應(yīng)樂，潘越，王岳飛，徐平

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六堡茶多糖理化性質(zhì)、體外抗氧化及其對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用

應(yīng)樂，潘越，王岳飛，徐平*

浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江杭州 310058

以六堡茶為原料，利用水提醇沉法制得茶多糖粗品，經(jīng)脫蛋白純化后用30%、50%、70%的乙醇溶液進行分段，得到3種六堡茶多糖LTPS-30、LTPS-50和LTPS-70，并分析了其化學(xué)組成、分子量分布等理化性質(zhì)；以自由基清除法（ABTS）和鐵離子還原法（FRAP）評價其抗氧化活性；并以Na2S2O3損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為模型，探討了它們對HUVEC氧化損傷的保護作用。結(jié)果表明，3種六堡茶多糖樣品均為主要含有2個組分的非均一酸性多糖，平均分子量和總糖含量均為LTPS-70＜LTPS-50＜LTPS-30；而在蛋白質(zhì)和總酚含量及兩種抗氧化體系下的抗氧化活力均為LTPS-70＞LTPS-50＞LTPS-30，且LTPS-70表現(xiàn)出最強的細(xì)胞保護作用。說明茶多糖粗品經(jīng)70%乙醇純化后具有較強的生物活性，具有良好的應(yīng)用前景。

六堡茶；茶多糖；抗氧化活性；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞

茶多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖及其復(fù)合物，是茶葉中除茶多酚外的主要活性物質(zhì)。研究表明茶多糖具有多種生物活性[1]，如降血糖、預(yù)防糖尿病、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血壓、抗凝血、抗血栓、防治心血管疾病等[2]，是一種很有前景的天然產(chǎn)物[3]。目前有關(guān)茶多糖的研究中，關(guān)于其化學(xué)成分、分子量、單糖組成的報道較不一致，被認(rèn)為與提取茶多糖所用的茶葉原料與提取分離方法有關(guān)[3]。六堡茶是我國的歷史名茶，因原產(chǎn)于廣西梧州六堡鄉(xiāng)（現(xiàn)為六堡鎮(zhèn)）而得名[4]，為黑茶的一種，屬后發(fā)酵茶。六堡茶以梧州大葉毛茶為原料，經(jīng)潮水歸堆、渥堆發(fā)酵、干燥、蒸壓、晾置陳化等工序制成[5]，成茶品質(zhì)“紅、濃、陳、醇”，具有解膩消滯、清熱利濕、助消化等功能[6]。在民間陳年六堡茶常被用作防病治病的良藥。然而，目前有關(guān)六堡茶尤其是六堡茶多糖的內(nèi)容鮮有報道。

血管是組成人體的重要部分。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的功能障礙與多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，保護血管內(nèi)皮功能是防治相關(guān)疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。在進行血管內(nèi)皮細(xì)胞實驗時，通常選用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）作為體外的細(xì)胞模型，以研究血管功能與疾病，對疾病防治與藥物開發(fā)有著重要意義。Chen等[8]研究證明，綠茶多糖復(fù)合物對高糖造成的HUVEC損傷具有保護作用，認(rèn)為從低檔綠茶中提取制備得到的3種茶多糖復(fù)合物具有開發(fā)治療糖尿病血管并發(fā)癥的無毒副作用的藥劑的潛力。王岳飛等[9]以對Na2S2O3損傷的HUVEC的保護作用作為評價普洱茶提取物的指標(biāo)之一。Na2S2O3損傷模型能較好地模擬細(xì)胞缺氧狀態(tài)，便于分析研究細(xì)胞損傷后的恢復(fù)過程及藥物的保護作用[10]。目前，六堡茶多糖對HUVEC的保護作用尚未見報道。

茶多糖的分離提取方法目前主要有熱酚法、水提法、水提醇沉法、酶提法、微波提取和超臨界萃取法等[11-13]，而目前最常用的為水提醇沉法。多糖的純化工藝一般分為兩步，第一步是脫蛋白和脫色，一般通過Sevag法或者三氯乙酸來脫蛋白，通過離子交換法、金屬絡(luò)合法脫色；第二步是純化，常見的方法有沉淀分級分離法、季胺鹽沉淀法（CTAB）、超濾法、柱層析等[14]。

