劉賀 朱家慶 縱秋瑾 李炳志 元英進(jìn)（天津大學(xué)化工學(xué)院 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072）

生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程釀酒酵母的研究進(jìn)展

劉賀 朱家慶 縱秋瑾 李炳志 元英進(jìn)
（天津大學(xué)化工學(xué)院 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072）

石油、煤炭等非再生資源的供給日益緊張，人類迫切需要對可再生資源的利用進(jìn)一步開發(fā)。以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)纖維素乙醇具有原料可再生，成本低廉的顯著優(yōu)點(diǎn)。釀酒酵母菌株因其易于進(jìn)行基因操作，并具有較高的抑制劑耐受性，被廣泛用于發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇。釀酒酵母作為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程菌，在如何提升菌株對抑制劑的耐受性和木糖轉(zhuǎn)化效率等方面仍具有很大的挑戰(zhàn)。綜述了在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用上釀酒酵母工程化的研究進(jìn)展。

釀酒酵母；纖維素乙醇；抑制劑耐受；木糖利用；基因工程

隨著石油、煤炭等非可再生資源的逐漸枯竭，可再生能源的開發(fā)利用已經(jīng)成為人們迫切的需要。生物質(zhì)乙醇被廣泛認(rèn)為是潔凈、安全的可再生資源，是化石燃料的替代品［1］。商業(yè)化的生物質(zhì)乙醇主要是以蔗糖和淀粉為原料，但是將蔗糖和淀粉應(yīng)用于生物質(zhì)生產(chǎn)將會和人類食物產(chǎn)生競爭［2］。因此，基于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的纖維素乙醇因其原料的可再生和低成本的特點(diǎn)，成為眾多學(xué)者研究的對象。目前，微生物轉(zhuǎn)化利用生物質(zhì)主要存在兩個方面的難點(diǎn)：（1）由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的致密性和復(fù)雜性，必須對原料進(jìn)行預(yù)處理從而提高后續(xù)水解的效率和單糖的釋放。在預(yù)處理過程中高溫、高壓的化學(xué)條件會導(dǎo)致一系列有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，這些有毒物質(zhì)會對細(xì)胞的生長、代謝以及乙醇的產(chǎn)量產(chǎn)生明顯的抑制作用［3，4］。（2）木質(zhì)纖維素由半纖維素、纖維素和木質(zhì)素組成，其中木糖由半纖維素水解得到，約占木質(zhì)纖維素水解液中單糖含量的30%［5，6］，因而微生物需要具備能夠同時有效地轉(zhuǎn)化五碳糖、六碳糖為乙醇的能力［7］。

釀酒酵母作為傳統(tǒng)的生產(chǎn)乙醇的菌株，具有乙醇產(chǎn)率高、葡萄糖消耗速度快、魯棒性較高等優(yōu)點(diǎn)。近年來，研究者將細(xì)菌或真菌中的木糖代謝路徑導(dǎo)入釀酒酵母［8，9］，在增強(qiáng)酵母菌對抑制劑耐受性［10］上取得了一系列成就，本文將圍繞釀酒酵母在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用方面的工程化進(jìn)行闡述。

1 增強(qiáng)釀酒酵母抑制劑耐受性的研究進(jìn)展

隨著對細(xì)胞的耐受機(jī)理的解析，相關(guān)的基因改造策略和合理的基因線路已經(jīng)被成功設(shè)計來強(qiáng)化菌株對單一抑制劑的耐受性，傳統(tǒng)的隨機(jī)突變與篩選在強(qiáng)化釀酒酵母抑制劑耐受性方面發(fā)揮著重要的作用，同時對釀酒酵母的全局調(diào)控方面的研究也越來越深入。

