汪程　汪令偉　王林

摘要：目的 通過在體和離體實(shí)驗(yàn)研究殼聚糖納米粒在氣道粘膜的粘附性。方法 通過霧化吸入和灌洗的方式將熒光標(biāo)記的殼聚糖納米粒作用于氣管、支氣管和肺組織上。在激光共聚焦顯微鏡下觀察殼聚糖納米粒的粘附情況并考察其在氣道粘膜上的滯留時(shí)間。結(jié)果 殼聚糖納米粒組和載胰島素殼聚糖組在氣管、支氣管及肺組織上的熒光強(qiáng)度比較無明顯差異，P>0.05；胰島素組與其他兩組的熒光強(qiáng)度相比有明顯差異，P<0.05。殼聚糖納米粒在霧化后30 min、2 h、5 h、8 h通過激光共聚焦顯微鏡可見氣管、支氣管、肺組織均有熒光顯示。結(jié)論 殼聚糖納米粒與氣道粘膜具有粘附性；其在氣道粘膜上的滯留時(shí)間可以達(dá)到8 h以上。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；納米粒；氣道粘膜；粘附性

肺部吸入給藥是將藥物直接傳遞到肺部、產(chǎn)生局部或全身治療作用的給藥方法。具有將藥物直接在肺部起效、并能使肺部疾病的藥物劑量降低及減小藥物的副作用的優(yōu)點(diǎn)[1]。但是肺部是機(jī)體呼吸場(chǎng)所，外界的異物主要依靠粘液纖毛機(jī)制來清除，尤其是不溶性微粒[2]，這是影響肺部給藥的關(guān)鍵因素。殼聚糖納米粒將生物粘附性和藥物緩釋特性集于一體，使其在定位、緩釋、提高生物利用度等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[3]。殼聚糖納米粒作為藥物載體在口腔、胃腸道等部位的應(yīng)用已經(jīng)得到了廣泛的研究，然而在與呼吸道粘膜粘附性的研究方面，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道較少。本研究以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用殼聚糖納米粒生物學(xué)特性，研究殼聚糖納米粒與呼吸道粘膜的粘附性，觀察比較殼聚糖納米粒在氣管、支氣管及肺組織的粘附性情況，為殼聚糖納米粒作為藥物載體肺部給藥及作用于肺內(nèi)局部疾病的治療提供理論依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 同系交配純種白色新西蘭大白兔 大連大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及儀器 殼聚糖（CS）購(gòu)自阿拉?。划惲蚯杷釤晒馑兀‵ITC）、N-羥基琥珀酰亞胺、2，3-環(huán)氧-1-丙醇購(gòu)于Sigma公司；磁力攪拌油?。ㄉ虾Ｔ奖妰x器）；高速離心機(jī)（日立）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康）；超聲波霧化器（鞍山電子醫(yī)療器械廠）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)）。

1.3方法

1.3.1殼聚糖納米粒的制備及熒光標(biāo)記

1.3.1.1殼聚糖的疏水改性 取純化后的殼聚糖，分散于200ml超純水，滴加冰乙酸使殼聚糖完全溶解，置入60℃水浴預(yù)熱。取DCA、EDC·HCl和NHS于150 ml燒杯、加入100 ml無水DMSO，反應(yīng)30 min，加到60℃并反應(yīng)24 h。取出反應(yīng)完畢的殼聚糖溶液，加入一定量的無水甲醇，用濃氨水調(diào)pH至中性，迅速將懸液于8000 rpm離心10 min收集沉淀，最后于烘箱中烘干，最終得到淡黃色粉末狀疏水殼聚糖。

1.3.1.2疏水殼聚糖的親水改性 將疏水改性后的殼聚糖樣品，分散于超純水，滴加冰乙酸使殼聚糖溶解，60℃水浴預(yù)熱，逐滴加入環(huán)氧丙醇，攪拌反應(yīng)24 h。用4M NaOH溶液調(diào)pH至8左右，于8000 rpm下離心10 min，然后將上清液置入8 K～14 K透析袋中對(duì)大量去離子水透析48 h。最后將樣品冷凍干燥，最終得到白色棉絮狀的兩親性殼聚糖。

1.3.1.3兩親性殼聚糖的熒光標(biāo)記 取兩親性殼聚糖超純水，加入NaHCO3和Na2CO3粉末得0.25M碳酸鹽緩沖體系，最終pH=9.5。精確稱取5 mg FITC溶于5 ml甲醇后在攪拌下逐滴緩慢加入兩親殼聚糖溶液中，避光反應(yīng)12 h。收集反應(yīng)液置入8 K～14 K透析袋對(duì)大量去離子水透析48 h，最終冷凍干燥得到橙黃色FITC標(biāo)記的兩親性殼聚糖。

1.3.1.4熒光納米粒懸液的制備 取一定質(zhì)量的FITC標(biāo)記兩親性殼聚糖，溶解于超純水，在冰浴中用探頭是超聲分散20次，工作6s/次，間隔4s，超聲功率80 W。最后用0.8 μm水系濾膜過濾，-20℃下避光保存。