本文以六堡茶為原料，利用水提醇沉法制備六堡茶多糖，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（70%、50%、30%）分級提取六堡茶多糖，得到3種六堡茶多糖LTPS-70、LTPS-50和LTPS-30，對這3種六堡茶多糖的分子量分布、紅外光譜及化學(xué)成分組成進行分析；通過測定ABTS自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力，評價了3種六堡茶多糖的抗氧化活性；并以Na2S2O3損傷的HUVEC細(xì)胞為模型，初步探討了3種六堡茶多糖對HUVEC氧化損傷的保護作用，以期對醇溶分段所得的3種六堡茶多糖形成較為系統(tǒng)的評價，探討不同濃度乙醇溶解提取的茶多糖的生物活性，并為六堡茶的深度開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六堡茶散茶購自廣西梧州市純好茶業(yè)有限公司，為春季采摘生產(chǎn)的雙蒸型熟茶；透析袋（截留分子量為7?000?Da）；考馬斯亮藍(lán)G-250及牛血清蛋白購自上海國藥化學(xué)試劑有限公司；8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和半乳糖醛酸）、二叔丁基對甲酚（Butylated hydroxytoluene, BHT）、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）、2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulphonic acid) diammonium salt（ABTS）、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）及2,4,6-tripyridyl-s-triazine（TPTZ）均購自美國密蘇里州化工有限公司；葡聚糖購自美國Sigma公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、咔唑購自上海阿拉丁公司；一級色譜純乙腈、甲醇購自天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vascular endothelial cells, HUVEC）購自上海博谷生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；四甲基偶氮唑鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,4-diphenyltetrazolium bromide, MTT）購自凱基生物科技發(fā)展有限公司；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自杭州四季青試劑公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO生物技術(shù)公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

小寶XB-02多功能粉碎機；上海亞榮RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；GZX-9246MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；常州澳華HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋；德國CHRIST ALPHA 1-4LD plus冷凍干燥機；惠普8493紫外分光光度計；賽多利斯丹佛TP214電子天平；TGL-16M高速臺式冷凍離心機；美國Waters-515型高效液相色譜儀；美國Waters-2410示差折光檢測器；美國Thermo AVATAR370紅外光譜分析儀；日本島津高效液相色譜分析系統(tǒng)SPD20A、DGU、LC20AD；島津C18色譜柱（4.6?mm×250?mm，5?μm）；酶標(biāo)儀（Thermal Lab System, Finland）；日本Olympus倒置顯微鏡；Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱；超凈工作臺。

1.3 茶多糖的提取、純化與分段

取100?g六堡茶茶粉于錐形瓶中，加入1.0?L 80%乙醇溶液，靜置24?h。抽濾后，取其濾渣并干燥后，于80℃水浴鍋中熱水萃取（料水比1∶10，/）2次，每次1?h。合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的10%。向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，在4℃恒溫冰柜放置24?h，使多糖沉淀。在8?000?r·min-1、4℃條件下，多次離心收集沉淀。獲得的沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚交替洗滌，反復(fù)3次，風(fēng)干，即得到六堡茶多糖粗制品。將六堡茶多糖粗制品溶于80℃熱水中。采用Sevage法去除游離蛋白。脫蛋白后的多糖溶液利用截留分子量為7?000?Da的透析袋透析48?h，去除粗多糖溶液中的有機試劑和小分子的成分。將透析后的六堡茶多糖溶液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，于真空冷凍干燥機下干燥72?h，凍干成粉。將得到的茶多糖先用70%乙醇溶解，靜置后取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，并冷凍干燥得樣品LTPS-70，將剩余的茶多糖用50%的乙醇繼續(xù)溶解，取上清液同上步驟得樣品LTPS-50，再用30%的乙醇溶解剩余茶多糖，取上清液同上處理得樣品LTPS-30。

