孫韜，陳磊，張衛(wèi)文

天津大學(xué)化工學(xué)院合成微生物學(xué)實驗室，天津 300072

應(yīng)用合成生物學(xué)策略改良光合藍(lán)細(xì)菌

孫韜，陳磊，張衛(wèi)文

天津大學(xué)化工學(xué)院合成微生物學(xué)實驗室，天津 300072

陳磊，天津大學(xué)化工學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事微生物合成生物學(xué)以及光合藍(lán)細(xì)菌領(lǐng)域的研究。主要成果包括：首次發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌對乙醇和丁醇耐受性的專一性調(diào)控蛋白，工作得到《ASBMB Today》配發(fā)專文評述；鑒定并解析了藍(lán)細(xì)菌應(yīng)對環(huán)境脅迫的調(diào)控蛋白及相關(guān)機制等。至今發(fā)表SCI論文60余篇，累計影響因子大于200。受邀擔(dān)任國際雜志《Frontiers in Microbiology》審稿編輯。2011年起，擔(dān)任《Microbial Cell Factories》、《Frontiers in Microbiology》、《ACS Synthetic Biology》等多個國際學(xué)術(shù)刊物的經(jīng)常評審人。作為項目負(fù)責(zé)人主持國家自然科學(xué)基金面上項目2項、天津市自然科學(xué)基金1項，作為子課題負(fù)責(zé)人主持國家“973計劃”項目3項，累計主持科研經(jīng)費400多萬元。2013年入選天津市“用三年時間引進(jìn)千名以上高層次人才”計劃，2016年入選天津大學(xué)“北洋青年學(xué)者”計劃。E-mail：lchen@tju.edu.cn

藍(lán)細(xì)菌是一類能夠直接利用光能和CO2作為唯一能源和碳源進(jìn)行生長的光合微生物。近年來，光合藍(lán)細(xì)菌以其獨特的優(yōu)勢作為“自養(yǎng)型細(xì)胞工廠”合成了多種燃料及化學(xué)品。以光合藍(lán)細(xì)菌中的幾種模式生物為例，總結(jié)近年來以藍(lán)細(xì)菌為工程菌株合成生物燃料及化學(xué)品的研究進(jìn)展，對目前藍(lán)細(xì)菌菌株存在的固有問題進(jìn)行分析，并提出應(yīng)用合成生物學(xué)進(jìn)行菌種改良的方案。

合成生物學(xué)；藍(lán)細(xì)菌；生物燃料；化學(xué)品；菌種改良

油氣資源的減少及對化石燃料和石油化學(xué)產(chǎn)品的長期依賴引起的環(huán)境污染等問題，促使人們尋找綠色清潔的燃料、化學(xué)品及可持續(xù)的生產(chǎn)方式。近些年，隨著合成生物學(xué)的興起及快速發(fā)展，利用微生物作為細(xì)胞工廠進(jìn)行生物燃料及化學(xué)品的合成取得了令人矚目的進(jìn)展。盡管如此，現(xiàn)有研究所利用的微生物如運動假單胞菌、大腸桿菌及釀酒酵母等在生產(chǎn)過程中仍需要利用一些高成本物質(zhì)如葡萄糖和肥料等，大幅增加了生產(chǎn)成本從而使得工業(yè)生產(chǎn)受到限制。

藍(lán)細(xì)菌（cyanobacteria）作為一類能進(jìn)行放氧光合作用的原核生物，在地球上已存在了20余億年，亦稱為藍(lán)藻（blue algae）或藍(lán)綠藻（blue-green algae），能利用太陽能和CO2作為唯一的能源和碳源進(jìn)行生長。藍(lán)細(xì)菌比其他微生物具備一系列更優(yōu)良的特質(zhì)：①遺傳背景簡單，便于基因改造；②生長營養(yǎng)需求低，不需要糧食作物作為原料供應(yīng)，培養(yǎng)不占用耕地；③能夠固定CO2，有望減緩全球變暖進(jìn)程；④生長速度相對較快，培養(yǎng)周期短，生長密度高；⑤具有復(fù)雜的光合系統(tǒng)，其光能利用效率是陸生植物的數(shù)倍。

