郭 帥，黃子誠，謝 點，吳黎明，鄭明敏,2，陳必鏈,2，何勇錦,2*

1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2福建師范大學(xué) 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州 350117

紫球藻(Porphyridiumcruentum)是紫球藻科、紫球藻屬一種較為原始的單細(xì)胞紅藻，是紅藻門中唯一的單細(xì)胞微藻[1]。紫球藻可合成藻膽蛋白、多不飽和脂肪酸(PUFAs)、硫酸酯胞外多糖等生物活性物質(zhì)[2,3]。Ismail等[4]利用藻膽蛋白制成銀納米粒子，實驗結(jié)果表明該粒子比原有藻膽蛋白表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌、抗氧化和抗病毒活性。對于PUFAs，已有大量臨床研究證實了，食用PUFAs可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和組織的發(fā)育，降低腫瘤、心血管疾病和其它慢性疾病的發(fā)生[5]。紫球藻硫酸酯多糖，具有抗病毒、抗輻射、抗氧化、抗癌等多種生物學(xué)功能[6]。因此，開發(fā)紫球藻生物活性物質(zhì)對我國生物醫(yī)藥、化妝品、保健食品等行業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

已有研究表明[7]，與其它光源(如白熾燈、金屬鹵化物燈)相比，發(fā)光二極管(LED)燈的使用壽命更長(約5萬 h)，生產(chǎn)工藝更環(huán)保，已廣泛用于培養(yǎng)微藻。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，與LED源的藍(lán)燈、紅燈和白燈相比，紫球藻(Porphyridiumcruentum,FJ-12)在LED綠光條件下生長最好[8]。因此，本研究培養(yǎng)紫球藻所使用的光源為LED綠光。

有研究表明，紫球藻細(xì)胞的生長特性及其活性物質(zhì)的產(chǎn)量與氮源濃度存在很大的相關(guān)性。Guihéneuf等[9]研究表明，與缺氮條件相比，紫球藻在富氮(1 g/L)條件下可促進(jìn)合成藻紅蛋白或藻膽蛋白；然而，紫球藻在缺氮條件下，有利于PUFAs的合成和胞外多糖的分泌。已有的研究[10,11]也得到類似的結(jié)果。這些研究可表明，氮濃度調(diào)節(jié)著微藻細(xì)胞機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、油脂和糖類代謝的平衡，影響微藻儲存物質(zhì)的方向。正如前人的研究結(jié)果[9-11]，氮調(diào)控只能調(diào)節(jié)紫球藻合成藻紅蛋白或合成PUFAs和胞外多糖。因此，非常有必要調(diào)控培養(yǎng)紫球藻的工藝條件，使其機(jī)體內(nèi)的代謝處于最佳平衡狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到協(xié)同合成藻紅蛋白、PUFAs和胞外多糖。

有研究指出[12]，在不適的光質(zhì)條件下，微藻機(jī)體內(nèi)的活性氧(ROS)水平上升，進(jìn)而加速對藻紅蛋白或藻膽蛋白的氧化或降解，降低對光量子的吸收，影響捕光效率和光合作用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，LED綠光是最適合培養(yǎng)紫球藻(Porphyridiumcruentum, FJ-12)的光質(zhì)。因此，有必要研究，在LED綠光條件下，不同氮源濃度對紫球藻生長和活性物質(zhì)合成的影響。尋找最適合協(xié)同合成紫球藻藻紅蛋白、PUFAs和胞外多糖的培養(yǎng)工藝。目前，關(guān)于這一方面的研究還尚未報道?；诒菊n題組已有的研究基礎(chǔ)上，選擇紫球藻(Porphyridiumcruentum,FJ-12)為藻種，在LED綠光條件下，系統(tǒng)評估不同氮源濃度對紫球藻細(xì)胞生長和藻膽蛋白、PUFAs與胞外硫酸酯多糖合成的影響，解決現(xiàn)有紫球藻協(xié)同合成生物活性物質(zhì)的技術(shù)瓶頸，為產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖紫球藻協(xié)同合成活性物質(zhì)提供實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種及光生物反應(yīng)器