1.4 茶多糖主要生化成分含量測定

樣品中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，總酚含量采用福林酚法測定，總糖含量采用苯酚硫酸法測定，糖醛酸含量采用以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)的硫酸-咔唑法進行測定。分子量采用美國Waters 515型凝膠色譜儀系統(tǒng)，以HP高效凝膠色譜法分析，色譜條件為色譜柱：TOSOH BIOSEP G4000SWXL（7.8?mm× 300?mm），流動相為0.2?mol·L-1NaNO3溶液，流速0.8?mL·min-1，進樣量50?μL，柱溫40℃。檢測器為美國Waters 2410示差折光檢測器；標(biāo)樣為系列葡聚糖，平均分子量分別為413?000、76?900、43?500、10?500、5?000?Da。

單糖組成分析參考Lv等人[15]的方法，分別將20?mg干燥的LTPS-30、LTPS-50、LTPS-70粉末溶解于2?mL 3?mol·L-1三氟乙酸（TFA）中，充氮氣封管，沸水浴水解8?h；冷卻至室溫，1?000?r·min-1下離心5?min數(shù)次，取上清液，冷凍干燥；向凍干后的樣品中加入1?mL蒸餾水。單糖標(biāo)準(zhǔn)品制備：分別將各單糖標(biāo)準(zhǔn)品適量溶解于10%甲醇中，得到2.0?mmol·L-1的各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液；取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成混標(biāo)溶液。PMP衍生化：取1?mL樣品試液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入50?μL 0.3?mol·L-1NaOH和50?μL 0.5?mol·L-1PMP的甲醇溶液；搖勻，于70℃水浴中反應(yīng)60?min；冷卻至室溫用50?μL 0.3?mol·L-1HCl中和；混勻后用1?mL三氯甲烷萃取，棄去下層有機相，如此重復(fù)操作3次；過0.45?μm微孔濾膜，備用。HPLC色譜條件：島津C18色譜柱(4.6?mm×250?mm，5?μm)，檢測波長250?nm，流速0.8?mL·min-1，柱溫35℃，進樣量20?μL；流動相A：0.045% KH2PO4加0.05%三乙胺緩沖液（pH 7.0），流動相B：乙腈；梯度洗脫：0~5?min，20%~29% B；5~12?min，29% B；12~35?min，29%~70% B。紅外光譜分析采用紅外分光光度計在400~4?000?cm-1范圍內(nèi)進行掃描，觀察峰譜情況。

1.5 茶多糖體外抗氧化能力測定

1.5.1 ABTS自由基清除能力測定

將100?μL待測液加入3?mL的ABTS應(yīng)用液，充分混合，室溫下避光反應(yīng)6?min后，測定其在734?nm處的吸光度，記為A樣品。以100?μL樣品與3?mL蒸餾水的混合液作為空白組，測得吸光值記為A空白，以100?μL蒸餾水與3?mL ABTS應(yīng)用液的混合液為對照組，測得吸光值記為A對照。ABTS自由基清除能力= [1－（A樣品－A空白）/A對照]×100%。以BHT做陽性對照。

1.5.2 FRAP鐵離子還原能力測定

吸取0.5?mL系列濃度為25、100、150、200、400、500、800、1?000、1?500?μmol·L-1的FeSO4溶液與0.5?mL 10?mmol·L-1TPTZ的HCl溶液和5?mL 300?mmol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=3.6）混合，于593?nm下讀取吸光值。以FeSO4溶液的濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別將待測樣0.6?mL加入到4.5?mL FRAP工作液中，8?min后于593?nm處讀取吸光值A(chǔ)反應(yīng)后，0.6?mL蒸餾水與4.5?mL FRAP的混合液作為對照組，所測吸光值記為A反應(yīng)前。由A反應(yīng)后－A反應(yīng)前的差值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得抗氧化物質(zhì)相應(yīng)的FeSO4的濃度，定義為FRAP值。以BHT做陽性對照。

1.6 HUVEC損傷模型建立及細(xì)胞存活率測定

HUVEC用含10%胎牛血清、100?U·mL-1青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37%、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%含EDTA的胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×105個細(xì)胞，每孔100?μL，接種于96孔板，用于實驗研究。