基于藍(lán)細(xì)菌的這些優(yōu)勢，利用其作為生產(chǎn)高附加值化學(xué)產(chǎn)品和生物燃料的新型“自養(yǎng)型人工細(xì)胞工廠”引起了科研人員廣泛關(guān)注。近年來，借助于合成生物學(xué)手段在藍(lán)細(xì)菌中構(gòu)建內(nèi)源及外源通路用于生物燃料和化學(xué)品的生產(chǎn)取得了突破性進(jìn)展（圖1）。以藍(lán)細(xì)菌中的模式生物如集胞藻PCC 6803（Synechocysits sp. PCC 6803）、聚球藻PCC 7942（Synechococcus elongatus sp. PCC 7942）及聚球藻PCC 7002（Synechococcus sp. PCC 7002）為例，對目前以藍(lán)細(xì)菌為工程菌進(jìn)行生物燃料和化學(xué)品合成的工作進(jìn)行總結(jié)，并針對現(xiàn)在藍(lán)細(xì)菌菌株存在的固有問題進(jìn)行分析，提出應(yīng)用合成生物學(xué)進(jìn)行菌種改良的方案。

圖1 藍(lán)細(xì)菌合成多種生物燃料及化學(xué)品代謝通路

1 應(yīng)用光合藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料

1.1 乙醇

生物乙醇可以單獨或與汽油混配制成乙醇汽油作為汽車燃料，是一種重要的清潔能源。早在1999年，Deng和Coleman[1]通過在聚球藻PCC 7942中導(dǎo)入外源丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶（ADH）成功構(gòu)建出乙醇的合成通路，雖然產(chǎn)量只有230mg/L，卻是利用藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料的開端。2009年Dexter等[2]將這一產(chǎn)量提升至460mg/L。而在2012年，Gao等[3]通過替換乙醇脫氫酶等一系列措施在集胞藻PCC 6803中實現(xiàn)了5.5g/L的乙醇產(chǎn)出。

1.2 正丁醇

相比于乙醇，正丁醇具有更優(yōu)良的特性，即更高的熱值、更易存、低揮發(fā)性等等，因此更適宜作為生物燃料。James Liao課題組[4-5]對藍(lán)細(xì)菌中正丁醇的合成做出了重要貢獻(xiàn)，通過在聚球藻PCC 7942中引入六種外源基因，實現(xiàn)宿主細(xì)胞正丁醇的產(chǎn)出。通過優(yōu)化丁醇生產(chǎn)需要的還原力及前體供應(yīng)，正丁醇產(chǎn)量可達(dá)到404mg/L。

1.3 烷烴

含有4～23個碳原子的烷烴擁有更高的能量密度、疏水特性及更好的設(shè)備兼容性。目前已有一些在聚球藻PCC 7942及集胞藻PCC 6803中合成烷烴的報道。2013年， Kaiser等[6]在聚球藻PCC 7942中實現(xiàn)了2.3mg/L烷烴的產(chǎn)出，而中國科學(xué)院青島生物能源研究所呂雪峰研究組[7]在集胞藻PCC 6803中將烷烴產(chǎn)量提升至26mg/L。

2 應(yīng)用光合藍(lán)細(xì)菌合成化學(xué)品

2.1 乙烯

乙烯是一種重要的工業(yè)原材料，是合成纖維、橡膠、塑料、乙醇的基本化工原料，也可用于制造氯乙烯、苯乙烯、環(huán)氧乙烷等；美國70%的乙烯來自于石腦油。早在1997年，Sakai等[8]在聚球藻PCC 7942中導(dǎo)入外源乙烯形成酶（EFE）實現(xiàn)了乙烯在藍(lán)細(xì)菌中的首次合成。經(jīng)過科研人員多年努力，目前以集胞藻PCC 6803為宿主菌，乙烯產(chǎn)率可達(dá)（718±19）μL/（L·h·OD）[9]。