紫球藻(Porphyridiumcruentum,FJ-12)藻種保藏于本實驗室。培養(yǎng)紫球藻所使用的反應(yīng)器為柱式光生物反應(yīng)器(長1 000 mm，外徑50 mm和內(nèi)徑45 mm)，購置于南京啟衡漁業(yè)科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

人工海水(ASW)培養(yǎng)基[13]：27 g NaCl，6.6 g MgSO4·7H2O，5.6 g MgCl·6H2O，1.5 g CaCl2·2H2O，1 g KNO3，0.07 g KH2PO4，0.04 g NaHCO3，1 mol/L Tris·HCl(pH 7.6)20 mL，1 mL微量元素母液a，1 mL FeEDTA溶液b，加蒸餾水至1 L，121 ℃滅菌20 min。

微量元素母液a：4 mg ZnCl2，60 mg H3BO3，1.5 mg CoCl2·6H2O，4 mg CuCl2·2H2O，40 mg MnCl2·4H2O，37 mg (NH4)6Mo7O24，加蒸餾水至100 mL，121 ℃滅菌20 min。

FeEDTA溶液b：100 mL 0.05 mol/L Na2EDTA(pH 7.6)，240 mg FeCl3·4H2O。

1.3 實驗設(shè)計

將紫球藻細(xì)胞接種于含250 mL ASW培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在培養(yǎng)溫度為25 ℃和光照強(qiáng)度為3 000 Lux條件下，24 h持續(xù)光照，培養(yǎng)10天，藻細(xì)胞作為種子。

用1‰鹽酸溶液浸泡柱式光生物反應(yīng)器處理48 h，蒸餾水沖洗反應(yīng)器管內(nèi)，用已滅菌的ASW培養(yǎng)基充分潤洗反應(yīng)器3次。在LED綠燈條件下，設(shè)置KNO3濃度分別為0、0.5、1和1.5 g/L的不同實驗組，每組3管。紫球藻培養(yǎng)條件為：初始生物量為0.1 g/L，LED綠光強(qiáng)度為3 000 Lux，光照時間為24 h，培養(yǎng)溫度為25 ℃，通氣速率為1 L/min，通氣中的CO2為5 %，裝液量為1 L。培養(yǎng)過程中，每3天取樣測定細(xì)胞生物量和生化組分指標(biāo)。

1.4 生物量的測定

取藻液10 mL，在8 000 rpm 條件下離心10 min，棄去上清液收集藻泥，用蒸餾水洗滌藻泥，重復(fù)操作兩次，最后將處理好的藻泥置于80 ℃干燥箱中烘干至恒重，測定其干重。紫球藻生物產(chǎn)量的計算公式為：

由于前置胎盤胎盤覆蓋于子宮前壁切口位置，傳統(tǒng)手術(shù)瘢痕可能會影響胎盤移動，最終造成胎盤前置，加之子宮瘢痕內(nèi)膜過薄，使其絨毛組織侵入到子宮肌層中，使其胎盤植入幾率明顯提升。在進(jìn)行本次研究發(fā)現(xiàn)，全部患者均符合手術(shù)病理標(biāo)準(zhǔn)，患者經(jīng)過在腹彩超多普勒超聲的檢查發(fā)現(xiàn)，其診斷率為95.5%（85/89），漏診率4.9%（4/89）。對此，前置胎盤并發(fā)胎盤植入臨床診斷中，腹彩色超聲多普勒具有較高準(zhǔn)確率，且呈現(xiàn)無創(chuàng)安全的特點，具備臨床推廣與使用價值。

