饒德明張良程陳久洲孫德虎孫村民鄭小梅鄭平刁愛坡（. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

谷氨酸棒狀桿菌合成5-氨基乙酰丙酸的途徑構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化

饒德明1，3張良程1，3陳久洲2，3孫德虎1，3孫村民2，3鄭小梅2，3鄭平2，3刁愛坡1
（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

5-氨基乙酰丙酸（5-amino levulinic acid，ALA）是生物體內(nèi)天然存在的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。為了在谷氨酸棒狀桿菌中建立ALA碳四合成途徑并優(yōu)化其發(fā)酵體系，首先在谷氨酸棒狀桿菌中過表達(dá)沼澤紅假單胞菌來源的ALA合成酶（ALAS），建立高效的ALA碳四合成途徑，然后從不同發(fā)酵培養(yǎng)基的比較、誘導(dǎo)劑和底物甘氨酸的濃度以及初始接種量等不同方面對ALA搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，過表達(dá)HemA的13032/pZWA1菌株 ALA產(chǎn)量達(dá)到1.41 g/L，是對照菌株的67.14倍。ALA的最優(yōu)搖瓶發(fā)酵條件為以酵母粉為氮源的M9培養(yǎng)基，采用5%的接種量0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行HemA的誘導(dǎo)表達(dá)，體系中甘氨酸的濃度要控制在4 g/L，搖瓶中ALA產(chǎn)量可達(dá)到3.28 g/L，比優(yōu)化前提高了132.62%。采用發(fā)酵優(yōu)化的條件，在5 L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵中ALA產(chǎn)量可達(dá)10.08 g/L，這是現(xiàn)有報(bào)道中谷氨酸棒狀桿菌一步發(fā)酵合成ALA的最高產(chǎn)量。

5-氨基乙酰丙酸；谷氨酸棒狀桿菌；5-氨基乙酰丙酸合成酶；沼澤紅假單胞菌；發(fā)酵優(yōu)化

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，簡稱ALA）廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物等所有生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)四吡咯類化合物（例如，亞鐵血紅素、卟啉、葉綠素和維生素B12）合成的共同前體［1］。ALA在農(nóng)業(yè)［1-3］和醫(yī)藥［3-5］領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，以其為主要成分的植物生長促進(jìn)劑和光敏劑在國內(nèi)外已被廣泛使用。近些年，以ALA為主要成分的保健食品和化妝品也已上市銷售，此外，ALA還可作為飼料添加劑用于動(dòng)物飼料領(lǐng)域［6-10］。ALA廣闊的應(yīng)用前景引起了人們對ALA生產(chǎn)的濃厚興趣，目前國內(nèi)外已經(jīng)分別研究建立了采用化學(xué)合成法以及生物發(fā)酵法合成ALA的工藝路線，但是ALA產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)主要通過高成本、高污染［11］和得率低的化學(xué)法合成［12］，導(dǎo)致ALA價(jià)格昂貴，限制了ALA的市場開發(fā)和應(yīng)用。由于具備清潔廉價(jià)的優(yōu)勢，因此，近年來研究者的目光主要集中在利 用生物發(fā)酵法合成ALA的研究和應(yīng)用中。

生物體內(nèi)ALA的合成主要有兩條途徑，即由谷氨酸經(jīng)過三步酶促反應(yīng)生成ALA的碳五途徑和由ALA合成酶（ALAS）催化琥珀酰輔酶A與甘氨酸反應(yīng)合成ALA的碳四途徑［1］。由于碳四途徑只涉及一步酶促反應(yīng)，因此目前通過生物法合成ALA應(yīng)用最廣泛的方法是利用引入外源ALA合成酶的工程菌，結(jié)合發(fā)酵工藝的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)ALA的大量合成［13］。目前，上述工程菌及代謝工程改造大部分是在遺傳操作系統(tǒng)成熟的大腸桿菌（Escherichia coli）中完成和實(shí)現(xiàn)［14，15］。然而，以E.coli為宿主合成氨基酸時(shí)會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，導(dǎo)致下游提取困難，提高了工業(yè)上的成本，限制了其在醫(yī)藥食品等領(lǐng)域的應(yīng)用，這是利用E.coli發(fā)酵合成ALA過程中不可避免的問題。

