郭明里 普俊學(xué) 李 寧 張建文 楊兆祥

1.大理大學(xué)，云南 大理 671000；2.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100

磷鉬鎢酸-干酪素法測(cè)定肉桂提取物中鞣質(zhì)的含量

郭明里1,2普俊學(xué)2*李 寧2張建文2楊兆祥2

1.大理大學(xué)，云南 大理 671000；2.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100

目的：建立肉桂提取物中總鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法。方法：采用磷鉬鎢酸-干酪素比色法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)建立分析方法，對(duì)3批肉桂提取物進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：最優(yōu)參數(shù)為：干酪素加入量400 mg，Na2CO3濃度20%，顯色后30min測(cè)定。沒(méi)食子酸在0.0020～0.0120 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2=0.9997。3批肉桂提取物鞣質(zhì)含量分別為25.58%、28.42%、29.10%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單、靈敏、穩(wěn)定，為肉桂提取物的質(zhì)量控制提供了有效的方法。

肉桂；鞣質(zhì)；含量測(cè)定；質(zhì)量控制

肉桂為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥樹(shù)皮，具有補(bǔ)火助陽(yáng)，引火歸元，散寒止痛，溫通經(jīng)脈的功能[1],是我國(guó)歷史悠久的一種常用的中藥，也是世界流行的香料之一。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂中含有揮發(fā)油、多糖類、多酚類、香豆素及無(wú)機(jī)元素等化學(xué)成分。肉桂，具有抗胃潰瘍、抗炎、抗菌、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病以及鎮(zhèn)靜、解痙、解熱及缺血性腦卒中[2-3]等藥理作用活性。

鞣質(zhì)(tannins，又稱單寧、丹寧)是存在于植物體內(nèi)的一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多酚類化合物[4-5]，具有收斂性，內(nèi)服可用于治療胃腸道出血、潰瘍和水瀉等癥，外用于創(chuàng)傷、灼傷，局部止血[6]。現(xiàn)代研究表明，鞣質(zhì)有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抑菌、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等多方面的生物活性[7-8]。鞣質(zhì)是肉桂重要的化學(xué)成分和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。目前，針對(duì)肉桂及其提取物的質(zhì)量研究多集中于揮發(fā)性成分[10]及香豆素[11]的控制，鮮有針對(duì)鞣質(zhì)類成分的報(bào)道。

本研究以2015年版中國(guó)藥典[12]規(guī)定的鞣質(zhì)含量測(cè)定法為基礎(chǔ),采用磷鉬鎢酸-干酪素比色法建立肉桂提取物中鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法。此方法利用多酚在堿性溶液中將磷鉬鎢酸還原，產(chǎn)生深藍(lán)色，其吸光度與含量成正比，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，采用比色法測(cè)定。鞣質(zhì)可與干酪素結(jié)合產(chǎn)生沉淀，因此分別測(cè)定總多酚和不被干酪素吸附多酚的含量，二者之差即為鞣質(zhì)的含量[13]。本研究針對(duì)肉桂提取物的特點(diǎn)，對(duì)藥典方法的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，方法更為簡(jiǎn)單、靈敏、穩(wěn)定。本研究豐富了肉桂及其提取物的化學(xué)成分和質(zhì)量研究，為其進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)和綜合利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器 UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；5510E-DTH超聲儀(美國(guó)必能信公司)；Milli-Q超純水機(jī)(Millipore公司)；SW22恒溫震蕩儀(美國(guó)優(yōu)萊博公司)；CP225D電子分析天平(賽多利斯公司)。

1.2 試藥材料 鎢酸鈉(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)、鉬酸鈉(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)、硫酸鋰(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、碳酸鈉(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、鹽酸(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、磷酸(分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司)；干酪素(BR，上海麥克林生化科技有限公司)。沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)：140318，含量≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：140318)；肉桂提取物(昆藥集團(tuán)股份有限公司自制，批號(hào)：20150626，20151201，20160425，昆藥集團(tuán)股份有限公司)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 磷鉬鎢酸溶液的制備 取鎢酸鈉100g、鉬酸鈉25g，置1000mL的圓底燒瓶中，加水700mL使溶解，加鹽酸100mL、磷酸50mL，加熱回流10h，放冷，再加硫酸鋰150g、水50mL和溴0.2mL，煮沸除去殘留的溴(約15min)，冷卻，加水稀釋至1000mL，濾過(guò)，即得。避光保存，且本液不得顯綠色。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取沒(méi)食子酸50mg置100mL容量瓶中，加水至刻度，精密量取5mL溶液置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得(C=0.05mg/mL)。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密稱取60mg肉桂提取物置250mL容量瓶，加150mL水溶解，超聲10min，放冷，用水稀釋至250mL，搖勻，靜置，過(guò)濾，棄去初濾液50mL。精密量取20mL續(xù)濾液置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。

