陳學(xué)周++畢意輝++張可可++張明凱++尤濤

摘 要：目的：通過對(duì)新生嚙齒類海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)，嘗試建立一個(gè)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效的嚙齒類海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，為脊髓損傷的相關(guān)分子機(jī)制研究提供目的細(xì)胞。方法：取新生SD乳鼠的海馬組織，通過低濃度胰酶消化制成細(xì)胞懸液、4h差速貼壁后使用無血清Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，免疫熒光對(duì)海馬神經(jīng)元相關(guān)微管蛋白-2（MAP2）行特異性染色，結(jié)合DAPI核染色鑒定神經(jīng)元。結(jié)果：該方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好，純度較高。結(jié)論：采用低濃度胰酶消化，差速貼壁及無血清培養(yǎng)嚙齒類海馬神經(jīng)元符合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求，為進(jìn)一步研究提供良好的目的細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：海馬神經(jīng)元；低濃度胰酶；差速貼壁；無血清培養(yǎng)

中圖分類號(hào) Q42 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）02-06-03

Culturing and Identification of the Neonatal Rodent Hippocampal Neurons

Chen Xuezhou1 et al.

（1 The Department of Orthopedics， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022，China）

Abstract：Obejctive：To established a simple， effective and stable method for the culture of rat hippocampal neurons in vitro， and provide target cell for dissecting molecular and cellular mechanisms in neuroscience.Methods：The hippocampus of neonatal rat were dissected and cell suspension were digested by low concentration of trypsin.The cell suspensions were cultured with serum-free Neurobasal medium after four hours differential adherence.Morphological observation of neurons growth state by inverted microscope， the hippocampal neurons can be identified by MAP2 specific antibody with DAPI.Results：The hippocampal neurons grew well and reached a high purity.Conclusion：Using low concentration of trypsin， differantial adherence and serum-free medium conforms to the requirements of neonatal rat hippocampal neurons culture in vitro， so as to provide targeted cells for further research.

Key words：Hippocampal neurons；Low concentration of trypsin；Differantial adherence；Serum-free medium

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱外科一種致殘率很高的疾病，易造成患者運(yùn)動(dòng)功能障礙，大小便失禁甚至終身癱瘓[1]?，F(xiàn)代研究表明，脊髓損傷后，經(jīng)歷第一次原發(fā)性損傷及第二次繼發(fā)性損傷，二次損傷是繼發(fā)性，是可以預(yù)防和治療的，其重點(diǎn)在于保護(hù)殘存神經(jīng)元的功能[2]。建立簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效的神經(jīng)元體外培養(yǎng)是在細(xì)胞水平研究脊髓損傷的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 出生24h內(nèi)SD乳鼠，雌雄不限，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 Neurobasal培養(yǎng)基、B27無血清添加劑、GlutaMAX-I添加劑、DMEM（high glucose）培養(yǎng)基、滅活胎牛血清、0.25%胰酶、臺(tái)盼藍(lán)染液均購(gòu)自Invitrogen公司，多聚-D-賴氨酸、DPBS、Hanks液、抗熒光淬變封片液購(gòu)自碧云天公司，DNase I、DAPI、Triton X-100購(gòu)自sigma公司，神經(jīng)元相關(guān)微管蛋白-2（MAP2）、Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）購(gòu)自abcam公司。

1.1.3 主要器材 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、15mm細(xì)胞爬片、超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、激光共聚焦顯微鏡、手術(shù)解剖顯微鏡

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 種植培養(yǎng)液：含90%DMEM+10%滅活胎牛血清。維持培養(yǎng)液：98%Neurobasal培養(yǎng)基+2%B27無血清添加劑+0.5mMGlutaMAX-I添加劑。

1.2.2 細(xì)胞爬片及細(xì)胞培養(yǎng)孔板處理 將滅菌的15mm細(xì)胞爬片用DPBS配制的0.1mg/mL多聚-D-賴氨酸溶液浸泡，室溫孵育2h，吸棄多聚-D-賴氨酸溶液，蒸餾水洗2遍，晾干待用。

1.2.3 海馬神經(jīng)元的分離 取出生24h內(nèi)SD乳鼠，75%酒精消毒后斷頭，依次剪開皮膚、顱骨，迅速取出腦組織置于冰上含有預(yù)冷Hanks液的培養(yǎng)皿中。在手術(shù)顯微鏡下分離出兩側(cè)的海馬區(qū)，徹底剝離腦膜及血管。用剪刀剪成約1mm3大小，加入預(yù)熱的0.05%胰酶，放入37℃消化15min（每7min稍微搖晃一下）。小心吸走消化過組織，用2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，加入100μLDNase I，混勻后使用1mL槍頭上下輕柔吹打15下，靜置2min，吸取上清液。再像沉淀的組織團(tuán)塊中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及100μL DNase I，重復(fù)上述吹打步驟。吸取上層細(xì)胞懸液，如此重復(fù)2次。70μm細(xì)胞篩過濾，1000r/min離心5min棄上清，使用種植培養(yǎng)基重懸，吸100μL細(xì)胞懸液后加入100μL臺(tái)盼藍(lán)染液，于血球計(jì)數(shù)器下計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/mL，每孔加入1mL，十字搖板數(shù)次，放入培養(yǎng)箱內(nèi)。以上操作確保在2h內(nèi)全部完成。4h后使用無血清DMEM培養(yǎng)基洗板鏡檢細(xì)胞碎片基本去除后，換成Neurobasal培養(yǎng)基，后每2d半量換液。