由 于 谷 氨 酸 棒 狀 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）本身具有較強(qiáng)的氨基酸合成能力，并且不產(chǎn)生內(nèi)毒素，因此在發(fā)酵工業(yè)中C. glutamicum被廣泛用于各種氨基酸和有機(jī)酸的生物合成，例如L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸和γ-氨基丁酸等［16］。近年來，利用C. glutamicum為宿主菌合成ALA也取得了一定的進(jìn)展。Ramzia等［17］在C. glutamicum中共表達(dá)碳五途徑關(guān)鍵酶的谷氨酰tRNA還原酶（來源于Salmonella typhimurium）和谷氨酸-1-半醛基轉(zhuǎn)氨酶（來源于E.coli），ALA產(chǎn)量最高可以達(dá)到2.2 g/L。Feng等［18］在C. glutamicum中過表達(dá)來源于類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）的ALAS，建立了ALA合成的碳四途徑，結(jié)合其它多個(gè)位點(diǎn)的改造后，工程菌在5 L發(fā)酵罐中ALA產(chǎn)量達(dá)到7.53 g/L。Yang等［19］通過在C. glutamicum中表達(dá)不同來源的ALAS引入碳四途徑，發(fā)現(xiàn)不同來源ALAS酶活水平與ALA產(chǎn)量差異較大，琥珀酰輔酶A合成酶編碼基因（sucCD）缺失后，工程菌一步法發(fā)酵可使ALA產(chǎn)量達(dá)到7.6 g/L，換用菌體生長和產(chǎn)物合成過程分離的兩步法發(fā)酵后ALA產(chǎn)量達(dá)到14.7 g/L。綜上所述，C. glutamicum中通過碳四途徑的構(gòu)建可有效提升ALA的積累，并且不同來源ALAS與不同發(fā)酵工藝和體系會(huì)顯著影響ALA的產(chǎn)量。現(xiàn)有研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但菌株性能和工藝成熟度與大腸桿菌相比還有一定的差距。兩步法發(fā)酵雖然獲得了較高的ALA產(chǎn)量，但同時(shí)也增加了菌體收集和培養(yǎng)體系更換的程序，導(dǎo)致發(fā)酵工藝復(fù)雜，發(fā)酵周期延長，難以在實(shí)際生產(chǎn)中放大應(yīng)用。而傳統(tǒng)的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝簡單，技術(shù)裝備成熟，在實(shí)際應(yīng)用中更容易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化放大，但現(xiàn)有研究缺乏關(guān)于利用C. glutamicum作為宿主菌株的合成ALA發(fā)酵過程中培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝優(yōu)化的報(bào)道，導(dǎo)致目前該工藝下ALA產(chǎn)量較低，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。

前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris ATCC17001） 中 存 在兩種ALAS的同工酶HemA與HemO，兩者比酶活分別是3.6 U/mg和2.7 U/mg，HemA 活力相對較高［20］。本研究選擇將沼澤紅假單胞菌的HemA在C. glutamicum中過表達(dá)，構(gòu)建具有ALA碳四合成途徑的工程菌株，并從發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇、誘導(dǎo)劑的濃度、底物甘氨酸的濃度以及初始接種量等不同方面對ALA搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上建立5 L ALA發(fā)酵放大工藝，旨在為C. glutamicum ALA高產(chǎn)菌株的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DNA聚合酶、DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、T4 Polynucleotide Kinase購自Fermentas公司；E.coli質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自TIANGEN公司；C. glutamicum質(zhì)粒提取試劑盒購自Solarbio公司；引物合成和基因測序由金唯智公司完成；酵母粉和胰蛋白胨購自英國Oxoid 公司；瓊脂粉、甘氨酸、IPTG和硫酸卡那霉素購自Solarbio公司；5-氨基乙酰丙酸和對二甲氨基苯甲醛等購自Sigma公司；葡萄糖購自濰坊盛泰藥業(yè)有限公司；高氯酸購自天津市東方化工廠；冰醋酸和乙酰丙酮購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。其他生化試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LBG培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖5 g/L。

