）［70］、毛細管電泳（capillary electrophoresis）［71］等，均已在微流控芯片的檢測上取得相當大的進展?？梢灶A見，隨著這些新技術體系的發(fā)展成熟，液滴微流控篩選將在合成生物學中發(fā)揮越來越大的作用，從而極大地加速生物能源、生物材料、平臺化學品、天然產物等重要產品的品種創(chuàng)新與高效制造。

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（責任編輯 馬鑫）

Ultra-high-throughput Screening System Based on Droplet Microfluidics and Its Applications in Synthetic Biology

MA Fu-qiang1YANG Guang-yu1，2
（1. School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240；2. Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

The construction of a highly efficient synthetic biological system requires laborious screening work to optimize the performance of artificial system. Droplet microfluidic techniques miniaturize traditional screening systems，in a uniform pico-liter micro-reactors，the detection of enzymatic reactions and metabolites at single-cell level were measured and screened，thus it can screen genes/cells at a speed up to ＞108events per day，which greatly improves the optimizing capability of catalytic parts and engineered strains. Herein，the technical backgrounds while applying droplet microfluidics in synthetic biology system are summarized，focusing on the fluorescence-coupling strategies in the detection of target enzyme reactions and metabolites. Moreover，recent progress on employing droplet microfluidics in the screening and engineering of catalytic parts and metabolic pathways is reviewed，the developing trends of this field are discussed.

droplet microfluidics；synthetic biology；metabolic pathway；enzyme；high-throughput screening

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.009

2016-10-14

國家自然科學基金項目（31470788，31100611）

馬富強，男，博士，研究方向：分子酶學及合成生物學；E-mail：mafuqiang318@sina.com

楊廣宇，男，博士，副研究員，研究方向：分子酶學及合成生物學；E-mail：yanggy@sjtu.edu.cn