賀 巍， 朱 琳， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 魏廷青

(解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧 810007；*通訊作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

急進高原胃動力紊亂大鼠胃電起搏區(qū)Cajal間質(zhì)細胞和縫隙連接蛋白43的表達

賀 巍*， 朱 琳， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 魏廷青

(解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧 810007；*通訊作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

目的 通過觀察急進高原大鼠胃動力紊亂發(fā)生過程中胃電起搏區(qū)Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cell of Cajal，ICC)與縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)的表達變化，探討其機制。 方法 30只SD大鼠以低海拔地區(qū)(海拔400 m)為對照組，并以進入高原地區(qū)(海拔4300 m)后的時間節(jié)點分為3 d和14 d組，每組10只。測定各組大鼠胃電活動數(shù)據(jù)，電子顯微鏡觀察胃電起搏區(qū)ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化，雙重免疫熒光組化法觀察同區(qū)域ICC與Cx43的表達變化。 結(jié)果 急進高原后大鼠胃電活動的明顯受損，波幅衰減尤以3 d顯著(P<0.05)，ICC的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷，縫隙連接變得明顯稀疏、松散。雙重免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cx43及ICC細胞的表達于高原3 d明顯減低(P<0.05)，正常生理功能受損。 結(jié)論 ICC細胞受損及其縫隙連接蛋白Cx43的表達異常導(dǎo)致平滑肌運動障礙，可能是胃動力紊亂發(fā)生的作用機制之一。

高原??； 胃動力； 胃電起搏區(qū)； Cajal間質(zhì)細胞； Cx43連接蛋白； 大鼠

急進高原胃腸動力紊亂是最常見的急性高原反應(yīng)之一，一般經(jīng)7-10 d的高原適應(yīng)期后可逐漸緩解或消失[1]，然而有關(guān)急進高原胃腸動力紊亂的發(fā)生機制目前尚不完全清楚。ICC細胞是廣泛分布胃腸道內(nèi)的特殊間質(zhì)細胞，它不但是胃腸基本電節(jié)律(basic electric rhythm)的起始點[2,3]，同時又在腸神經(jīng)系統(tǒng)及平滑肌間起著傳導(dǎo)信號的作用[4]，在胃腸動力調(diào)控中發(fā)揮重要作用。縫隙連接又稱為通訊連接(communication junction)，是細胞連接的一種方式，同樣是細胞間跨膜信號傳導(dǎo)的重要方式之一，而Cx43連接蛋白作為重要的連接蛋白之一，其大量存在于人、大鼠、小鼠、豬及犬的胃腸道壁中[5]，發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用。本研究將應(yīng)用免疫熒光雙標記的方法，通過標記ICC細胞和Cx43連接蛋白，觀察其表達分布變化，以探討急進高原胃動力紊亂的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

RM6280B生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，超低溫冰箱(-80 ℃)及超低溫切片機(美國NUAIR公司)，F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，TecnaiG2分析透射電鏡(美國FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(美國LifeSpan BioSciences公司)，小鼠抗大鼠單克隆抗體、驢抗兔FITC標記單克隆抗體、驢抗小鼠alexa fluor單克隆抗體均購自英國Abcom公司。

1.2 實驗動物與分組

6周齡雄性SD大鼠30只，SPF級，體重(200±20)g，許可證號：SCXK(陜)2012-003，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。以低海拔地區(qū)(西安，海拔400 m)為對照組，另以大鼠起運后3 d內(nèi)進駐實驗現(xiàn)場模擬急進高原狀態(tài)，并以進入高海拔地區(qū)(瑪多，海拔4 300 m)后的時間節(jié)為依據(jù)，依達到實驗地區(qū)后的時間順序，設(shè)置胃動力障礙觀測最明顯的3 d組[6]，恢復(fù)期的14 d組，每組10只大鼠。

1.3 胃電生理活動檢測

SD大鼠術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，在大鼠腹部正中切開，選擇胃電起搏區(qū)的胃體中部上1/3處漿膜層埋置引導(dǎo)電極[7]，測量胃電活動變化，參數(shù)設(shè)定為：生物電，500 mV，直流，30 Hz，記錄波形并分析。

1.4 實驗標本的采集與固定

電生理測定完成后，剪開胸腔，經(jīng)升主動脈插管，快速灌入生理鹽水沖洗血液，并沿胃大彎測剪開，于胃體中部上1/3處取0.2 cm×0.1 cm大小組織，3%戊二醛固定，用于電鏡染色，后繼續(xù)經(jīng)升主動脈先快后慢灌注冷的(4 ℃)4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH7.4)500 ml，注畢立即取全胃置于20%的蔗糖溶液中過夜沉底。