菌株活化培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L、玉米漿3 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：培養(yǎng)基1主要成分是葡萄糖50 g/L、（NH4）2SO410 g/L、MnSO41 g/L、K2HPO41.5 g/L、MgSO40.6 g/L、玉米漿1 g/L、甘氨酸4 g/L、MOPS 31.395 g/L、pH至7.0。培養(yǎng)基2主要成分是Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L、KH2PO43 g/L、NH4Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、酵母粉2 g/L、MgSO42 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、葡萄糖50 g/L、甘氨酸 4 g/L、根據(jù)需要添加卡那霉素 50 μg/mL。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基主要成分是Na2HPO4·12H2O 3 g/L、KH2PO43 g/L、NaCl l0.5 g/L、NH4Cl 1 g/L、葡萄糖50 g/L、MgSO41 g/L、CaCl20.1 mmol/L、酵母粉5 g/L、尿素5 g/L、適量微量元素。5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基主要成分是酵母粉2 g/L、NH4Cl 5 g/L、KH2PO41.5 g/L、K2HPO4·3H2O 6 g/L、初始葡萄糖80 g/L、適量微量元素及金屬離子。根據(jù)需要添加終濃度為50 μg/mL的卡那霉素。

1.1.3 菌株、質(zhì)粒和引物 本研究中所用的菌株、質(zhì)粒與引物見表1。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒與引物

1.2 方法

1.2.1 R. palustris ATCC17001 hemA基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在C. glutamicum中表達(dá) 根據(jù)R. palustris ATCC17001 hemA基因的序列設(shè)計(jì)引物hemA-F和hemA-R，并分別添加EcoR I和Sma I酶切位點(diǎn)，具體引物序列見表1。以含有目的基因的載體pZZA1為模板，利用引物hemA-F和hemA-R，通過PCR擴(kuò)增獲得目的片段，酶切后連接pEC-XK99E載體，并將正確重組載體命名為pZWA1。將上述重組載體pZWA1及pEC-XK99E分別轉(zhuǎn)化C. glutamicum ATCC13032菌株，獲得的工程菌株分別命名為13032/pZWA1和13032/pEC-XK99E。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證 取100 μL保藏在-80℃甘油管中的菌液接入裝有50 mL菌株活化培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。將種子液按3%（V/V）的接種量，接入裝有50 mL培養(yǎng)基1的500 mL三角瓶中。在30℃、220 r/min 下培養(yǎng)3 h后加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)37 h。發(fā)酵過程中分別在12 h和24 h用25%的氨水將發(fā)酵液pH調(diào)至7.0。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化 （1）培養(yǎng)基成分的優(yōu)化：利用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基2替代1.2.2中的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基1，其它條件不變。（2）誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化：在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基2的基礎(chǔ)上，分別使用終濃度為0.05、0.1、0.3和0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，其它條件不變。（3）甘氨酸濃度的優(yōu)化：在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基2的基礎(chǔ)上，分別將其中的甘氨酸濃度變?yōu)?、2、6和8 g/L，利用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，其它條件不變。（4）初始接種量的優(yōu)化：在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基2的基礎(chǔ)上，分別將初始接種量變?yōu)?%、5%、7%、10%和15%（V/V），利用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，其它條件不變。

1.2.4 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵 將活化后的菌株按1%（V/V）轉(zhuǎn)接到裝有200 mL種子培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，在30℃、220 r/min 培養(yǎng)12-15 h；5 L發(fā)酵罐（上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司）裝液量為2 L，初始接種量為1%（V/V），發(fā)酵過程溫度控制在30℃，自動(dòng)流加25%的氨水控制pH在6.5，溶氧維持在20%以上，18 h后pH調(diào)至6.0，溶氧調(diào)控制在5%以上。發(fā)酵初始葡萄糖80 g/L，發(fā)酵過程通過流加800 g/L的葡萄糖將葡萄糖濃度控制在5-15 g/L。11 h添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)添加4 g/L甘氨酸，此后，分別在23、28和34 h添加4、2和2 g/L甘氨酸。