1.1 精確基因工程改造

1.1.1 基因工程改造提高對糠醛的耐受性 抑制劑中的糠醛能夠誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，從而損傷細(xì)胞線粒體和液泡膜、肌動蛋白細(xì)胞骨架和和核染色質(zhì)等［11］。MSN2是釀酒酵母細(xì)胞中自我精細(xì)表達(dá)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，趙鮮仙等［12］通過構(gòu)建在ADH7啟動子控制下表達(dá)MSN2，增強(qiáng)了菌株對糠醛耐受能力，又避免了其持續(xù)高效表達(dá)帶來的副作用。谷胱甘肽可以改變由糠醛引起的過氧化狀態(tài)。Gorsich過表達(dá)谷胱甘肽合成路徑的基因 GSH1和GLR1 增強(qiáng)胞內(nèi)的谷胱甘肽水平或者外源添加谷胱甘肽只能提高細(xì)胞對糠醛的耐受能力［13］。

1.1.2 基因工程改造提高對乙酸的耐受性 水解液中的弱酸類抑制劑主要與解偶聯(lián)合細(xì)胞內(nèi)陰離子積累有關(guān)，細(xì)胞質(zhì)酸化抑制細(xì)胞內(nèi)代謝活動，細(xì)胞在膜上ATP 酶的協(xié)助下將H+泵出細(xì)胞，大量ATP的消耗導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)不足，對細(xì)胞的生長和眾多代謝過程產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的酸化［14］。目前的研究主要從降低乙酸的吸收，增強(qiáng)氫離子和乙酸離子的外排，以及增強(qiáng)乙酸在胞內(nèi)的代謝等方面著手。Tenreiro［15］過表達(dá)基因AZR1，該蛋白通過阻礙乙酸的吸收或者升高胞內(nèi)的pH值來增強(qiáng)細(xì)胞耐受乙酸的能力。在釀酒酵母中過表達(dá)基因ACS2，從而增強(qiáng)細(xì)胞以乙酸為前體合成乙酰輔酶A的能力，增強(qiáng)乙酸的代謝，增強(qiáng)了細(xì)胞在乙酸條件下的生長速率，縮短了延滯期的時間［16］。王昕［17］將γ-氨基丁酸反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC在釀酒酵母中表達(dá)，建立不依賴于 ATP的新的質(zhì)子泵。

1.1.3 基因工程改造提高對酚類物質(zhì)的耐受性 有研究指出酚類物質(zhì)可能作用于細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜的完整性以及線粒體膜的電化學(xué)梯度，從而影響細(xì)胞膜的選擇透過能力［18］。然而，由于酚類物質(zhì)種類繁多，對其毒性機(jī)制缺乏深入研究，因此通過基因改造提高釀酒酵母對酚類物質(zhì)耐受性的研究也相對較少。漆酶被證明可以有效降低水解液中多種酚類物質(zhì)的含量，提高后期的發(fā)酵效率［19］。Larsson等［20］將白腐真菌Trametes versicolor 中的漆酶基因在PGK1啟動子的控制下于釀酒酵母中異源表達(dá)，成功提高了釀酒酵母對酚類抑制劑松柏醛的耐受性。

1.2 隨機(jī)突變與篩選

由于細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，很多基因在細(xì)胞的中作用機(jī)制以及作用靶點(diǎn)尚未清楚，為了優(yōu)化功能模塊與細(xì)胞的適配性從而提高目標(biāo)性狀，目前很大程度上依賴于基因隨機(jī)突變策略。利用易錯PCR、紫外或化學(xué)誘變等方法構(gòu)建基因的隨機(jī)突變庫，結(jié)合壓力篩選，進(jìn)而定向篩選出理想的性狀。Alper［21］利用易錯PCR技術(shù)對釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄因子Spt15p進(jìn)行多輪改組突變修飾，篩選到的突變菌株spt15-300對乙醇的耐受性明顯提升。董健等［22］以AY12為出發(fā)菌株，進(jìn)行紫外突變獲得釀酒酵母突變?nèi)后w，再與釀酒酵母反復(fù)產(chǎn)孢與雜交篩選得到基因組重排最優(yōu)的菌株LYQ-F1。郭天琦等［23］對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ATCC 20618經(jīng)DES誘變后獲得耐高溫和抑制劑的乙醇菌株D24。