2.2 乳酸

乳酸是一種手性化合物，有D型和L型兩種，在食品、化妝品等行業(yè)都有廣泛應(yīng)用。另外，由不同比例D-乳酸和L-乳酸聚合而成的聚合物可用于替代傳統(tǒng)的聚乙烯塑料。目前，D-乳酸最高產(chǎn)量由Varman等[10]在集胞藻PCC 6803中實現(xiàn)，產(chǎn)量達(dá)2.17g/L；而L-乳酸的最高產(chǎn)量由van der Woude等[11]同樣在集胞藻PCC 6803中實現(xiàn)，產(chǎn)量為1.8g/L。

2.3 聚羥基烷酸酯單體

聚羥基烷酸酯是由單體如3-羥基丙酸（3-HP）、3-羥基丁酸（3-HB）和3-羥基戊酸（3-HV）聚合而成的長鏈物質(zhì)，在可生物降解的包裝材料、組織工程材料、緩釋材料、電學(xué)材料以及醫(yī)療材料方面有廣闊的應(yīng)用前景。天津大學(xué)張衛(wèi)文研究組[12-13]先后在集胞藻PCC 6803中實現(xiàn)了3-HB及3-HP的合成，產(chǎn)量分別達(dá)到533.4mg/L及837.2mg/L。

3 應(yīng)用合成生物學(xué)進(jìn)行菌種改良

3.1 光合效率優(yōu)化

光合作用是藍(lán)細(xì)菌將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過程，光合效率極大限制藍(lán)細(xì)菌的產(chǎn)率。因此，篩選光合效率高的藍(lán)細(xì)菌也顯得尤為重要。在藍(lán)細(xì)菌中，與光合作用相關(guān)的主要有光合系統(tǒng)I、光合系統(tǒng)Ⅱ和藻膽體三個亞基復(fù)合物（圖2）。一方面，藍(lán)細(xì)菌吸收的為可見光400～700nm部分，不能利用紅外或紫外光。因而，拓寬藍(lán)細(xì)菌的吸收光譜是一種有效的改良方案。將外源可吸收額外光譜的葉綠素基因如葉綠素d、葉綠素f（可吸收范圍700～750nm）等的基因?qū)胨{(lán)細(xì)菌中很可能獲得光合能力更強的新菌種；甚至可將兩個光合系統(tǒng)中的一個亞基復(fù)合物替換。另一方面，自然界中的藍(lán)細(xì)菌在進(jìn)化過程中形成了過量的捕光天線，如圖2中別藻藍(lán)蛋白（AP）、藻青蛋白（PC）及藻紅蛋白（PE），而這部分天線蛋白捕獲過多的光子會引起光損傷而影響光合效率。因而，對藍(lán)細(xì)菌菌株另一改造可集中在最小化捕光天線蛋白?？傊?，對光合作用的修飾對于藍(lán)細(xì)菌改良依然重要。

圖2 藍(lán)細(xì)菌的光合系統(tǒng)及其優(yōu)化策略[14]

3.2 固碳效率增強

藍(lán)細(xì)菌有一個很有效的CO2濃縮機制（CCM），以無機碳（CO2、HCO3-等）為碳源，進(jìn)行無機碳源的攝取、富集。CO2的富集由HCO3-和CO2傳遞系統(tǒng)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶（Rubisco）及羧酸酐酶組成的羧化酶系統(tǒng)實現(xiàn)（圖3）。因此，改良藍(lán)細(xì)菌菌種固碳能力最直接的策略就是通過識別并且過表達(dá)特定的無機碳轉(zhuǎn)運蛋白和Rubisco或者用更高效的酶替代。目前在藍(lán)細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種無機碳攝取機制，3種涉及HCO3-的固定（BicA、SbtA和BCT1），2種涉及CO2的固定（NDH-I3和NDH-I4）。但是目前還未成功通過修飾無機碳轉(zhuǎn)運蛋白來強化無機碳的攝取。已有研究表明，通過過表達(dá)HCO3-轉(zhuǎn)運蛋白Sll0834，可有效提高集胞藻PCC 6803菌株的固碳能力[15]；此外，也有將異源Rubisco導(dǎo)入聚球藻PCC 7942中增強異丁醛產(chǎn)量的報道[16]?？梢姽烫寄芰Φ脑鰪妼τ谒{(lán)細(xì)菌菌株的改良十分重要，未來還需要進(jìn)行更多的探索。