1.2.5 ALA、甘氨酸與葡萄糖的檢測 ALA的檢測方法參考Mauzerall and Granick［21］。甘氨酸檢測方法：取20 μL離心后的發(fā)酵液上清，加入200 μL衍生劑（1% 2，4-二硝基氟苯乙腈溶液）和200 μL衍生緩沖液（50 mmol/L NaHCO3溶液），震蕩混勻后60℃衍生1 h，最后加780 μL的定溶緩沖液（50 mmol/L KH2PO4溶液），震蕩混勻后用孔徑為0.22 μm的無菌濾膜過濾，利用日本島津高效液相色譜儀（HPLC）檢測發(fā)酵液中甘氨酸的含量，色譜柱是Agilent HC-C18（2）（USA 4.6×250 mm），流動(dòng)相A為50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH6.4），流動(dòng)相B為50%乙腈溶液（乙腈溶液∶去離子水=1∶1，V/V）。流速1 mL/min，紫外波長360 nm，柱溫36℃，進(jìn)樣品20 μL，測樣停留時(shí)間為35 min。

葡萄糖分析方法：采用山東省科學(xué)院生產(chǎn)的SBA-40D 生物傳感分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.6 ALAS酶活檢測 為了檢測粗酶液中ALAS，將發(fā)酵液在4℃下離心收集菌體，加入1 mL buffer（50 mmol/L Tris-HCl 100 mmol/L NaCl pH7.4）洗滌3次，然后加入800 μL相同buffer重懸菌體，最后利用Fast Prep-24（MP Biomedicals，USA）機(jī)械震蕩破碎細(xì)胞，具體過程參考文獻(xiàn)報(bào)道［22］，震蕩破碎的細(xì)胞混合液在4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液檢測ALAS比活力。ALAS活性測定參考Burnham等［23］和Zhang等［20］報(bào)道的方法ALAS酶活單位U定義為：37℃時(shí)，每分鐘內(nèi)產(chǎn)生1 nmoL ALA 所需的酶量。

2 結(jié)果

2.1 R. palustris ATCC17001 ALAS表達(dá)菌株的構(gòu)建

及發(fā)酵驗(yàn)證

本研究在C. glutamicum中過表達(dá)來自R. palustris ATCC17001的ALAS編碼基因hemA，構(gòu)建ALA合成的碳四途徑。通過PCR擴(kuò)增獲得R. palustris ATCC17001的hemA基因片段，PCR結(jié)果（圖1-A）顯示，hemA基因片段長度為1 212 bp，目的條帶大小與預(yù)期一致。PCR片段與載體pEC-XK99E連接，構(gòu)建獲得帶有trc啟動(dòng)子及相應(yīng)終止子的目的基因表達(dá)盒，轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果（圖1-B）顯示，目的片段大小1 412 bp，1號和3號轉(zhuǎn)化子條帶大小與預(yù)期一致。將上述正確轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1-C，雙酶切后目的片段大小分別為1 226 bp和7 018 bp，片段大小與預(yù)期一致；正確轉(zhuǎn)化子經(jīng)過測序驗(yàn)證后命名為pZWA1。