2.2 含量測(cè)定條件的考察與優(yōu)化

2.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的考察 精密移取對(duì)照品溶液和樣品溶液各2mL置25mL容量瓶中，加1mL磷鉬鎢酸溶液，加10mL水，再用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，反應(yīng)30min，以相應(yīng)試劑為空白，在400～900nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，兩者都在760nm處有最大吸收峰，故選擇760nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 碳酸鈉溶液濃度的考察 精密量取對(duì)照品溶液和樣品溶液各2mL置25mL容量瓶中,加1mL磷鉬鎢酸溶液，加10mL水，分別以1%、5%、10%、15%、20%、25%、29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，反應(yīng)30min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760nm處測(cè)吸光度。結(jié)果隨著碳酸鈉溶液的濃度增大，吸光值也隨著增大，在濃度為20%時(shí)，吸光值最大，之后吸光值就緩慢下降，且碳酸鈉溶液濃度越大，越容易結(jié)晶。故選擇碳酸鈉溶液的濃度為20%。

2.2.3 碳酸鈉溶液加入體積的考察 分別精密量取2mL對(duì)照品溶液置25mL容量瓶，各加1mL磷鉬鎢酸，分別加水18mL、14mL、10mL、6mL、4mL、2mL，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度(分別加入4mL、8mL、12mL、16mL、18mL、20mL碳酸鈉溶液)，反應(yīng)30min，以相應(yīng)的試劑為空白，分別測(cè)吸光度。在加10mL水時(shí)(相當(dāng)于所加碳酸鈉體積為12mL)，測(cè)得的吸光度值最大。故選擇加入碳酸鈉溶液體積為12mL。

2.2.4 干酪素用量的考察 為評(píng)價(jià)鞣質(zhì)沉淀的效率，本研究對(duì)干酪素用量(200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，加入400mg干酪素時(shí)鞣質(zhì)的含量最大,故選擇干酪素的用量為400mg。詳見(jiàn)表1。

表1 干酪素不同用量對(duì)鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的影響

2.2.5 測(cè)定時(shí)間的考察 精密量取2mL對(duì)照品溶液置25mL容量瓶中，加1mL磷鉬鎢酸溶液，加水10mL，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，分別在5min、15min、25min、30min、35min、40min、50min、60min內(nèi)測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，25min內(nèi)測(cè)得的吸光度變化較大，25～35min之間測(cè)得的吸光值較穩(wěn)定，35min后吸光度逐漸降低。故選擇在25～35min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液 1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL，分別置25mL棕色量瓶中,各加入磷鉬鎢酸溶液1mL,再分別加水11mL、10mL、9mL、8mL、7mL、6mL，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻,放置30min，以相應(yīng)的試劑為空白,在760nm處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：y=101.17x-0.1296，R2=0.9997。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸對(duì)照品在0.0020～0.0120mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取2mL對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法，自“加入磷鉬鎢酸溶液1mL”起，加水10mL，依法處理樣品，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果RSD=0.12%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取肉桂提取物6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法，自“加入磷鉬鎢酸溶液1mL”起, 加水10mL,依法測(cè)定吸光度，計(jì)算肉桂提取物中鞣質(zhì)的平均含量為28.30%，RSD為0.53%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取2mL樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，自“加入磷鉬鎢酸溶液1mL”起，加水10mL，分別在顯色后的15min、25min、30min、35min、40min、50min、60min處測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，隨著顯示時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)得的吸光度下降，在15～35min內(nèi)吸光度的RSD為0.97%。因此供試品溶液顯示后35min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 樣品的含量測(cè)定

2.5.1 總酚 精密量取供試品溶液2mL,置25mL棕色量瓶中,按“2.3”項(xiàng)下方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL,并測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出樣品中總酚的質(zhì)量。

2.5.2 不被吸附的多酚 精密量取供試品溶液25mL,加入已盛有干酪素400mg的100mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，平行用水做一份干酪素空白實(shí)驗(yàn)。精密量取續(xù)濾液2mL，置25mL棕色量瓶中,，按“2.3”項(xiàng)下方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，并測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出樣品中不被吸附的多酚的質(zhì)量。