3.3 碳流重新排布

在藍(lán)細(xì)菌的多條代謝途徑中，碳通量（carbon f ux）分布是極不平衡的，只有5%和10%的碳通量進(jìn)入了萜類和脂肪酸的合成，這也極大限制了藍(lán)細(xì)菌對外源產(chǎn)品的生物合成。因此需要構(gòu)建更優(yōu)良的藍(lán)細(xì)菌菌株來適應(yīng)外源產(chǎn)品的生產(chǎn)。目前主要有兩種策略來優(yōu)化以丙酮酸或乙酰輔酶A為底物的化合物合成過程中的碳通量。①強化關(guān)鍵前體物質(zhì)的合成途徑來獲取更多的碳。天津大學(xué)張衛(wèi)文等[13]通過在集胞藻PCC 6803中過表達(dá)了內(nèi)源的乙酰輔酶A合成相關(guān)基因增加了乙酰輔酶A的供給，將3-HP的最高產(chǎn)量增加了4.5倍。②敲除內(nèi)源消耗碳通量較多的競爭途徑。藍(lán)細(xì)菌中存在著如糖原合成途徑、PHB合成途徑及乙酸合成途徑等，這些途徑消耗了大量的碳通量卻限制了外源產(chǎn)品的積累，因而部分或全部敲除該途徑將會獲得更優(yōu)良的工程菌株。據(jù)報道，在集胞藻中刪除編碼PHB途徑的基因slr1829和slr1830可提高3-HB產(chǎn)量2.1倍。這些研究表明在藍(lán)細(xì)菌底盤中優(yōu)化碳通量是一個有效方式，在后續(xù)菌種改良過程值得進(jìn)一步嘗試。

圖3 藍(lán)細(xì)菌固碳能力及碳通量優(yōu)化策略[14]

3.4 底盤耐受性改善

很多產(chǎn)品尤其是一些生物燃料，即使在低濃度下對藍(lán)細(xì)菌也有毒害作用，降低了宿主細(xì)胞的生長速率，限制了生產(chǎn)潛力和未來工業(yè)生產(chǎn)的可能性，因此篩選耐受性更好的菌株很關(guān)鍵。要提高菌種的耐受性，首先要了解菌株對產(chǎn)品的響應(yīng)機制。對此，借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)、定量蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等方法，天津大學(xué)張衛(wèi)文等對此進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了集胞藻PCC 6803中諸多與乙醇、丁醇及己烷等生物燃料產(chǎn)品脅迫響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控蛋白（表1）。未來，可通過過表達(dá)這些調(diào)控蛋白培育耐受性更好的藍(lán)細(xì)菌菌株。此外，藍(lán)細(xì)菌的大規(guī)模培養(yǎng)一般在海水中進(jìn)行以節(jié)省淡水資源，因此，鹽分、溫度、pH變化的耐受性也需要考慮在內(nèi)。為了篩選更好的藍(lán)細(xì)菌，未來的工作可主要集中于以下幾個方面。①選擇合適的藍(lán)細(xì)菌菌種。例如，聚球藻PCC 7002更合適短鏈醇生產(chǎn)，而集胞藻PCC 6803則適合游離脂肪酸的生產(chǎn)。此外，目前藍(lán)細(xì)菌中的合成生物學(xué)研究主要集中于易于基因編輯的模式生物，未來可探索更優(yōu)良的藍(lán)細(xì)菌菌種。②適應(yīng)性定向進(jìn)化。盡管適應(yīng)性進(jìn)化研究需要大量時間和精力，卻一直被認(rèn)為是強化優(yōu)勢而獲得全局基因修飾的一種策略。經(jīng)過在集胞藻PCC 6803培養(yǎng)過程不斷添加并提高正丁醇的濃度，天津大學(xué)張衛(wèi)文等[23]將集胞藻PCC 6803對正丁醇的耐受性提高了150%，獲得了更優(yōu)良的菌種。③過表達(dá)外排泵和轉(zhuǎn)運蛋白。外排泵能夠直接將最終產(chǎn)物從胞內(nèi)排到胞外使產(chǎn)品在胞內(nèi)保持一個很低的濃度，將產(chǎn)品的毒性降到最低。有研究發(fā)現(xiàn)，集胞藻PCC 6803中缺少ABC轉(zhuǎn)運蛋白Slr0982后，對乙醇耐受性降低，表明Slr0982可能負(fù)責(zé)乙醇的轉(zhuǎn)運[24]。未來的相關(guān)工作可集中于向藍(lán)細(xì)菌中引入轉(zhuǎn)運蛋白以提高藍(lán)細(xì)菌的耐受性獲得更好的工程菌株。