1.3 全局調(diào)控策略

由于生物體系的復(fù)雜性，尤其是壓力耐受性這一復(fù)雜性狀，單一的研究某一組分的變化無法詳細(xì)闡述與生物特定行為相關(guān)的內(nèi)外擾動因素，因此基于細(xì)胞生理狀態(tài)平衡的全局調(diào)控策略。ASK等［24］人通過過表達(dá)谷胱甘肽合成路徑相關(guān)基因 GSH1、CYS3和GLR1增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成，改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，從而增強(qiáng)了釀酒酵母在利用預(yù)處理的云杉木為原料進(jìn)行的同步糖化發(fā)酵過程中抗逆性。王昕［17］將源于耐輻射球菌的IrrE基因進(jìn)行密碼子序列優(yōu)化，在釀酒酵母中異源表達(dá)，通過易錯PCR篩選，得到耐受性能進(jìn)一步提升的酵母菌株。劉紅梅等［25］利用gTME方法構(gòu)建共發(fā)酵木糖和葡萄糖的重組釀酒酵母菌株，能夠很好的利用木糖和葡萄糖。

2 優(yōu)化釀酒酵母中木糖代謝途徑的進(jìn)展

釀酒酵母的木糖利用是纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的一個限制因素，木糖是木質(zhì)纖維素原料中含量次高的單糖，充分利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物木糖，能使乙醇產(chǎn)量提高25%左右［26］，對纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)有著重要的意義。然而，野生的釀酒酵母菌株不能利用木糖生產(chǎn)乙醇，因此，在現(xiàn)有的木糖利用釀酒酵母菌株中，引入自然界天然存在的外源木糖代謝路徑［27］，然而經(jīng)過改造后的釀酒酵母仍然存在因XR和XDH輔因子偏好性不同，造成副產(chǎn)物木糖醇積累，發(fā)酵效率低下的問題［27］。另外，釀酒酵母缺少特定的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，需依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，葡萄糖對木糖利用的抑制［28］。

2.1 改變輔因子偏好基因工程改造

釀酒酵母中木糖利用途徑XR-XDH中，因XR對輔因子NADPH的親和力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于NADH的親和力，而XHD以NAD+作為轉(zhuǎn)型輔酶，造成輔因子不平衡，導(dǎo)致木糖醇的積累，降低發(fā)酵效率［28］。通過對XR/XDH途徑中蛋白的輔因子偏好性進(jìn)行改造。主要策略是通過對XR/ADH進(jìn)行理性或者隨機(jī)的突變改變其輔因子偏好性或者引入外源的緩解輔因子不平衡的輔酶。Sadat等［27］通過對釀酒酵母中的XR進(jìn)行定點(diǎn)突變將其輔因子偏好性變成嚴(yán)格的NADPH使XDH的輔因子偏好性變成嚴(yán)格的NADP+，使木糖醇的積累減少34.4%-54.7%。Bro［28］通過引入NADP+依賴的甘油醛-3-磷酸脫氫酶［29］，Zhang引入水合NADP氧化酶來調(diào)節(jié)胞內(nèi)輔因子不平衡。

2.2 緩解葡萄糖對木糖的抑制作用的基因工程改造

在釀酒酵母中細(xì)胞對糖的代謝，跨膜運(yùn)輸是糖代謝途徑中的第一步。葡萄糖和木糖共發(fā)酵時，酵母因缺少專一性的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此在葡萄糖戊糖共發(fā)酵時，戊糖利用會被葡萄糖完全抑制，降低發(fā)酵效率［30］。研究主要集中在發(fā)現(xiàn)并獲得專一性高的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶，用來緩解或解除葡萄糖對于戊糖的抑制［31］。Subtil［32］揭示了在木糖與葡萄糖共發(fā)酵時，木糖的攝取是最大的限速步驟，因此通過過表達(dá)外源的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hxt7和Gal2可以緩解葡萄糖對于木糖的抑制作用。

2.3 基因組重排技術(shù)