1.5 胃電起搏區(qū)ICC細胞微觀結(jié)構(gòu)觀察

取3%戊二醛固定組織用0.2 mol/L蔗糖磷酸緩沖液漂洗，用2%四氧化鋨后固定1 h，丙酮中梯度脫水，在1%醋酸雙氧鈾中停滯染色1 h，再通過環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂。1 mm切片用亞甲藍染色，在光鏡下觀察，確定黏膜層、環(huán)形肌層、縱行肌層，再次經(jīng)70 nm超薄切片后用酒精醋酸雙氧鈾、用檸檬酸鹽后染色，保留縱行肌層、環(huán)形肌層、黏膜下層、部分黏膜層，用透射電鏡觀察。

1.6 雙重免疫熒光化學(xué)法檢測ICC及Cx43表達

取固定后胃體中部上1/3處0.4 cm×0.2 cm組織用超低溫切片機切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS漂洗3次，置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗，進行免疫組織化學(xué)熒光染色(以c-kit抗體標記ICC細胞)：分別加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(1∶150)及小鼠抗大鼠單克隆Cx43抗體(1∶200)，室溫孵育24 h，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，分別加入熒光二抗，驢抗兔FITC標記單克隆抗體(1∶400)及驢抗小鼠alexa fluor 594單克隆抗體(1∶400)，避光室溫孵育2 h。經(jīng)0.01 mol/L PBS洗3次，80%甘油封片，以上過程均需避光操作。各組切片各取10張，在FV1000激光共聚焦顯微鏡下采用20倍及40倍視野觀察，觀察每張切片取6-8個視野，并將數(shù)字化圖像儲存。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 急進高海拔地區(qū)后大鼠胃電生理變化

急進高海拔地區(qū)后，大鼠胃電的波頻及波幅均受損明顯，3 d組與低海拔對照組比較顯著下降(P<0.05)，此后緩慢恢復(fù)，其中波頻恢復(fù)相對較快，14 d組時其波頻與低海拔對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而波幅恢復(fù)相對較慢，14 d組胃電波幅仍明顯低于低海拔對照組(P<0.05，見表1，圖1)。

組別波幅(mV)波頻(Hz)低海拔對照組1822．91±615．8249．55±0．92高海拔3d組178．77±26．39?#44．58±0．91?高海拔14d組511．13±107．95?49．81±0．35

與低海拔組比較，*P<0.05；與14 d組比較，#P<0.05

A.低海拔對照組;B高海拔3 d組;C 高海拔14 d組圖1 大鼠急進高原后胃電活動時程變化Figure 1 Effects of ascending to high altitude on gastric electrical activity in the rats

2.2 急進高原后大鼠胃電起搏區(qū)的ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化

低海拔地區(qū)對照組ICC在電鏡下觀察可見：細胞結(jié)構(gòu)完整，縫隙連接緊密，核周細胞質(zhì)充盈，細胞器數(shù)量較多，細胞內(nèi)部罕見空泡樣改變，無凋亡小體。急進高原地區(qū)后，3 d組時ICC細胞微觀結(jié)構(gòu)明顯受外界環(huán)境影響、受損，細胞縫隙連接變得明顯松散；細胞內(nèi)細胞器數(shù)量明顯減少，線粒體可見明顯空泡樣腫脹、變性，核周細胞質(zhì)空泡樣改變明顯，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；可見核固縮形成，核內(nèi)可見異染色質(zhì)，凋亡小體顯著增多(見圖2)。

圖2 大鼠急進高原后對胃電起搏區(qū)ICC細胞微觀結(jié)構(gòu)的影響Figure 2 Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the rats’ gastric pacing location

2.3 急進高原后大鼠胃電起搏區(qū)c-kit及Cx43的表達變化

在低海拔對照組ICC主要表達分布于環(huán)肌層與縱肌層及其交界部，黏膜下層也可見陽性細胞分布，即位于肌間、肌內(nèi)以及黏膜下層。急進高原后ICC主要表達分布仍位于肌間、肌內(nèi)以及黏膜下層，較低海拔組未見明顯變化，但3 d組和14 d組c-kit表達量均明顯下降(P<0.05)。Cx43的表達變化與ICC表達改變同步，3 d組和14 d組表達量與低海拔對照組相比均明顯下降(P<0.05，見表2，圖3)。

組別c?kitCx43c?kit/Cx43低海拔對照組44．01±4．5951．41±3．8961．41±3．89高海拔3d組30．70±3．62?#35．01±3．78?#45．06±3．56?#高海拔14d組36．16±3．58?41．08±4．58?50．43±4．48?