1.3.1.5熒光標(biāo)記胰島素的制備 稱取豬胰島素200 mg分散于45 ml超純水，加入NaHCO3和Na2CO3粉末得0.25 M碳酸鹽緩沖體系，最終pH=9.5。精確稱取5.0 mg FITC溶解于5 ml甲醇后在攪拌下逐滴緩慢加入胰島素溶液中，攪拌混合均勻后，置于4℃下避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，稱取2 mg甘氨酸用少量去離子水溶解后滴入反應(yīng)液以終止反應(yīng)。以體積排阻色譜法除去未反應(yīng)的FITC、緩沖鹽、甘氨酸和少量雜質(zhì)與副產(chǎn)物（葡聚糖凝膠柱Ф15 mm*200 mm，固定相為sephadex G25），收集最先流出的黃色條帶組分，合并后冷凍干燥，得到純凈的橙色FITC標(biāo)記胰島素粉末。

1.3.1.6熒光標(biāo)記胰島素的裝載 裝載方法與同1.3.1.4類似，只是在開始時(shí)加入INS與兩親殼聚糖納米?；旌稀?/p>

1.3.2在體和離體實(shí)驗(yàn)對(duì)殼聚糖納米粒粘膜粘附性考察

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成6組。在體實(shí)驗(yàn)3組：殼聚糖納米粒組、載胰島素殼聚糖組、胰島素組；離體實(shí)驗(yàn)3組：殼聚糖納米粒組、載胰島素殼聚糖組、胰島素組。

1.3.2.2 大白兔的霧化 利用超聲波霧化法給予大白兔霧化吸入實(shí)驗(yàn)液體，時(shí)間為15 min，待霧化結(jié)束后處死家兔，解剖取氣管、支氣管、肺組織，標(biāo)本盒用鋁箔紙包裹避光保存于冰盒中等待冰凍切片。

1.3.2.3大白兔的肺部灌洗 將大白兔處死解剖分離出完整的氣管及肺葉，用1 ml注射器通過氣管，注入實(shí)驗(yàn)液約400 ul，5 min后使灌洗液自然流出后用1 ml注射器通過氣管注入1ml 0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌洗。用組織剪分離出氣管、支氣管、肺組織，標(biāo)本盒用鋁箔紙包裹避光保存于冰盒中等待冰凍切片。

1.3.3殼聚糖納米粒在呼吸道粘膜的滯留時(shí)間考察

1.3.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的超聲霧化吸入 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)均分為4組，每組6只。霧化方法同上。將四組大白兔分別于霧化結(jié)束后30 min、2 h、5 h、8 h后解剖并分離出氣管、支氣管、肺組織（方法同上）。

1.3.3.2冰凍切片的制作及熒光顯微鏡觀察拍照 從標(biāo)本盒中取出各組織塊將其平放于特制小盒內(nèi)，加適量OCT包埋劑完全淹沒組織，將氣泡用吸頭洗出；然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，使小盒底部接觸液氮，約20 s組織即迅速冰凍成塊。在樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上（放置組織時(shí)注意把氣管、支氣管的縱軸向上），再添一層OCT膠，使其完全覆蓋組織，然后置于切片機(jī)中的冷凍臺(tái)上，在-20℃條件下放置2 min后進(jìn)行切片，切片的厚度為10 μm，將切好的切片置于載玻片上，放在冰盒內(nèi)保存，冰凍切片制作過程中盡量避免光線直接照射。切片完畢后送至暗室內(nèi)使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS（17.0版）計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析處理軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組組均數(shù)之間兩兩對(duì)比采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1殼聚糖納米粒的制備及熒光標(biāo)記 通過對(duì)殼聚糖的親水、疏水改性及FITC反應(yīng)得到如下特征的熒光標(biāo)記的殼聚糖納米粒：其基本理化性質(zhì)：粒徑：253 nm±9 nm，表面電位：12.3mV±1.2 mV。

2.2在體霧化后各組之間氣管粘膜上的熒光強(qiáng)度分析比較 在體實(shí)驗(yàn)霧化后，在激光共聚焦顯微鏡下可見三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣道粘膜上皆有綠色熒光顯示。三組動(dòng)物通過不同的霧化液霧化后，對(duì)三組動(dòng)物的氣管粘膜、支氣管粘膜及肺組織上的熒光強(qiáng)度互相進(jìn)行分析比較：殼聚糖納米粒組與殼聚糖載胰島素組，P>0.05；殼聚糖納米粒組與胰島素組，P<0.05；殼聚糖載胰島素組與胰島素組，P<0.05，見表1，圖1。