為了檢測R. palustris ATCC17001來源的ALAS在C. glutamicum中表達(dá)后ALA的產(chǎn)量，分別將構(gòu)建正確的重組載體pZWA1及載體pEC-XK99E轉(zhuǎn)化C. glutamicum ATCC13032菌株，獲得ALA生產(chǎn)菌株13032/pZWA1和對照菌株13032/pEC-XK99E。首先對ALA生產(chǎn)菌株13032/pZWA1粗酶液中HemA的比活力進(jìn)行測定，結(jié)果表明工程菌中HemA的比活力為37.86 U/mg。為了進(jìn)一步檢測生產(chǎn)菌株ALA的合成能力，在以玉米漿為有機(jī)氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對兩種菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果（圖2）顯示，13032/pZWA1菌株中ALA產(chǎn)量達(dá)到1.41 g/L，而對照菌中ALA產(chǎn)量只有0.021 g/L，過表達(dá)HemA后ALA產(chǎn)量是對照菌株的67.14倍。表明在C. glutamicum中過表達(dá)來自R. palustris ATCC17001的HemA，可使ALA的積累顯著提高。

圖1 重組載體pZWA1構(gòu)建過程中電泳驗(yàn)證結(jié)果

圖2 R. palustris ATCC17001 HemA表達(dá)對C. glutamicum ALA合成的影響

2.2 ALA C. glutamicum生產(chǎn)菌株13032/pZWA1的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基的比較 為了獲得生產(chǎn)性能更穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基，利用ALA生產(chǎn)菌株13032/pZWA1以酵母粉為有機(jī)氮源的M9培養(yǎng)基（培養(yǎng)基2）與以玉米漿為有機(jī)氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（培養(yǎng)基1）進(jìn)行發(fā)酵比較，結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)基2中菌株OD600值29.8，同時(shí)培養(yǎng)基2中ALA產(chǎn)量達(dá)到2.13 g/L，比培養(yǎng)基1中ALA產(chǎn)量提高了42.95%。另外，在不同批次的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基2的重復(fù)性比培養(yǎng)基1更好，說明培養(yǎng)基2更適合菌株生長和ALA合成。因此，后續(xù)采用以酵母粉為氮源的M9培養(yǎng)基發(fā)酵優(yōu)化。

圖3 不同的培養(yǎng)基對 ALA及菌株生長的影響

2.2.2 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 由于hemA基因的表達(dá)使用的是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子trc啟動(dòng)子，trc啟動(dòng)子受IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑IPTG的濃度會(huì)影響ALAS的表達(dá)。因此設(shè)計(jì)了4個(gè)濃度梯度的IPTG進(jìn)行ALA的搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果（圖4-A）顯示，當(dāng)IPTG濃度0.1 mmol/L時(shí)，ALA產(chǎn)量最優(yōu)達(dá)到2.36 g/L，而當(dāng)誘導(dǎo)IPTG 濃度是0.05 mmol/L和0.5 mmol/L時(shí)，ALA產(chǎn)量分別僅有2.16 g/L和2.15 g/L，說明誘導(dǎo)劑IPTG濃度過低或者過高都不利于ALA積累。 IPTG濃度在0.1-0.5 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)對菌株生長沒有明顯影響，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)劑IPTG濃度均采用0.1 mmol/L。

2.2.3 底物甘氨酸濃度的優(yōu)化 ALA生產(chǎn)菌株13032/pZWA1通過碳四途徑以甘氨酸為底物合成ALA，高濃度甘氨酸對菌株生長有抑制作用，發(fā)酵體系中需要控制甘氨酸濃度在一定范圍內(nèi)。因此，為了測試不同濃度的甘氨酸對ALA產(chǎn)量的影響。發(fā)酵結(jié)果（圖4-B）顯示，在相對低濃度下，對菌株生長無明顯影響且甘氨酸的濃度與ALA的產(chǎn)量成正比，當(dāng)甘氨酸濃度至4 g/L時(shí)，ALA產(chǎn)量達(dá)到最優(yōu)2.41 g/L，甘氨酸濃度超過4 g/L時(shí)，對菌株生長有明顯的抑制，從而降低了ALA的產(chǎn)量，因此，后續(xù)發(fā)酵體系中甘氨酸的濃度要控制在4 g/L的范圍上。