基因組重排把傳統(tǒng)的突變和重組結(jié)合起來，一般通過循環(huán)重組的方法獲得目標(biāo)性狀提升的基因型，可以加速有益表型的積累［33］?；蚪M重排可以通過原生質(zhì)體融合和雜交進(jìn)行。雜合子菌株會繼承親本菌株木糖利用或耐受抑制劑的優(yōu)點(diǎn)。Inoue［34］和 Kim［35］在性狀相反的釀酒酵母菌株中導(dǎo)入XRXDH-XK基因通路，再通過雜交獲得木糖利用的雜合子細(xì)胞，雜合菌株在木糖利用上有很大提升，證實(shí)了釀酒酵母有性雜交是傳統(tǒng)但是有效的方法。曹萌等［36］利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Y5）和木糖發(fā)酵酵母（Pichia stipites CBS6054）為親本進(jìn)行滅火原生質(zhì)體融合，構(gòu)建出了發(fā)酵抑制劑的酵母菌株Y10-F.提升了菌株的耐受性。

3 釀酒酵母菌株過程強(qiáng)化

用于釀酒酵母菌株過程強(qiáng)化主要是進(jìn)化工程和優(yōu)化功能模塊與底盤細(xì)胞的適配性。目標(biāo)基因或外源模塊導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，在一定程度上使得菌株的特性有所增強(qiáng)，但要實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的最優(yōu)化，通常需要進(jìn)行功能模塊和底盤細(xì)胞間的適配性調(diào)節(jié)。Kim［37］通過過優(yōu)化GRE3和XYL2，XYL3的表達(dá)強(qiáng)度緩解在釀酒酵母在限氧條件下的氧化還原不平衡的問題。另外，常采用的一個適配策略是通過調(diào)節(jié)功能模塊中啟動子強(qiáng)度或者質(zhì)粒拷貝數(shù)控制目標(biāo)基因在細(xì)胞中的表達(dá)量，使得目標(biāo)基因?qū)τ诩?xì)胞來說處于一個適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)強(qiáng)度。Zhao等［38］對釀酒酵母細(xì)胞中常用的14個啟動子強(qiáng)度進(jìn)行了表征，同時釀酒酵母具有已商業(yè)化的不同拷貝數(shù)的載體質(zhì)粒，這些為調(diào)節(jié)基因在釀酒酵母中的表達(dá)強(qiáng)度提供了很好的理論依據(jù)。進(jìn)化工程是利用細(xì)胞自身的適應(yīng)進(jìn)化能力獲得目標(biāo)性狀，Narayanan［39］對TMB3500在低pH和纖維素水解液中經(jīng)過短期馴化，馴化后的菌株可以在有氧的條件下生長和無氧的條件下發(fā)酵，在pH3.7的條件下展現(xiàn)出了優(yōu)秀的脫毒機(jī)制［39］。

為了強(qiáng)化釀酒酵母菌株，通常會把理性設(shè)計和進(jìn)化工程結(jié)合起來。Zha等［40］設(shè)計、構(gòu)建了由木糖還原酶基因XYL1、木糖醇脫氫酶突變體基因mXYL2和木酮糖激酶基因XKS1構(gòu)成的木糖代謝模塊，初步獲得可以實(shí)現(xiàn)五六碳糖（主要是葡萄糖和木糖）共利用發(fā)酵的基因工程釀酒酵母。通過進(jìn)一步優(yōu)化XYL1和mXYL2的表達(dá)、強(qiáng)化非氧化磷酸戊糖途徑功能，優(yōu)化木糖代謝模塊和酵母底盤細(xì)胞間的適配性，進(jìn)一步獲得了木糖代謝速率達(dá)到0.260 g/L/h、乙醇得率為0.20 g/g的酵母菌株SyBE004。為了獲得更高效的五六碳糖共利用菌株，Zha等［41］在SyBE004的基礎(chǔ)上，基于傳代限氧培養(yǎng)的進(jìn)化工程改造，獲得了進(jìn)化菌株SyBE005。與SyBE004相比，SyBE005的木糖代謝速率和乙醇產(chǎn)率提高2.20倍、2.67倍，乙醇得率提高到0.33 g/g。