4 總結(jié)與展望

光合藍(lán)細(xì)菌憑借其可直接利用CO2和太陽能作為碳源和能源進(jìn)行生物質(zhì)合成的優(yōu)勢日益受到研究者的關(guān)注，越來越多的生物燃料及化學(xué)品合成途徑在藍(lán)細(xì)菌中得以實現(xiàn)，其前景不言而喻。然而，目前以藍(lán)細(xì)菌作為工程菌進(jìn)行生物燃料及化學(xué)品合成仍存在不少產(chǎn)量低、耐受能力差等固有的問題，這些問題限制了未來的工業(yè)化應(yīng)用。相信通過科研人員的不懈努力，定能將這一“自養(yǎng)型細(xì)胞工廠”合理利用并為人類服務(wù)。

表1 集胞藻PCC 6803中與生物燃料耐受性調(diào)控有關(guān)的調(diào)控蛋白

［1］ DENG M D，COLEMAN J R. Ethanol synthesis by genetic engineering in cyanobacteria[J]. Appl Environ Microbiol，1999，65：523-528.

［2］ DEXTER J，F(xiàn)U P. Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production[J]. Energy Environ Sci，2009，2（8）：857-864.

［3］ GAO Z，ZHAO H，LI Z，et al. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria[J]. Energy Environ Sci，2012，5：9857-9865.

［4］ LAN E I，LIAO J C. ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol in cyanobacteria[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109：6018-6023.

［5］ LAN E I，RO S Y，LIAO J C. Oxygen-tolerant coenzyme A-acylating aldehyde dehydrogenase facilitates eff cient photosynthetic n-butanol biosynthesis in cyanobacteria[J]. Energy Environ Sci，2013，6（9）：2672-2681.

［6］ KAISER B K，CARLETON M，HICKMAN J W，et al. Fatty aldehydes in cyanobacteria are a metabolically f exible precursor for a diversity of biofuel products[J]. PLoS One，2013，8（3）：e58307.

［7］ WANG W，LIU X，LU X. Engineering cyanobacteria to improve photosynthetic production of alka（e）nes[J]. Biotechnol Biofuels，2013，6（1）：1-9.

［8］ SAKAI M，OGAWA T，MATSUOKA M，et al. Photosynthetic conversion of carbon dioxide to ethylene by the recombinant cyanobacterium，Synechococcus sp. PCC 7942，which harbors a gene for the ethylene-forming enzyme of Pseudomonas syringae[J]. J Ferment Bioeng，1997，84（5）：434-443.

［9］ XIONG W，MORGAN J A，UNGERER J，et al. The plasticity of cyanobacterial metabolism supports direct CO2conversion toethylene[J]. Nature Plants，2016，100（8）：3401-3413.

［10］ VARMAN A M，YU Y，YOU L，et al. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium[J]. Microb Cell Fact，2013，12（1）：1-8.