2.2.4 初始接種量的優(yōu)化 搖瓶初始接種量對菌體生長和產(chǎn)物積累均有一定的影響。本研究測試了不同的接種量對生產(chǎn)菌株13032/pZWA1的生長與ALA產(chǎn)量的影響，發(fā)酵結(jié)果如圖4-C所示。當(dāng)接種量為3%-5%時(shí)，菌株的OD600值從25.47增加到31.47，且ALA產(chǎn)量與接種量成正比，但是接種量大于7%時(shí)，對菌株OD600值大小影響不明顯；而當(dāng)接種量大于5%時(shí)，隨著接種量的增加ALA產(chǎn)量反而降低。因此，后續(xù)搖瓶發(fā)酵過程中選擇5%的接種量。

2.2.5 搖瓶發(fā)酵體系優(yōu)化前后的比較 為測試搖瓶發(fā)酵體系的優(yōu)化，本研究對ALA生產(chǎn)菌株13032/pZWA1采用優(yōu)化前后的不同發(fā)酵體系進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵。采用優(yōu)化后的體系（0.1 mmol/L IPTG，4 g/L甘氨酸，5%的接種量的酵母粉M9培養(yǎng)基），搖瓶發(fā)酵37 h后，ALA生產(chǎn)菌株13032/pZWA1 OD600值最大達(dá)到了29.03，比優(yōu)化前提高了57.17%，ALA最大產(chǎn)量達(dá)到了3.28 g/L，比優(yōu)化前提高了132.62%（圖4-D）。

圖4 13032/pZWA1的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

2.3 ALA 5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵放大

為了驗(yàn)證本文優(yōu)化建立的發(fā)酵體系的放大效果和菌株13032/pZWA1合成ALA的潛力，嘗試在可以精確調(diào)控pH和溶氧等參數(shù)的5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行ALA的發(fā)酵測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。ALAS在11 h開始誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)添加終濃度4 g/L甘氨酸，此后，根據(jù)ALA合成及甘氨酸消耗速度分別在適合時(shí)間點(diǎn)添加甘氨酸，以維持發(fā)酵罐中甘氨酸濃度在一定范圍內(nèi)。26 h菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，最大OD600達(dá)到136。誘導(dǎo)后由于需要先合成ALAS，因此24 h之前ALA合成速度較慢，平均速率只有0.22 g/（L·h）。24 h后進(jìn)入ALA快速合成期，合成速度明顯加快，ALA平均合成速率達(dá)0.52 g/（L·h）。至38 h達(dá)到發(fā)酵平臺(tái)期，最終在40 h時(shí)ALA產(chǎn)量達(dá)到最大值10.10 g/L。

圖5 5 L發(fā)酵罐中13032/pZWA1合成ALA發(fā)酵參數(shù)檢測

3 討論

本研究首先在C. glutamicum中利用穿梭載體pEC-XK99E過表達(dá)了來自R. palustris ATCC17001 HemA的編碼基因hemA，在C. glutamicum中建立了ALA的碳四合成途徑。載體拷貝數(shù)及啟動(dòng)子強(qiáng)度均與之前文獻(xiàn)中ALAS的表達(dá)強(qiáng)度相當(dāng)［18］，工程菌粗酶液中HemA比活力達(dá)到了37.86 U/mg，與Yang等［19］報(bào)道的來源于Rhodobacter capsulatus SB1003的ALAS比活力基本一致，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)提到的其他來源的ALAS，對于充分發(fā)揮其催化合成ALA合成的功能具有較大優(yōu)勢，也為后續(xù)構(gòu)建利用碳四途徑合成ALA的C. glutamicum高產(chǎn)菌提供了有利條件。