4 結(jié)語

隨著對細(xì)胞的耐受機(jī)理的解析，相關(guān)的基因改造策略和合理的基因線路已經(jīng)被成功設(shè)計來強(qiáng)化菌株對單一抑制劑（纖維素水解中的3種代表性抑制劑：糠醛、乙酸、苯酚）的耐受性。一般強(qiáng)化釀酒酵母對抑制劑的耐受性需要結(jié)合定向基因工程改造、隨機(jī)突變與進(jìn)化工程。但是針對單一抑制劑的基因工程改造，仍然存在很大的局限性。通過木糖利用途徑中改變輔因子偏好基因工程改造，可以在一定程度上強(qiáng)化釀酒酵母木糖利用能力，提高木糖利用效率。但是木糖/葡萄糖同步糖化共發(fā)酵，緩解葡萄糖對木糖利用抑制方面仍然是一個瓶頸問題。

工程菌株的性能提升一直是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究的核心內(nèi)容，理性設(shè)計構(gòu)建和隨機(jī)建庫篩選兩種策略將持續(xù)推進(jìn)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化菌株的性能提升。在理性設(shè)計構(gòu)建方面，隨著組學(xué)技術(shù)的提升和數(shù)據(jù)的積累，我們對菌株的代謝特征和耐受特性的理解越加深刻，可以不斷挖掘新的代謝瓶頸以提升代謝性能，獲得新的耐受靶點(diǎn)和通路，強(qiáng)化菌株的耐受能力。此外，將菌株的代謝能力提升和耐受能力強(qiáng)化進(jìn)行耦合也是一種非常有潛力的菌株性能提升策略。另外，隨著近年基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)基因組的多位點(diǎn)編輯，也為菌株的性能提升提供了新的可能。在隨機(jī)建庫篩選方面，新的基因組重排技術(shù)的出現(xiàn)，尤其是基于基因組合成的重排技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)更大范圍的菌株隨機(jī)建庫，補(bǔ)充組學(xué)技術(shù)無法挖掘到的工程菌基因型與表型之間的關(guān)系，進(jìn)一步推動菌株性能的提升。在工程強(qiáng)化方面，微流控技術(shù)的結(jié)合或?qū)⒃趥髻|(zhì)和反應(yīng)加速方面提升生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率，具有很好的前景。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Development of Engineered Saccharomyces cerevisiae for Biomass Conversion

LIU He ZHU Jia-qing ZONG Qiu-jin LI Bing-zhi YUAN Ying-jin
（Key Laboratory of Systems Bioengineering of Ministry of Education，Tianjin University，Tianjin 300072）

With the increasing demand of oil，coal and other nonrenewable resources，it is urgent to develop the use of renewable and eco-friendly energy resources. The production of cellulosic ethanol from biomass has the advantage that the raw material is renewable and the cost is low. Saccharomyces cerevisiae has been most widely used for biomass conversion，with the characters of being easy for genetic engineering operation and high inhibitor tolerance. The two major challenges during the process of S. cerevisiae used for biomass conversion are the utilization of xylose and inhibitor tolerance. The major emphasis of this review will be the development of engineering Saccharomyces cerevisiae to improve inhibitor tolerance and speed up the transformation of xylose utilization.

Saccharomyces cerevisiae；cellulose ethanol；inhibitor tolerance；xylose utilization；genetic engineering

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.018

2017-01-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21576198，21622605），天津市科技計劃項(xiàng)目（13RCGFSY19800）

劉賀，女，碩士研究生，研究方向：生物質(zhì)轉(zhuǎn)化；E-mail：liuhe@tju.edu.cn

李炳志，男，副教授，博士，研究方向：合成生物學(xué)，系統(tǒng)生物學(xué)，木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程；E-mail：bzli@tju.edu.cn