損傷模型建立：細(xì)胞分空白組、對照組、Na2S2O3損傷組。空白組無細(xì)胞，加入100?μL培養(yǎng)液；對照組加入100?μL培養(yǎng)液；Na2S2O3損傷組加入100?μL不同濃度的Na2S2O3溶液，采用MTT法檢測細(xì)胞的存活率，確定Na2S2O3最佳損傷濃度。

樣品對Na2S2O3誘導(dǎo)的HUVEC的保護作用：樣品處理組先加入50?μL樣品，2?h后加入50?μL處理濃度的Na2S2O3溶液，以40?μg·mL-1的Na2S2O3誘導(dǎo)HUVEC受損。處理后的各組在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h，用MTT法檢測細(xì)胞的存活率。

MTT法檢測細(xì)胞存活率：HUVEC細(xì)胞用不同樣品處理24?h后，用PBS清洗1次，加50?μL的MTT后等待4?h，至藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚完全溶解，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150?μL DMSO，將96孔板置于微孔板振蕩器振蕩10?min，使結(jié)晶溶解，在490?nm下用酶標(biāo)儀檢測吸光值。

細(xì)胞存活率=[（OD樣品－OD空白）/（OD對照－OD空白）]×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每次實驗重復(fù)3次，取平均值，用JMP 10.0.0軟件Turkey HSD檢驗法對樣品多組間差異進行檢驗，兩組間比較采用檢驗。利用SPSS16.0分析皮爾森相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 六堡茶多糖主要化學(xué)成分

3種六堡茶多糖的總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸、總酚含量如表1所示。分段浸提的乙醇溶液濃度越低，溶液極性越大，因此3種樣品所含的主要生化成分也存在顯著差異。實驗結(jié)果顯示，LTPS-30的總糖含量顯著高于LTPS-50和LTPS-70，而3個樣品的蛋白質(zhì)含量變化趨勢恰好與總糖含量趨勢相反。測定結(jié)果顯示，LTPS-30、LTPS-50、LTPS-70的糖醛酸含量分別為29.65%、24.46%、27.71%，測量值之間存在顯著差異，但實驗結(jié)果并未表現(xiàn)出乙醇溶液的濃度對所溶解茶多糖的糖醛酸含量影響的規(guī)律性。LTPS-70的總酚含量為26.91%，顯著高于LTPS-30和LTPS-50的總酚含量。由此可見，較大極性的溶液可浸提出較多的總糖和糖醛酸，卻得到較少的蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)；極性較小的溶液可浸提出較多的酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，但卻得到較少的糖類物質(zhì)。

表1 六堡茶多糖樣品的主要化學(xué)成分含量

注：此表為同一列中數(shù)據(jù)的顯著性比較，字母相同表示無顯著性差異，字母不同表示有顯著性差異，<0.05。

Note: Data in the same row are compared by one way-ANOVA. The same letter indicates no significant difference and different letters indicate significant difference,<0.05.

2.2 分子量分布

經(jīng)GPC軟件處理，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對數(shù)（Log Mol Wt）對保留時間進行回歸，葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品校正曲線方程為Log Mol Wt=9.75e－3.70e-1T（T為保留時間），相關(guān)系數(shù)R為0.997。3種六堡茶多糖樣品分子量分布的分析結(jié)果如圖1和表2所示。這3個樣品均主要含有2個組分，為非均一多糖。LTPS-30的分子量為49.0?kDa（46.88%）和7.1?kDa（53.12%）；LTPS-50的分子量為42.2?kDa（27.04%）和6.9?kDa（72.96%）；LTPS-70的分子量為6.6?kDa（64.96%）和2.6?kDa（35.04%）；并且平均分子量LTPS-30>LTPS-50>LTPS-70。分子量分布情況顯示，隨著乙醇濃度的降低，溶解在其中的茶多糖的分子量增大。這可能與茶多糖的極性有關(guān)，茶多糖的單糖基越多，所帶羥基越多，其極性也越大，親水性更強，在醇中的溶解度越小，因而分子量大的多糖較分子量小的的多糖在乙醇中的溶解度小。因此改變乙醇的濃度，可以初步分離得到不同分子量的多糖。

表2 六堡茶多糖高效凝膠色譜結(jié)果

注：A：LTPS-30；B：LTPS-50；C：LTPS-70。Note: A: LTPS-30, B: LTPS-50, C: LTPS-70.