2.3離體灌洗后各組之間氣管粘膜上的熒光強(qiáng)度分析比較 離體灌洗后，在激光共聚焦顯微鏡下可見三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣道粘膜上皆有綠色熒光顯示。三組動(dòng)物的離體支氣管肺組織通過不同的灌洗液灌洗后，對(duì)三組動(dòng)物的氣管粘膜、支氣管粘膜及肺組織上的熒光強(qiáng)度互相進(jìn)行分析比較：殼聚糖納米粒組與殼聚糖載胰島素組，P>0.05；殼聚糖納米粒組與胰島素組，P<0.05；殼聚糖載胰島素組與胰島素組，P<0.05，見表2。

2.4殼聚糖納米粒在呼吸道粘膜的滯留時(shí)間考察 激光共聚焦顯微鏡下氣管粘膜、支氣管粘膜及肺組織內(nèi)的綠色熒光顯示反映了殼聚糖納米粒霧化吸入后在氣道上有大量粘附。通過熒光強(qiáng)度分析，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)殼聚糖納米粒在氣道粘膜上的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，但在霧化吸入后8 h的氣管粘膜、支氣管粘膜及肺組織上的熒光強(qiáng)度仍強(qiáng)于在體實(shí)驗(yàn)霧化后胰島素組的熒光強(qiáng)度，見表3，圖2。

3討論

殼聚糖是一種天然高分子材料，又名脫乙酰甲殼素，化學(xué)名為β-（1-4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是甲殼素用濃堿處理后脫去乙酰基得到的產(chǎn)物[4]，具有良好的生物相容性、無毒性、生物粘附性及生物可降解性[5]。以殼聚糖為代表的載體材料近些年被醫(yī)藥界制備成載藥納米粒廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥和制劑。殼聚糖納米粒制備工藝成熟，主要有復(fù)凝聚法、共價(jià)交聯(lián)法、離子凝膠化法、乳化/溶劑擴(kuò)散法、沉淀法、化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾等[6]。殼聚糖納米粒作為藥物載體目前在國(guó)內(nèi)外已做了不少的研究，并取得了一定成就。有研究將殼聚糖通過霧化吸入的方式給予維斯塔大鼠后，通過檢測(cè)肺組織的蛋白、羥基基團(tuán)、氧化性谷胱甘肽等發(fā)現(xiàn)給予70 mg/kg劑量的殼聚糖不會(huì)引起肺組織的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。Liqin Jiang等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫醇化殼聚糖修飾的PLA-PCL-TPGS口服抗腫瘤藥物載體能夠增加紫杉醇在胃粘膜的滯留時(shí)間并能增加藥物在粘膜的滲透作用。Janes等通過殼聚糖納米粒載阿霉素，體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)阿霉素的釋放達(dá)到了良好的緩釋效果，能夠平穩(wěn)釋放5 d；再通過C26細(xì)胞郁積實(shí)驗(yàn)表明，在0.1～100 μg·ml-1阿霉素內(nèi)，殼聚糖交聯(lián)阿霉素在抑制細(xì)胞活性的水平上相比阿霉素溶液沒有明顯差別，這說明殼聚糖納米粒載阿霉素不會(huì)明顯的降低藥效。Sanjay Patildeng 等將殼聚糖作為卡維地洛的載體，通過鼻粘膜給藥途徑給予家兔藥物，發(fā)現(xiàn)其與鼻粘膜具有較好的粘附性，且在8 h內(nèi)其釋放率為75%，吸收率和生物利用度達(dá)到72.29%。

殼聚糖納米粒除了載藥作用于局部粘膜緩慢釋藥的特性外，其無毒性、生物相容性及生物降解性是其作為藥物載體必不可少的條件。張小茜等用蛙的上顎進(jìn)行呼吸道粘膜的毒性研究，通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)表明殼聚糖載載藥微球纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間、纖毛運(yùn)動(dòng)頻率與生理鹽水組相比無明顯的差異，并且通過對(duì)比殼聚糖載藥組和正常組LDH（細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志酶，細(xì)胞膜受損傷后從細(xì)胞內(nèi)滲透出來，是肺急性細(xì)胞毒性的敏感指標(biāo)）的活性發(fā)現(xiàn)，兩組之間的LDH活性無明顯差異，均說明了殼聚糖作為給藥載體用于肺部給藥是安全的。Zhang Y等制備出海藻酸鈉殼聚糖微球作為胰島素給藥載體，以糖尿病大鼠為研究對(duì)象，口服給藥作用于胃腸道粘膜，研究表明微球載體不僅能保護(hù)胰島素被胃蛋白酶和酸性胃液破壞，而且能夠緩慢釋藥，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，使血糖水平有效地降低并穩(wěn)定的保持較長(zhǎng)的時(shí)間。

本研究通過在體實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)兩種實(shí)驗(yàn)方法，以肺部給藥模型藥物胰島素為對(duì)照，證明了殼聚糖納米粒在氣管粘膜上具有粘附性并能提高藥物在氣管粘膜上的粘附率；殼聚糖納米粒的粘附時(shí)間考察顯示殼聚糖納米粒在氣管粘膜上的粘附率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，在給藥后8 h仍有部分殼聚糖納米粒粘附在氣管粘膜上。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/申磊