［11］ VAN DER WOUDE A D，ANGERMAYR S A，PUTHAN V V，et al. Carbon sink removal：Increased photosynthetic production of lactic acid by Synechocystis sp. PCC6803 in a glycogen storage mutant[J]. J Biotechnol，2014，184：100-102.

［12］ WANG B，PUGH S，NIELSEN D R，et al. Engineering cyanobacteria for photosynthetic production of 3-hydroxybutyrate directly from CO2[J]. Metab Eng，2013，16：68-77.

［13］ WANG Y，SUN T，GAO X，et al. Biosynthesis of platform chemical 3-hydroxypropionic acid （3-HP） directly from CO2in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Metab Eng，2015，34：60-70.

［14］ GAO X，SUN T，PEI G，et al. Cyanobacterial chassis engineering for enhancing production of biofuels and chemicals[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2016，100（8）：3401-3413.

［15］ KAMENNAYA N A，AHN S，PARK H，et al. Installing extra bicarbonate transporters in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 enhances biomass production[J]. Metab Eng，2015，29：76-85.

［16］ ATSUMI S，HIGASHIDE W，LIAO J C. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde[J]. Nat Biotechnol，2009，27：1177-1180.

［17］ SONG Z，CHEN L，WANG J，et al. A transcriptional regulator Sll0794 regulates tolerance to biofuel ethanol in photosynthetic Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Molecular & Cellular Proteomics， 2014，13（12）：3519-3532.

［18］ WANG J，CHEN L，HUANG S，et al. RNA-seq based identification and mutant validation of gene targets related to ethanol resistance in cyanobacterial Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Biotechnol Biofuels，2012，5（1）：1-18.

［19］ ZHU Y，PEI G，NIU X，et al. Metabolomic analysis reveals functional overlapping of three signal transduction proteins in regulating ethanol tolerance in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Mol Biosyst，2015，11（3）：770-782.

［20］ CHEN L，WU L，WANG J，et al. Butanol tolerance regulated by a two-component response regulator Slr1037 in photosynthetic Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Biotechnol Biofuels，2014，7：89.

［21］ NIU X，ZHU Y，PEI G，et al. Elucidating butanol tolerance mediated by a response regulator Sll0039 in Synechocystis sp. PCC 6803 using a metabolomic approach[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2015，99（4）：1845-1857.

［22］ KACZMAEZYK D，ANFELT J，SARNEGRIM A，et al. Overexpression of sigma factor SigB improves temperature and butanol tolerance of Synechocystis sp. PCC6803[J]. J Biotechnol，2014，182-183:54-60.

［23］ WANG Y，SHI M，NIU X，et al. Metabolomic basis of laboratory evolution of butanol tolerance in photosynthetic Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Microb Cell Fact，2014，13：151.

［24］ ZHANG Y N，NIU X F，SHI M L，et al. Identif cation of a transporter Slr0982 involved in ethanol tolerance in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803[J]. Frontiers in Microbiology，2015，6：487.

Engineering of photosynthetic cyanobacteria strains using synthetic biology: a review

SUN Tao，CHEN Lei，ZHANG Weiwen

Laboratory of Synthetic Microbiology, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

Cyanobacteria have emerged as an important chassis for producing biofuels and chemicals due to their capability to directly utilize sunlight and CO2as the sole energy and carbon sources. Recent progresses in developing and applying various synthetic biology tools have led to the successful constructions of novel pathways of several dozen green fuels and chemicals utilizing cyanobacterial chassis. In recent years, numerous researches have been conducted to enhance the production of green fuels and chemicals through cyanobacterial chassis engineering including photosynthesis, CO2uptake and f xation, products exporting, tolerance and cellular regulation. In this article, we critically reviewed recent progresses and universal strategies in cyanobacterial chassis engineering to make it more robust and effective for bio-chemicals production.

synthetic biology; cyanobacteria; biofuels; bio-chemicals; strain engineering

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.009

孫韜，博士研究生。研究方向：光合藍(lán)細(xì)菌中小RNA的功能鑒定及異源代謝通路的構(gòu)建等。E-mail：tsun@tju.edu.cn