2.3 單糖組成分析

通過PMP柱前衍生化HPLC高效液相色譜法測定3種六堡茶多糖樣品的單糖組成（圖2）。3種六堡茶多糖樣品的單糖組成摩爾比見表3。結(jié)果表明，LTPS-30單糖組成以甘露糖、鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸為主；LTPS-50單糖組成以甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖為主；LTPS-70單糖組成以半乳糖和阿拉伯糖為主，LTPS-70樣品未檢測到甘露糖與半乳糖醛酸。該結(jié)果說明乙醇濃度越小，溶液極性越大，其單糖組成也發(fā)生變化。

2.4 紅外光譜分析

對3種六堡茶多糖進行紅外光譜分析，所得結(jié)果如圖3所示，LTPS-30、LTPS-50、LTPS-70的紅外光譜圖較為相似，說明它們的結(jié)構(gòu)骨架是基本一致的，只是其相對分子量、單糖組成及各成分含量可能不同。由圖可知，這3種六堡茶多糖在3?600~3?000?cm-1區(qū)間都出現(xiàn)一種O-H和N-H的伸縮振動寬峰，由于氫鍵的形成而使吸收峰變寬[16]。在2?930?cm-1附近都有一個相對較弱的吸收峰，為C-H的反對稱伸縮振動峰，是糖類的特征吸收峰[17]，1?400~1?200cm-1區(qū)間不太尖的吸收峰為C-H的變角振動。1?621~1?615?cm-1和1?445~1?417?cm-1處相對較強的吸收峰是羧基和羰基吸收峰[18]。1?200~1?000?cm-1間比較大的吸收峰是由兩種C-O鍵伸縮振動所引起的，一種為C-O-H，另一種是糖環(huán)的C-O-C[16]。

注：A：LTPS-30；B：LTPS-50；C：LTPS-70。Note: A: LTPS-30, B: LTPS-50, C: LTPS-70.

2.5 對ABTS自由基的清除能力

LTPS-30、LTPS-50、LTPS-70對ABTS自由基清除能力結(jié)果如圖4-A所示，3種茶多糖樣品的ABTS自由基清除率都隨著樣品濃度的升高而升高。根據(jù)曲線計算得到BHT、LTPS-30、LTPS-50、LTPS-70的IC50值分別為98.9、484.4、399.4、209.9?μg·mL-1。ABTS自由基清除能力按強度排序依次為BHT>LTPS-70>LTPS-50>LTPS-30。

2.6 對FRAP鐵離子的還原能力

LTPS-30、LTPS-50、LTPS-70對FRAP鐵離子還原能力結(jié)果如圖4-B所示，3種茶多糖樣品的FRAP鐵離子還原能力都隨著樣品濃度的升高而升高，且FRAP鐵離子還原能力強度排序依次為LTPS-70>LTPS-50>LTPS-30，這與對ABTS自由基的清除能力結(jié)果相似，另與陽性對照BHT進行比較，LTPS-70的FRAP鐵離子還原能力始終強于BHT，表明六堡茶多糖具有良好的鐵離子還原能力，具有較好的抗氧化作用。

2.7 HUVEC損傷模型建立

如圖5-A所示，本研究所用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）正常貼壁生長時，細(xì)胞緊密鑲嵌，呈“鋪路石樣”排列，為內(nèi)皮細(xì)胞的典型特征[19]。圖5-B為對照組正常細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶的圖。圖5-C為用40?μg·mL-1Na2S2O3損傷過的HUVEC的MTT染色結(jié)果。本研究使用Na2S2O3作為氧化劑建立HUVEC的氧化應(yīng)激損傷模型，用質(zhì)量濃度為1~500?μg·mL-1的Na2S2O3處理觀察細(xì)胞損傷情況，結(jié)果如圖6所示。Na2S2O3呈劑量依賴性地抑制了HUVEC的生長，細(xì)胞存活率隨著Na2S2O3處理濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)處理質(zhì)量濃度為40?μg·mL-1及更高時，這種損傷表現(xiàn)出顯著性。確定在探討六堡茶多糖對受損HUVEC保護作用時，以40?μg·mL-1的Na2S2O3誘導(dǎo)HUVEC損傷的發(fā)生。

