梁希港　陳方民　楊成

摘要：目的 觀察臍血干細(xì)胞（umbilical cord blood stem cells）移植聯(lián)合督脈電針治療對(duì)脊髓全橫斷損傷（spinal cord injury，SCI）大鼠的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響。方法 建立SD大鼠T10脊髓節(jié)段完全橫斷模型，隨機(jī)分為正常組、損傷模型組、督脈電針治療組、臍血干細(xì)胞移植組、督脈電針治療聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植組（分別簡稱正常組、模型組、電針組、臍血組、聯(lián)合組），每組再分為3個(gè)時(shí)間段7 d、14 d、28 d，每組共大鼠18只。分別于7 d、14 d、28 d分離各組大鼠的脊髓組織，應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot技術(shù)定位、定量檢測各組組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達(dá)變化。結(jié)果 電針治療組、臍血移植組和聯(lián)合組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)都高于損傷模型組，臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合電針治療組表達(dá)量最高。結(jié)論 結(jié)果顯示臍血干細(xì)胞移植和電針治療具有協(xié)同作用，能顯著提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，對(duì)脊髓損傷的功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷；臍血干細(xì)胞；電針；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，臨床康復(fù)治療效果仍不理想。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)營養(yǎng)素家族的表達(dá)發(fā)生改變，這些改變與神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性有重要關(guān)系[1]。成年哺乳動(dòng)物脊髓具有可塑性，且針刺可促進(jìn)脊髓可塑性[2-6]。研究證實(shí)，督脈電針可以改善損傷局部組織的血液微循環(huán)，促進(jìn)腦脊液流動(dòng)，減輕SCI部位的水腫、血腫的壓迫及粘連，抑制脊髓繼發(fā)性損傷，同時(shí)督脈電針治療可以促進(jìn)SCI脊髓神經(jīng)軸突的再生[6]。在過去的幾年中，干細(xì)胞成為再生醫(yī)學(xué)的研究焦點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞，盡管能夠分化成所有三個(gè)胚細(xì)胞譜系層，但是它的使用受到倫理問題的限制[7]。自從1974年Kandtzon等發(fā)現(xiàn)人臍血中存在造血干細(xì)胞后，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)臍血干細(xì)胞的生物學(xué)、免疫學(xué)特性及臨床應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究[8]，證實(shí)臍血可以作為一種新的干細(xì)胞來源治療惡性血液病、退行性疾病及修復(fù)神經(jīng)損傷等。目前，人臍血干細(xì)胞（human umbilical cord blood stem cell，hUCBSC）移植治療脊髓損傷是脊髓修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已取得滿意效果，并有初步的臨床研究。本研究將人臍血干細(xì)胞移植和督脈電針治療聯(lián)合應(yīng)用，觀察對(duì)脊髓損傷后BDNF表達(dá)的影響，以期為電針治療聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植臨床應(yīng)用治療脊髓損傷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組：90只成年雌性SD大鼠（SPF級(jí)），體重220～260 g，購自煙臺(tái)綠葉制藥有限公司。隨機(jī)分為5組，正常組、損傷對(duì)照（CT）組、督脈電針治療（EA）組、臍血干細(xì)胞移植（UCS）組、督脈電針治療聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植（UCS+EA）組，每組18只。

1.2方法

1.2.1樣本獲取 ①造模后7，14，28 d各時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)取3只大鼠，40 g/L多聚甲醛心臟灌注固定，取損傷處頭端長約1 cm脊髓組織，中性甲醛溶液后固定，石蠟包埋，切片。②造模后7，14，28 d各時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)取3只大鼠，脊髓新鮮取材，置-80℃冰箱冷存，以備提取蛋白及mRNA。

1.2.2免疫熒光組織化學(xué)觀察 取各組標(biāo)本石蠟切片，厚4 μm，常規(guī)脫臘至水；抗原修復(fù)；山羊血清封閉；滴加兔抗大鼠BDNF單克隆抗體（1∶200，abcam公司），4℃過夜；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶100，北京中杉金橋技術(shù)有限公司），37℃、30 min；DAPI復(fù)染；封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。圖像經(jīng)LEICA QWin圖像處理與分析系統(tǒng)處理，統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)面積（m2）、平均灰度值，分析BDNF的陽性表達(dá)變化。

1.2.3 RT-PCR檢測 采用Trizol試劑盒（Invitrogen公司），根據(jù)說明書操作，提取各組脊髓織中的總RNA，溶于20 μL DEPC-H2O，-80℃冰箱冷存。

BDNF引物序列：上游：5'-ATAGCAGGGCAGTTGGACA-3'；下游：5'-CACCTTGGCGATTACAGAAG-3'；GAPDH序列：上游：5'-CGTGCCGCTGGAGAAACCTG-3'；下游：5'-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3'。

加樣完成后離心，放入熒光定量PCR儀（ABI Prism？7300型，Corbett research公司，澳大利亞），按以下條件進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)：①步驟一：變性，重復(fù)1次，95℃，30 s；②步驟二：PCR反應(yīng)，重復(fù)40次，95℃，5 s→60℃，34 s。