與低海拔對照組比較，*P<0.05；與14 d組比較，#P<0.05

3 討論

消化道平滑肌的蠕動特性與心臟節(jié)律類似，具有自發(fā)性、節(jié)律性的特點，它由慢波，即基本電節(jié)律控制。作為胃腸動力基本功能單位的重要組成部分，ICC細胞是慢波的起搏者和傳播者[8]，引起并調(diào)節(jié)胃腸平滑肌的自發(fā)性、節(jié)律性的機械活動，在此過程中ICC細胞居于核心地位，發(fā)揮關(guān)鍵性作用，已有研究證實大量胃腸道疾病與ICC細胞的功能異常密切相關(guān)[9-11]。Cx43連接蛋白作為一種主要的縫隙連接蛋白，與機體多種病理生理過程密切聯(lián)系，其表達下降或缺失與多種疾病相關(guān)，如：心律失常、胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移、功能性消化不良等[12-14]。尤其有研究表明ICC與胃腸道神經(jīng)元之間、與消化道平滑肌之間以及ICC細胞之間存在大量由緊密并置的質(zhì)膜形成的縫隙連接，腸神經(jīng)系統(tǒng)的信號可以通過腸神經(jīng)系統(tǒng)-ICC-消化道平滑肌形成的網(wǎng)絡(luò)體系之間的縫隙連接蛋白Cx43，將信號由腸神經(jīng)通過ICC傳遞到平滑肌，進而調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運動[15-17]。

本實驗結(jié)果表明，急進高原后，伴隨大鼠胃電活動的明顯受損，特別是其波幅衰減尤為顯著(P<0.05)，ICC的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷，尤其是縫隙連接變得明顯稀疏、松散，提示ICC細胞間及其與平滑肌細胞之間的跨膜信號傳導(dǎo)基礎(chǔ)受到損傷。雙重免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，ICC細胞的表達也同樣于高海拔地區(qū)3 d組明顯減低(P<0.05)，表明其正常生理功能同樣受損。Cx43表達變化則與ICC表達改變同步，在高海拔3 d組明顯減低(P<0.05)，激光共聚焦顯微鏡下可見其表達于ICC細胞的胞體及突起上的部分減低明顯，可能妨礙細胞之間物質(zhì)信號的傳遞，尤其是ICC細胞之間及其與平滑肌之間的信號傳遞，進而引起胃蠕動功能異常?？梢娂边M高原后，作為胃腸電起始者及傳播者的ICC細胞本身發(fā)生損傷性改變，同時作為信號傳播通道的Cx43縫隙連接蛋白也發(fā)生功能變化，即胃腸電生理信號的起始、傳播的中轉(zhuǎn)站及傳播通道均發(fā)生損傷性改變，導(dǎo)致正常的電生理信號無法順利產(chǎn)生并傳遞至消化道平滑肌，進一步導(dǎo)致胃動力紊亂的發(fā)生，可能是急進高原胃動力紊亂形成的重要機制之一。

從上往下分別為低海拔對照組、高海拔3 d組、高海拔14 d組；從左往右分別為c-kit,Cx43,c-kit/Cx43表達圖3 大鼠急進高原后對胃電起搏區(qū)c-kit及Cx43表達影響 (bar=200 μm)Figure 3 Expression of ICC and Cx43 in rats’ gastric pacing location after ascending to high altitude (bar=200 μm)

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Expression of interstitial cell of Cajal and Connexin43 in gastric electrical pacing region of rats after ascending to high altitude

HE Wei*, ZHU Lin, FAN Xing’ai, YANG Shengyue, LIU Ruinian, WEI Tingqing

(DepartmentofGastroenterology,FourthHospitalofPLA,Xining810007,China;*Correspondingauthor,E-mail:hewei.1971@163.com)

ObjectiveTo investigate the gastric pacing interstitial cells of Cajal(interstitial cell of Cajal,ICC)and Connexin43( Cx43) expression in rats after ascending to high altitude, and to explore its mechanism.MethodsThirty SD male rats were divided into three groups(n=10 in each group):low altitude group (Xi’an, 400 m), high altitude(4 300 m) 3 d, 14 d groups. The rats’ gastric electrical activity was measured in different groups. Electron microscope was applied to observe0 the physiological ultrastructure of ICC cells, and the immunofluorescence staining was used to observe the expression of ICC cells and Cx43 in gastric electrical pacing region.ResultsThe amplitude and frequency of gastric electrical activity of rats were the lowest in high altitude 3 d group(P<0.05). The gap junctions and organelles of ICC cells were reduced in high altitude 3 d group, and the apoptotic bodies were observed by electron microscope. The expression of ICC cells and Cx43 was also the lowest in high altitude 3 d group(P<0.05).ConclusionThe damages of ICCs,Cx43 abnormal expression, and the destruction of the gap junction may induce the dysfunctions of intercellular substance exchange and signal transmission,which might partly be responsible for the pathogenesis of gastric motility disorders in high altitude-exposed rats.

mountain sickness； gastric motility； gastric electrical pacing region; interstitial cell of Cajal; Cx43； rat

青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計劃資助項目(2013-Z-760)

賀巍，男，1971-10生，碩士，主任醫(yī)師， E-mail:hewei.1971@163.com

2016-11-04

594.3

A

1007-6611(2017)01-0022-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.005