2.8 六堡茶多糖對受損HUVEC的保護作用

用質(zhì)量濃度為6.25~400?μg·mL-1的3種樣品對40?μg·mL-Na2S2O3誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞的保護作用進行研究，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度在12.5~400?μg·mL-1區(qū)間范圍時，LTPS-70、LTPS-50、LTPS-30均呈劑量效應(yīng)地顯著提高HUVEC的存活率（<0.05或<0.01），其中LTPS-70對HUVEC存活率的提高均達(dá)到極顯著水平（<0.01）。比較同一處理濃度的3種六堡茶多糖對HUVEC的保護作用發(fā)現(xiàn)，LTPS-70在各處理濃度下對HUVEC存活率的提高均強于LTPS-50和LTPS-30，當(dāng)質(zhì)量濃度為12.5、25、50、400?μg·mL-1時，明顯強于LTPS-50與LTPS-30?？傊?2.5~400?μg·mL-1的LTPS-70、LTPS-50、LTPS-30均能明顯提高40?μg·mL-1Na2S2O3損傷HUVEC的細(xì)胞活力，且LTPS-70表現(xiàn)出最強的保護作用。

2.9 相關(guān)性分析

用皮爾森系數(shù)對多糖的理化性質(zhì)和其體外抗氧化性能（ABTS法和FRAP法兩種體系），以及體外對HUVEC的保護作用的相關(guān)性，用SPSS軟件進行皮爾森系數(shù)計算分析。結(jié)果（表4）顯示，樣品中的總糖含量與ABTS清除能力、FRAP還原能力、HUVEC保護作用均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0.878、－0.864和－0.714。樣品的總酚含量與其蛋白質(zhì)含量、ABTS清除能力、FRAP還原能力，以及對HUVEC保護作用呈極其顯著正相關(guān)（<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.844、0.965、0.959和0.922，其中總酚含量高低與其體外抗氧化性能和對HUVEC保護作用的相關(guān)系數(shù)均高于0.9，說明樣品中的酚類物質(zhì)是主要的生物活性成分。另在本實驗中，兩種抗氧化體系的相關(guān)性系數(shù)高達(dá)0.998，且呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性（<0.01），說明ABTS法和FARP法在評價本實驗樣品中具有等價效應(yīng)。而六堡茶多糖對HUVEC細(xì)胞的保護作用與樣品的抗氧化性能（ABTS法和FRAP法）也有著非常顯著的相關(guān)性（與ABTS法和FRAP法的相關(guān)系數(shù)分別為0.871和0.880）。

表4 皮爾森系數(shù)分析表

注：*：<0.05，**：<0.01。Note: *:<0.05, **<0.01.

3 總結(jié)與討論

茶多糖提取后通常會進行純化，使混合多糖純化為相對均一的組分。分步沉淀法是分離純化多糖較為常用的方法之一，基于多糖在低級醇或酮（常為乙醇或丙酮）中的溶解度不同而進行分離。與分子量小的多糖相比，分子量大的多糖在乙醇（或丙酮）中的溶解度小，因此多糖混合物的溶液中加大乙醇（或丙酮）的濃度可使分子量大的多糖先沉淀出來，而分子量相對小一些的多糖暫時留在溶液中，待乙醇（或丙酮）濃度進一步加大而以沉淀的形式析出[20]。本研究利用水提醇沉法制備得到六堡茶多糖，進而用70%、50%和30%的乙醇溶液依次對六堡茶多糖進行分離純化，以溶解于70%、50%和30%乙醇溶液的茶多糖組分作為本研究分離純化所得的3個樣品LTPS-70、LTPS-50與LTPS-30，其原理與分步沉淀法相同，但具有避免共沉淀發(fā)生，乙醇用量合適等優(yōu)勢，目前使用該方法分離純化多糖的研究較少。