1.2.4 神經(jīng)元細(xì)胞鑒定 取體外培養(yǎng)7d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞爬片，吸出培養(yǎng)基，PBS洗1次，加入1mL預(yù)熱多聚甲醛溶液，確保神經(jīng)突不被破壞，室溫孵育10min。PBS洗1次，0.1%Triton X-100通透膜10min。加入10%山羊血清孵育1h后，加入1%血清稀釋的MAP2（1∶500），4℃濕盒孵育過夜。加入1%血清稀釋的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶1 000），室溫避光孵育1h。DAPI復(fù)染5min后，將細(xì)胞爬片反轉(zhuǎn)放至滴有抗熒光淬滅封固液的干凈載玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封載玻片邊緣，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察 剛接種細(xì)胞分散，呈圓形透亮。4h后細(xì)胞已貼壁，部分細(xì)胞已伸出短小軸突。1～2d后，細(xì)胞明顯增大，突起延伸，形成稀疏網(wǎng)絡(luò)。在培養(yǎng)過程中，神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系逐漸豐富，并形成網(wǎng)絡(luò)。5～7d神經(jīng)元在倒置顯微鏡下可見具有明顯的光暈，此時(shí)神經(jīng)元胞體呈三角形、橢圓形或多邊形，邊界清楚，胞體明亮，立體感增強(qiáng)（圖1、圖2）。

3 討論與結(jié)論

神經(jīng)元是腦及脊髓組織中最基本的組成成分，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能的發(fā)揮著主要的作用，是腦及脊髓損傷中最常用的細(xì)胞，其培養(yǎng)和鑒定技術(shù)亦是神經(jīng)生物學(xué)研究中最基本的技術(shù)。但是連續(xù)的神經(jīng)元細(xì)胞系因無法形成典型的軸突、樹突及突觸而得不到廣泛應(yīng)用，而原代培養(yǎng)的神經(jīng)元比傳代細(xì)胞系更加接近在體狀態(tài)，是研究工作中較佳的目的細(xì)胞，得到了廣泛應(yīng)用。

理論上，原代神經(jīng)元的培養(yǎng)可通過大腦任何部位及脊髓獲取，但海馬部位較其他部位神經(jīng)細(xì)胞成分簡(jiǎn)單，含量多，擁有典型的細(xì)胞表型[3-4]。傳統(tǒng)方法多采用胎鼠進(jìn)行海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)[5-6]，其神經(jīng)分化程度低，便于培養(yǎng)，但由于操作復(fù)雜，如進(jìn)行雌雄鼠配種，計(jì)算胎齡，實(shí)驗(yàn)時(shí)間不可控制，取材時(shí)胎鼠表面羊水過多，海馬較小等導(dǎo)致操作要求高。而采用乳鼠較胎鼠具有較多的優(yōu)點(diǎn)，可按照實(shí)驗(yàn)按需處死一至數(shù)只實(shí)驗(yàn)乳鼠，取材較胎鼠簡(jiǎn)單，無需擔(dān)心缺氧對(duì)胎鼠腦神經(jīng)元的損害。

在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的過程中，很多因素都會(huì)影響原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的質(zhì)量，如收集細(xì)胞過少，接種時(shí)死細(xì)胞比例過高，雜細(xì)胞過多等，其對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較普通細(xì)胞更高。首先，除了消化以外，其他操作均在冰上操作，從解剖至接種細(xì)胞控制在2h內(nèi)完成，盡量減少組織細(xì)胞代謝。解剖時(shí)，在手術(shù)顯微鏡下盡可能去除海馬組織表面所有的血管膜，以免消化后被迫吹打，導(dǎo)致接種時(shí)死細(xì)胞及雜細(xì)胞比例過高。其次，組織在消化前用剪刀剪碎，并使用低濃度0.05%胰酶加適量DNA酶，作用時(shí)間控制在15min左右，低濃度胰酶消化能力相對(duì)溫和，死細(xì)胞較少，從而避免使用木瓜酶現(xiàn)用現(xiàn)配的缺點(diǎn)。DNA酶可分解消化過程死細(xì)胞釋放出來的DNA，避免組織纏結(jié)，吹打過程可收獲更多單細(xì)胞懸液。吹打時(shí)，采用分步吹打，慢吸慢吹，動(dòng)作輕柔，保證每一個(gè)單細(xì)胞都避免過度吹打，盡可能多地收集細(xì)胞。再次，使用含10%滅活胎牛血清重懸、接種細(xì)胞，其血清成分可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，4h后換成含B27添加劑的Neurobasal培養(yǎng)基，換液前輕微震蕩，可將多數(shù)貼壁不牢固的膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞碎片去除。含B27添加劑的Neurobasal培養(yǎng)基其成分確定，培養(yǎng)出的細(xì)胞狀態(tài)均一，選擇性促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，而膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不分裂。最后，接種板也是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素，接種板密度過低，神經(jīng)元突觸形成過少，無法利用自身分泌促生長(zhǎng)因子，同時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞分裂過多，難以存活和成熟。密度過高，營(yíng)養(yǎng)相互爭(zhēng)奪，細(xì)胞容易抱團(tuán)生長(zhǎng)，均會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。本實(shí)驗(yàn)?zāi)z質(zhì)細(xì)胞含量較少，未使用阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，因阿糖胞苷加入時(shí)間及劑量難以控制，毒性較大，除了抑制膠質(zhì)細(xì)胞外，對(duì)正常海馬神經(jīng)元亦有毒害作用。

綜上所述，采用低濃度胰酶消化，差速貼壁及無血清培養(yǎng)新生SD乳鼠海馬神經(jīng)元的方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效，可得到高密度的符合體外實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究提供了良好的目的細(xì)胞。

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（責(zé)編：張宏民）