玉米漿營養(yǎng)豐富，含有大量可溶性的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸以及多種促進(jìn)微生物生長的微量元素［24］和生長因子，并且市場上玉米漿價(jià)格相對其他的有機(jī)氮源較便宜，故人們經(jīng)常選擇以玉米漿為氮源發(fā)酵合成代謝產(chǎn)物。但是玉米漿成分復(fù)雜并且保存過程中會(huì)大量滋生細(xì)菌和霉菌，導(dǎo)致其酸敗和變質(zhì)，此外玉米漿不均一、易沉淀，在生產(chǎn)上常常遇到滅菌不徹底的問題，所以在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基過程中盡量選擇成分穩(wěn)定且易保存的氮源。酵母粉含有氨基酸、肽類、維生素、生長因子、微量元素和礦物質(zhì)等含量豐富比例協(xié)調(diào)［25］并且易于保存成分穩(wěn)定，為微生物提供相對較全面的營養(yǎng)物質(zhì)，可以滿足菌株代謝需求，是微生物菌體培養(yǎng)基與產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng)基中優(yōu)質(zhì)的有機(jī)氮源，用于各種微生物發(fā)酵領(lǐng)域。本研究通過對玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基與酵母粉發(fā)酵培養(yǎng)基的比較也發(fā)現(xiàn)酵母粉發(fā)酵培養(yǎng)基的批次重復(fù)性更好，并且更適于C. glutamicum ALA生產(chǎn)菌的發(fā)酵。

利用碳四途徑合成ALA的前體物之一是甘氨酸。目前，通過微生物發(fā)酵合成ALA，甘氨酸主要還是通過外源添加，由于甘氨酸的濃度影響菌株的生長［26］，所以需要合理的控制培養(yǎng)基中甘氨酸的量，既不能影響菌體自身的生長，同時(shí)又要供給足夠的甘氨酸以滿足菌株合成ALA的需求。本研究結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了5個(gè)不同梯度的甘氨酸濃度進(jìn)行了優(yōu)化［26］，研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中甘氨酸濃度超過4 g/L會(huì)抑制菌株生長，同時(shí)ALA產(chǎn)量也會(huì)下降，這與Feng等［18］的報(bào)道研究結(jié)果稍有不同，文獻(xiàn)中提到培養(yǎng)基中添加甘氨酸就會(huì)影響菌體生長，甘氨酸濃度越高對菌株生長的影響越大，并且當(dāng)甘氨酸濃度超過7.5 g/L時(shí)，ALA產(chǎn)量會(huì)下降。結(jié)果差異較大可能與培養(yǎng)基成分和ALAS誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間以及菌株生長狀態(tài)不同有關(guān)。由于發(fā)酵過程中，甘氨酸是外源添加，增加了成本和工序的繁瑣，未來可以通過對甘氨酸合成途徑進(jìn)行分析改造，實(shí)現(xiàn)甘氨酸體內(nèi)自身供給。

接種量是影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酸的重要因素之一，它會(huì)直接影響發(fā)酵周期。一般情況下接種量少發(fā)酵過程中延遲期長，導(dǎo)致發(fā)酵成本增加，但初始接種量過大會(huì)影響菌體生長狀態(tài)和胞內(nèi)代謝，最終影響產(chǎn)物的產(chǎn)量［27］。本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種量超過7%時(shí)，雖然菌株生長差異不顯著，但是ALA產(chǎn)量下降，這可能是由于初始接種量大，菌株在進(jìn)入穩(wěn)定期之前就大量消耗了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)伴隨著菌株次級代謝物積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基環(huán)境惡劣，菌株的整體活性下降和代謝變?nèi)?，從而?dǎo)致產(chǎn)酸能力下降，最終ALA產(chǎn)量降低。本研究不同初始接種量與ALA產(chǎn)量變化趨勢與文獻(xiàn)報(bào)道的［28］實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