茶多糖的分子量分布范圍廣，從幾千到幾百萬不等。多糖的相對分子質(zhì)量只代表相似鏈長的平均分布。本研究所得LTPS-70、LTPS-50、LTPS-30均為主要含有2個組分的非均一酸性多糖，且平均分子量LTPS-70＜LTPS-50＜LTPS-30，表現(xiàn)出隨著乙醇濃度越高，分離出的茶多糖分子量越小的規(guī)律。3種六堡茶多糖的理化性質(zhì)也存在差異，呈一定規(guī)律性。茶多糖的理化性質(zhì)和生物活性與其相對分子量、化學(xué)組成等有關(guān)[1]。有研究表明，茶多糖中總糖含量對其抗氧化活性沒有明顯的影響[21]。另外，本研究中3種六堡茶多糖樣品都檢出了酚類物質(zhì)。酚類物質(zhì)對茶多糖復(fù)合物來說也是非常重要的組成部分，可能會影響茶多糖的抗氧化活性[22]。有文獻(xiàn)表明，多糖的抗氧化活性與其相對分子質(zhì)量密切相關(guān)，茶多糖中低分子量的組分含量越高，其表現(xiàn)出的生物活性也越高[23]。

氧化應(yīng)激（Oxidative stress）是指機體或細(xì)胞內(nèi)以氧自由基為代表的氧化性物質(zhì)的產(chǎn)生與消除失衡，或外源性氧化物質(zhì)的過量攝入，導(dǎo)致氧化性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積進而可能引發(fā)氧化反應(yīng)的狀態(tài)。在以Na-2S2O3為代表建立的HUVEC的氧化應(yīng)激損傷模型中，LTPS-30、LTPS-50和LTPS-70對HUVEC的預(yù)處理在一定濃度范圍內(nèi)均可明顯提高受損HUVEC的存活率，并呈現(xiàn)濃度依賴性。3種六堡茶多糖對受損HUVEC的保護程度不同，其中，LTPS-70的保護作用最為明顯，這可能與它在三者中具有最強的抗氧化能力有關(guān)，但六堡茶多糖對氧化應(yīng)激損傷HUVEC保護作用的相關(guān)機理仍待進一步的深入研究。

六堡茶多糖經(jīng)過不同濃度乙醇溶解純化分離得到的3種組分表現(xiàn)出不同的分子量、化學(xué)組成、抗氧化活性，及對受損HUVEC的保護作用。LTPS-70為六堡茶多糖用70%乙醇溶液分離出來的組分，在本研究中其分子量最小，總糖含量最小，蛋白含量和總酚含量最高，表現(xiàn)出最強的抗氧化活性和對受損HUVEC的保護作用。茶多糖這類復(fù)雜的分子，具有多種藥理作用，但難以生物合成。以六堡茶或黑茶加工中產(chǎn)生的碎茶灰為原料，提取茶多糖，利用合理的手段可得到高純度的茶多糖，進行系統(tǒng)深入的藥理作用研究，應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品等行業(yè)，具有良好的前景。

[1] 謝明勇, 聶少平. 茶葉多糖的研究進展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2006, 25(2): 107-114.

[2] 周斌星, 孔令波, 陳軍賢. 普洱茶多糖的提取及降血糖的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2009, 25(15): 55-59.

[3] 徐仲溪, 王坤波. 茶多糖化學(xué)及生物活性的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2004, 24(2): 75-81.

[4] 陳小強, 葉陽, 成浩, 等. 六堡茶的理化分析研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2008, 24(7): 77-80.

[5] 劉小玲, 李穎, 姜元欣, 等. 廣西六堡茶主要特征成分分析[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2012, 30(1): 46-50.

[6] 吳平, 張宏, 樊春燕, 等. 《六堡茶》廣西地方標(biāo)準(zhǔn)的術(shù)語和定義介紹——兼談對《茶葉感官審評術(shù)語》標(biāo)準(zhǔn)修訂的建議[J]. 廣東茶業(yè), 2010(1): 46-49.

[7] 杜冠華. 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機制及保護藥物的研究[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2004, 24(3): 258-263.