每個(gè)待測樣品cDNA設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)得到的3個(gè)Ct值取平均值，用2-△△Ct[8，10]法進(jìn)行計(jì)算最后與GAPDH進(jìn)行校正后統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 Western Blot檢測 抽提28 d各組標(biāo)本總蛋白，采用BCA方法測定BDNF蛋白含量。依次經(jīng)5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠、8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉封閉2 h；孵育袋內(nèi)根據(jù)需要加入兔抗大鼠抗體BDNF IgG，4℃孵育過夜；TBS-T洗膜；加入山羊抗兔HRP IgG，37℃，孵育1 h，TBS-T洗膜。膠片曝光、經(jīng)顯影、定影處理后觀察結(jié)果，掃描，采用Image J軟件分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以（x±s）表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，兩組間差異比較選用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1免疫熒光檢測大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)灰質(zhì)內(nèi)BDNF的表達(dá)變化 免疫熒光顯示BDNF陽性細(xì)胞染色呈紅色，輪廓清晰，主要為脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞。建模后28 d，與對(duì)照組大鼠相比，PD大鼠脊髓組織中BDNF熒光強(qiáng)度分別增強(qiáng)了62.7%、49.1%和145%（P<0.05），見圖1。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合組的BDNF表達(dá)量最高。

圖1 免疫熒光結(jié)果

2.2 RT-PCR檢測大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量 Real-time PCR結(jié)果顯示：BDNF在脊髓損傷大鼠脊髓組織中7 d組表達(dá)分別為（9.8±1.0）、（8.0±1.5）、（22.2±3.9），均較模型對(duì)照組（2.4±0.8）明顯升高（Fig.2A，B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。14 d組表達(dá)分別為（3.8±0.7）、（7.9.0±1.3）、（13.2±1.6），均較模型對(duì)照組（0.4±0.05）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；28 d組表達(dá)分別為（3.4±0.7）、（2.2±0.4）、（5.2±1.0），均較模型對(duì)照組（0.4±0.07）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Real-time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BDNFmRNA在模型組表達(dá)較低，在治療組的表達(dá)明顯升高。損傷7 d后明顯升高，并達(dá)到高峰，14 d和28 d表達(dá)量有所下降，但明顯高于模型組。

2.3大鼠脊髓損傷后28dBDNF蛋白的表達(dá)變化 Western-Blot結(jié)果顯示：與模型組相比，建模后28 d，SCI大鼠脊髓組織BDNF的蛋白表達(dá)量分別增加了41.3%、3.5%和59.8%（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在28 d組大鼠中蛋白表達(dá)水平

3 討論

脊髓損傷一直是醫(yī)學(xué)界面對(duì)的一大難題，它涉及損傷即刻的原發(fā)性損傷和后續(xù)的繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷是直接損傷，多為不可逆的創(chuàng)傷性損傷；繼發(fā)性損傷為創(chuàng)傷后的病理生理過程，其損傷機(jī)制十分復(fù)雜[9]。

干細(xì)胞的研究是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，人類臍血干細(xì)胞已經(jīng)證明在許多疾病模型中有肯定效果[10]。臍血干細(xì)胞有來源廣泛、低的免疫性、容易獲得等優(yōu)點(diǎn)。最主要的是他可以分化為不同的細(xì)胞，例如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。然而如何能夠有效的將臍血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脊髓損傷后的細(xì)胞是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)難題。脊髓損傷治療目標(biāo)有兩個(gè)：挽救受損神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷和死亡；促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生。脊髓繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，損傷局部發(fā)生的復(fù)雜的病理生理改變，包括缺血缺氧、興奮性氨基酸毒性、自由基生成、蛋白酶釋放、中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及周圍巨噬細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的炎性反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)，SCI后損傷脊髓局部BDNF免疫反應(yīng)陽性，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，SCI后1 w，大多數(shù)少突膠質(zhì)細(xì)胞呈BDNF免疫反應(yīng)陽性，提示BDNF與SCI后脊髓修復(fù)關(guān)系密切[11-12]。

NTFs是軸突再生微環(huán)境中的一組重要因子，除對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有營養(yǎng)作用外，還可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)，如生長相關(guān)蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、BDNF、神經(jīng)營養(yǎng)素等，其中BDNF是目前研究最為廣泛和深入的NTFs之一。研究表明，BDNF可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）增殖、分化，調(diào)節(jié)自由基代謝，減少自由基積聚，保護(hù)神經(jīng)元免受自由基的攻擊。本試驗(yàn)中將臍血干細(xì)胞移植和電針治療結(jié)合起來，通過對(duì)檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)量來評(píng)估兩者在脊髓損傷過程中的效果。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出，單純的臍血干細(xì)胞和電針治療都對(duì)脊髓損傷有一定的治療效果，而兩者的聯(lián)合呈現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，提示在治療脊髓損傷的過程中聯(lián)合運(yùn)用多種治療手段可起到很好的協(xié)同作用。有關(guān)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在神經(jīng)細(xì)胞增殖分化的過程中的作用，對(duì)移植干細(xì)胞的分化方向等尚需進(jìn)一步的研究。

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編輯/羅茗柯