綜上所述，本研究通過對搖瓶發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的篩選以及誘導(dǎo)劑濃度、甘氨酸初始濃度和接種量的優(yōu)化，最終使得ALA產(chǎn)量達(dá)到3.28 g/L，相比優(yōu)化前提高了132.62%。在優(yōu)化建立的搖瓶發(fā)酵體系的基礎(chǔ)上，利用合適的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝在5 L發(fā)酵罐中通過補(bǔ)料發(fā)酵測試了工程菌13032/pZWA1合成ALA的能力，最終ALA產(chǎn)量達(dá)到了10.08 g/L，這是一步法合成ALA文獻(xiàn)報(bào)道最高產(chǎn)量。相比較兩步法發(fā)酵，一步法發(fā)酵在一個(gè)反應(yīng)體系中完成菌體的生長以及產(chǎn)物的合成，避免了兩步法發(fā)酵中菌體收集和更換培養(yǎng)體系等過程，周期短，工序簡單，有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，本研究建立的一步法發(fā)酵合成ALA的過程中底物甘氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了71.08%，高于兩步法的報(bào)道，進(jìn)一步說明菌株構(gòu)建與發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)合更有利于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的過量積累。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)工程菌在穩(wěn)定期ALA合成速度是對數(shù)期的2.32倍，這可能與HemA的表達(dá)有關(guān)。對數(shù)時(shí)期主要是菌株生長，進(jìn)入穩(wěn)定期后菌體內(nèi)HemA表達(dá)量增加，更有利于ALA合成。后續(xù)工作在工程菌株在代謝途徑優(yōu)化改造、關(guān)建酶的理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化表達(dá)以及系統(tǒng)生物學(xué)解析和應(yīng)用等方面還存在非常大的提升空間。隨著ALA生物合成技術(shù)不斷創(chuàng)新和發(fā)展，以C. glutamicum為宿主菌的ALA大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值，本研究為ALA的低成本大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在谷氨酸棒狀桿菌中建立了高效的ALA碳四合成途徑，并通過培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的優(yōu)化建立了相應(yīng)的搖瓶發(fā)酵體系，優(yōu)化后搖瓶中ALA的產(chǎn)量達(dá)到了3.28 g/L，5 L發(fā)酵罐中通過補(bǔ)料分批發(fā)酵ALA產(chǎn)量達(dá)到了10.08 g/L。

致謝：衷心感謝蒲偉老師和吳新陽老師在實(shí)驗(yàn)過程中提供的幫助，特別感謝鄭小梅老師對文章的修改提供寶貴意見。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of 5-aminolevulinic Acid Synthesis Pathway and Optimization of Fermentation by Corynebacterium glutamicum

RAO De-ming1，3ZHANG Liang-cheng1，3CHEN Jiu-zhou2，3SUN De-hu1，3SUN Cun-min2，3ZHENG Xiao-mei2，3ZHENG Ping2，3DIAO Ai-po1
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

5-aminolevulinic acid（ALA）is a natural non-protein amino acid and has been widely applied in agriculture and medicine. This study aimed to construct the systhesis pathway of C4 ALA in Corynebacterium glutamicum and optimize its fermentation process. First，efficient C4 ALA synthesis pathway was established in C. glutamicum by over-expressing the ALA synthase（ALAS）from Rhodopseudomonas palustris. Then，the ALA fermentation process with flask was optimized from four factors：fermentation medium，concentration of inducer，substrate concentration，and initial inoculum dosage. As results，the ALA yield of the strain 13032/pZWA1 over-expressing HemA was 1.41 g/L，up to 67.14 folds compared with the control strain. The optimal ALA fermentation condition was M9 media using yeast extract as nitrogen source with 5% inoculum size，0.1 mmol/L IPTG to induce the experession of HemA，and the concentration of glycine must be at 4 g/L. After optimization，ALA yield reached 3.28 g/L in a shaking flask and increased 132.62% than before. In conclusion，under the optimal fermentation condition，the ALA yield in a 5 L bioreactor fermentation was 10.08 g/L，which was the highest ALA yield by one-step fermentation of C. glutamicum reported so far.

5-aminolevulinic acid；Corynebacterium glutamicum；5-aminolevulinic acid synthetase；Rhodopseudomonas palustris ATCC17001；optimization of fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.017

2016-08-31

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZCZDSY04900）

饒德明，男，碩士研究生，研究方向：輕工技術(shù)與工程；E-mail：rdm1988@163.com

鄭平，女，博士，研究方向：細(xì)菌的代謝工程改造和系統(tǒng)生物學(xué)，E-mail：zheng_p@tib.cas.cn；刁愛坡，男，博士，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)，E-mail：diaoaipo@tust.edu.cn