[8] Chen X Q, Wang Y F, Wu Y L, et al. Green tea polysaccharide-conjugates protect human umbilical vein endothelial cells against impairments triggered by high glucose [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 49(1): 50-54.

[9] 王岳飛, 羅子華, 鄔新榮. 普洱茶提取物抗氧化及其對Na2S2O3誘導(dǎo)[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(6): 475-481.

[10] 武冰峰, 楊娟, 謝紅, 等. 黨參多糖對神經(jīng)干細(xì)胞硫代硫酸鈉損傷的保護作用[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2008, 19(2): 280-281.

[11] 崔宏春, 余繼忠, 黃海濤, 等. 茶多糖的提取及分離純化研究進展[J]. 茶葉, 2011, 37(2): 67-71.

[12] 任小盈, 李靜, 馬存強, 等. 茶多糖的提取與分離純化技術(shù)研究新進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(23): 993-7995, 7999.

[13] 鄭德勇, 楊江帆, 潘曉云, 等. 白茶多糖的提取與結(jié)構(gòu)初探[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(S1): 551-555.

[14] 楊泱, 劉仲華, 黃建安. 茶多糖的提取、分離、純化、組成研究概況[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2009(5): 47-49.

[15] Lv Y, Yang X, Zhao Y, et al. Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides fromby HPLC with indirect UV detection [J]. Food Chemistry, 2009, 112(3): 742-746.

[16] 張麗萍. 蘋果多糖的分離純化及其自由基消除活性與紅外光譜分析 [D]. 咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2007: 20-23.

[17] 謝亮亮, 蔡為榮, 張虹, 等. 茶多糖的分離純化及其抗凝血活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(9): 191-195.

[18] 陳浩. 普洱茶多糖降血糖及抗氧化作用研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2013: 35-40.

[19] 張競之, 陳利國, 賈會欣, 等. 黃芪多糖對高血壓病血瘀證患者血清損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)、活性的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2010(16): 170-173.

[20] 方積年, 丁侃. 天然藥物-多糖的主要生物活性及分離純化方法[J]. 中國天然藥物, 2007, 5(5): 338-347.

[21] Mao L, Shao S, Sun S, et al. Purification, physicochemical characterization, and bioactivities of polysaccharides from Puerh tea [J]. Journal of Food and Nutrition Research, 2014, 2(12): 1007-1014.

[22] Wang Y, Yang Z, Wei X. Antioxidant activities potential of tea polysaccharide fractions obtained by ultra filtration [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50(3): 558-564.

[23] Chen H, Qu Z, Fu L, et al. Physicochemical properties and antioxidant capacity of 3 polysaccharides from green tea, Oolong tea, and black tea [J]. Journal of Food Science, 2009, 74(6): C469-C474.

Physicochemical Properties,Antioxidant Activities and Protective Effects of Liubao Tea Polysaccharides on HUVEC

YING Le, PAN Yue, WANG Yuefei, XU Ping*

Department of Tea Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Tea Polysaccharides were extracted and purified from Liubao tea. Three fractions of polysaccharides namely LTPS-30, LTPS-50 and LTPS-70 were then obtained from Liubao Tea Polysaccharides (LTPS) by 30%, 50% and 70% ethanol respectively. The main chemical compounds and monosaccharide compositions of these LTPS were investigated. Theantioxidant activities of LTPS were determined by ABTS and FRAP assays. The potentially protective effects of LTPS on human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC) were investigated according to the Na2S2O3-induced model. The results showed that there were two main acidic polysaccharides in LTPS-70, LTPS-50 and LTPS-30. The order of molecular weight and total sugar content was LTPS-70＜LTPS-50＜LTPS-30. While the order of protein, polyphenol contents and antioxidant abilities determined by ABTS and FRAP assays showed the opposite trends. LTPS-70 exhibited the protective effects on HUVEC, indicating it might be applied in medical sciences in the future.

Liubao tea, tea polysaccharides (TPS), antioxidant activity, HUVEC

TS272.5+4；Q539

A

1000-369X(2017)01-025-13

2016-06-24

2016-09-26

應(yīng)樂，女，博士研究生，主要從事天然產(chǎn)物與人體健康及其機理研究。

zdxp@zju.edu.cn