2.5.3 樣品中鞣質(zhì)的含量測(cè)定 鞣質(zhì)含量(%)=(總酚量-不被吸附的多酚量)的濃度差×5×25×12.5/藥材質(zhì)量×100%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品的測(cè)定結(jié)果

3 討論

鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法較多，如皮粉法、絡(luò)合滴定法、干酪素法、高錳酸鉀法等。其中，皮粉法是國(guó)際公認(rèn)的鞣質(zhì)含量測(cè)定方法,但耗用樣品多,測(cè)定時(shí)間長(zhǎng),而且沒(méi)有選擇性。而干酪素法可以選擇性的吸附有活性的鞣質(zhì)，干酪素法選擇性比皮粉法要高[14]，且現(xiàn)行中國(guó)藥典采用了干酪素法，故選擇干酪素法。本研究針對(duì)肉桂提取物的特點(diǎn)，對(duì)藥典方法的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，特別是干酪素加入量、碳酸鈉濃度、顯示時(shí)間進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，方法更為簡(jiǎn)單、靈敏、穩(wěn)定。

鞣質(zhì)的含量測(cè)定中顯示劑較多，常用的有氯化鐵、氯化鐵-1,10 二氮雜菲、磷鉬鎢酸等,但磷鉬鎢酸比其他幾種顯示劑顯色的顏色更深,靈敏度更高[13]。磷鉬鎢酸法的原理：在堿性溶液中，酚類化合物可以將磷鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與酚含量呈正相關(guān)，在約760nm波長(zhǎng)處有最大吸收[15]。磷鉬鎢酸的顏色對(duì)鞣質(zhì)的含量測(cè)定影響較大，因此磷鉬鎢酸需密封、避光保存，且不得顯綠色。

有文獻(xiàn)報(bào)道沒(méi)食子酸不能被干酪素吸附[16-17]，在進(jìn)行加樣回收率考察時(shí)，加入的沒(méi)食子酸經(jīng)干酪素吸附后仍存在于溶液中，不能達(dá)到完全吸附，無(wú)法考察總鞣質(zhì)含量回收率，因此本實(shí)驗(yàn)未做加樣回收率試驗(yàn)。

本研究利用建立的分析方法對(duì)3批肉桂提取物進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,肉桂提取物常溫放置的時(shí)間越久，測(cè)得的鞣質(zhì)含量越低，這可能與鞣質(zhì)不穩(wěn)定的性質(zhì)有關(guān)。因此肉桂提取物不要長(zhǎng)時(shí)間放置，需低溫保存。

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Determination of Tannins in Cinnamon Extracts by Phosphomolybdium Tungstic Acid-casein Colorimetric Analysis

GUO Mingli1,2PU Junxue2*LI Ning2ZHANG Jianwen2YANG Zhaoxiang2

1.Dali University, Dali 671000,China;2.Kunming Pharmaceutical Corporation, Kunming 650100,China

Objective To establish a method for the determination of total tannins in cinnamon extracts.Methods The phosphomolybdium tungstic acid-casein colorimetric method was employed, analytical parameters were optimized and the method was applied to the analysis of 3 batches of samples.Results The optimal parameters were as follows: adding amount of casein: 400mg, concentration of Na2CO3solution: 20%, determination time point: 30 minutes after coloration reaction.Gallic acid was used as the standard compound.The linearity range was 0.0020～0.0120 mg/L, showing good linearity (R2=0.9997).The contents of total tannins in 3 batches of cinnamon extracts was 25.58%, 28.42%, 29.10%, respectively.Conclusion The method was proved simple, sensitive and reproducible, providing an effective tool for the quality control of cinnamon extracts.

Cinnamomum Cassia; Tannins; Content Determination; Quality Control

云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016HC010)。

郭明里(1991-)，女，哈尼族，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樗帉W(xué)與化學(xué)學(xué)院藥物分析。E-mail：gml53252811473272@163.com

普俊學(xué)(1971-)，男，彝族，本科高級(jí)工程師，研究方向?yàn)閯?chuàng)新藥物的研究與開(kāi)發(fā)。E-mail:junxue.pu@houey.cn

R284

A

1007-8517(2017)03-0045-03

2016-12-25 編輯：穆麗華)