范平杰++姜芳燕++李珍++馬紅梅++陳永敢

摘 要：靈芝是一類重要的木腐真菌，在我國海南島有廣泛分布。研究擴(kuò)增了1株分離自海南五指山的靈芝菌株rDNA-ITS序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并比較了其與部分親緣關(guān)系較近靈芝的rDNA-ITS序列差異。結(jié)果表明，分離自海南五指山的菌株Wzs1與G.resinaceum類群親緣關(guān)系較近，支持聚類的自展值為26%，表明靈芝Wzs1與G.resinaceum類群較相近。

關(guān)鍵詞：海南；靈芝；rDNA-ITS；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào) Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）02-14-03

靈芝（Ganoderma spp.）是一種重要的腐生型真菌，隸屬于真菌界（Kingdom Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），靈芝目（Ganodermatales），靈芝科（Ganodermataceae）[1]。野生靈芝的形態(tài)特征常常由于受到外部環(huán)境的影響產(chǎn)生很大的差異，有傘形、馬蹄形等，菌蓋有圓形、半圓形或腎形等，菌蓋表面一般有光澤或環(huán)形紋理。海南島的熱帶和亞熱帶雨林氣候?yàn)橐吧`芝生長發(fā)育提供了適宜的溫度和濕度，豐富的原始森林為靈芝生長提供充足的營養(yǎng)成分。至今已發(fā)現(xiàn)野生靈芝科有103個(gè)種，分為4個(gè)屬，3個(gè)亞屬，其中海南有72個(gè)種，約占總數(shù)的70%，表明海南島是我國野生靈芝分布最豐富的地區(qū)之一[2]。本研究利用rDNA-ITS引物，擴(kuò)增1株靈芝菌株的序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究菌株的分類學(xué)地位及親緣關(guān)系，以便今后進(jìn)一步的資源探索和菌株進(jìn)化研究提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌株分離、培養(yǎng)及DNA的提取 供試菌株Wzs1為靈芝子實(shí)體經(jīng)酒精-次氯酸鈉-酒精常規(guī)表面消毒后，置放于PDA培養(yǎng)基表面，于25℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，純化后4℃冷藏保存。菌種斜面上挑取菌絲接種至30mLGY液體培養(yǎng)基中，25℃搖床培養(yǎng)14d，收集菌絲用于DNA提取[3]。

1.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的克隆和測(cè)序 擴(kuò)增片段為ITS1、5.8S和ITS2區(qū)域，引物為ITS1 （5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4 （5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3） [3]。目的片段的擴(kuò)增及克隆參照Chen等方法[4]，將含有目的基因片段的菌液委托北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析及DNA序列差異性比較 根據(jù)菌株的rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，搜索同源序列。選取不同種的代表性菌株作進(jìn)一步的分析。采用Clustalx 1.83[5]將序列對(duì)齊，利用MEGA 5.0[6]軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并以自展法（bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)，循環(huán)1 000次，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中虎皮香菇（Lentinula tigrinus）作為外群。利用Clustalx 1.83[5]軟件將實(shí)驗(yàn)菌株序列及部分親緣關(guān)系較近的代表性菌株序列進(jìn)行比對(duì)，找出不同序列間的堿基差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征 在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)，從表面消毒的子實(shí)體邊緣生長出白色菌落，具有典型的腐生真菌形態(tài)特征。菌落正面白色，棉質(zhì)，質(zhì)地緊密，中央隆起或稍有皺褶，邊緣疏松，背面泛黃色或淡褐色。

2.2 DNA序列組成分析 靈芝菌株Wzs1進(jìn)行了rDNA-ITS的擴(kuò)增和測(cè)序。擴(kuò)增產(chǎn)物包括ITS1-5.8S-ITS2區(qū)段以及部分18S、25S區(qū)段，其中菌株Wzs1擴(kuò)增長度為674bp，ITS1、5.8S、ITS2序列長度分別為206bp、158bp、215bp，同時(shí)將測(cè)得的序列提交到GenBank（HQ689698）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建NJ樹branch length=0.391。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)顯示：靈芝菌株Wzs1與G.resinaceum類群聚為一支，自展值為26%；這一支包含了G.resinaceum、G.tenue、G.subamboinens和G.weberianum共4個(gè)種（圖1）。此外，rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹顯示靈芝不同種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，同時(shí)G.japonicum與G.sinense這2個(gè)種的4株菌株聚為一支，與此相似的還有G.australe與G.adspersum，G.applanatum與G.lipsiense，G.pseudoferreum與G.philippii 6個(gè)種，其它各個(gè)種菌株各自聚為一支，這些結(jié)果反映了rDNA-ITS能夠較好地對(duì)不同種菌株進(jìn)行區(qū)分（圖1）。

2.4 DNA序列差異分析 將屬于G.resinaceum類群的9個(gè)菌株進(jìn)行rDNA-ITS序列差異性比較，以序列的一端作為起始點(diǎn)，菌株Wzs1與其它8個(gè)菌株的差異主要分布在3個(gè)不同區(qū)域，分別位于90～140bp，160～200bp，420～460bp，這反映了菌株Wzs1與其它G.resinaceum類群菌株產(chǎn)生差異可能由這3個(gè)差異顯著的片段決定（圖2）。

3 討論與結(jié)論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，靈芝真菌的形態(tài)分類容易受到外界環(huán)境的影響被越來越多的研究證明，形態(tài)數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確區(qū)分不同種的菌株[3]。采用rDNA-ITS序列研究發(fā)現(xiàn)，中國栽培靈芝菌株中樹舌亞屬、紫芝組的菌株各自聚成一組，赤芝組的菌株分成3組，85.7%赤芝組菌株均聚于同一組，且樹舌亞屬、紫芝組和赤芝組間的遺傳差異較大，赤芝組內(nèi)存在一定的遺傳差異，但多樣性并不豐富[7-8]。菌株Wzs1與G.resinaceum類群聚為一支，說明這些靈芝遺傳關(guān)系較為緊密。此外，Wzs1靈芝子實(shí)體也具有類似G.resinaceum類群4種靈芝的形態(tài)特征。因此，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，菌株Wzs1可能與G.resinaceum類群較相近，但與G.resinaceum這個(gè)種有較明顯的區(qū)別，并且序列差異比較分析也表明Wzs1與G.resinaceum類群其它菌株存在3個(gè)不同區(qū)域的差異，這也反映了菌株Wzs1僅與這一類群相近但有別于G.resinaceum的菌株。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究海南產(chǎn)靈芝菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)信息提供了參考借鑒。

參考文獻(xiàn)

[1]Chang S T，Miles P G.Mushrooms cultivation，nutritional value，medicinal effect，and environmental impact[M].CRC Press，2004：357-372.

[2]吳興亮，戴玉成.中國靈芝圖鑒[M].北京：科學(xué)出版社，2005：1-14.

[3]陳永敢，陳光宙，袁學(xué)軍，等.中國產(chǎn)Ganoderma lucidum的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析及栽培技術(shù)研究[J].北方園藝，2014，08（1）：92-95，96.

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[5]Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J.Clustal W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice [J].Nucleic Acids Res，1994，22：4673-4680.

[6]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol，2011，28：2731-2739.

[7]蘇春麗，唐傳紅，張勁松，等.基于rDNA-ITS序列探討中國栽培靈芝菌株的親緣關(guān)系[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47（1）：11-16.

[8]Zheng L Y，Jia D H，F(xiàn)ei X F，et al.An assessment of the genetic diversity within Ganoderma strains with AFLP and ITS PCR-RFLP [J].Mycol Res.，2009，164：312-321.

（責(zé)編：張宏民）