紫球藻生物產(chǎn)量(mg/(L·d))=

微藻生物量(mg/L)/培養(yǎng)時間

1.5 藻膽蛋白濃度的測定

依據(jù)Marcati等[14]的方法，測定藻膽蛋白的步驟如下：取3 mL藻液離心收集藻泥，加入5 mL PBS緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)，放入-20 ℃冰箱中反復(fù)凍融，至藻泥顏色變白，離心收集上清液分別于650、620和565 nm波長條件下測吸光值，藻膽蛋白中別藻藍(lán)蛋白(APC)、藻藍(lán)蛋白(R-PC)和藻紅蛋白(B-PE)濃度換算用如下公式：

R-PC(mg/mL) = (OD620-0.7×OD650)/7.38

APC(mg/mL) = (OD650-0.19×OD620)/5.65

B-PE (mg/mL) = (OD565-2.8×(R-PC)-1.34×(APC))/12.7

紫球藻別藻藍(lán)蛋白、藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白產(chǎn)量計算使用如下公式：

R-PC產(chǎn)量(mg/(L·d))=R-PC濃度/培養(yǎng)時間

APC產(chǎn)量(mg/(L·d))=APC濃度/培養(yǎng)時間

1.6 胞外多糖的測定

根據(jù)Dubois等[15]的方法測定微藻胞外多糖含量，取1 mL的藻液，離心(8 000 rpm，5 min)收集上清液。取適量的上清液，加入5 mL 98%硫酸和1 mL 6%苯酚溶液，反應(yīng)30 min后，在波長490 nm條件下測定吸光值，D-葡萄糖作為測定微藻胞外多糖的標(biāo)準(zhǔn)品。測定公式為：

S=174.83×OD490-0.95，R2=0.997

其中，S為胞外多糖的濃度(mg/L)；OD490為490 nm的吸光值。

紫球藻胞外多糖產(chǎn)量的計算使用如下公式：

紫球藻胞外多糖產(chǎn)量(mg/(L·d))=紫球藻胞外多糖濃度/培養(yǎng)時間

1.7 樣品的甲酯化和脂肪酸組成的測定

取藻液5 mL離心收集藻泥，加1 mL 1%硫酸-甲醇溶液，加入100 μL 1 mol/L的BHT(2，6-二叔丁基對甲酚)溶液，置于70 ℃水浴處理45 min，待樣品冷卻至室溫，加2 mL含十七酸甲酯(0.5 mg/L)的正己烷和2 mL蒸餾水，4 000 rpm離心5 min，取上清液的正己烷于試管中，加1 mL正己烷再次萃取，重復(fù)3次，合并提取的正己烷溶劑，氮吹去除正己烷，最后加1 mL正己烷溶解脂肪酸甲酯。37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和十七烷酸甲酯(0.1 mg/mL)對處理樣品進(jìn)行定性定量分析。利用氣相色譜儀(SCION 436-GC，Bruker)[8]測定樣品的可皂化脂肪酸(TFA)濃度(mg/L)。

紫球藻ARA和EPA產(chǎn)量的計算公式為：

ARA產(chǎn)量(mg/(L·d))=紫球藻TFAs濃度×ARA含量/培養(yǎng)時間

EPA產(chǎn)量(mg/(L·d))=紫球藻TFAs濃度×EPA含量/培養(yǎng)時間

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮濃度條件下紫球藻的生長情況

在不同氮濃度條件下，紫球藻的生長情況如圖1所示。由圖1可得，在缺氮培養(yǎng)基條件下，紫球藻細(xì)胞的生長緩慢，其生物量維持在0.1～0.55 g/L。與其他氮濃度相比，紫球藻在1 g/L氮濃度條件下可獲得最大生物量(3.09 g/L)。Kim等[16]在研究紫光(400 nm)、藍(lán)光(465 nm)、綠光(520 nm)、黃光(590 nm)和紅光(625 nm)對培養(yǎng)紫球藻的生長的影響，結(jié)果表明：紫球藻在綠色波長條件下培養(yǎng)14天，可獲得最大生物量(1.28 g/L)。Li等[10]研究低氮(3.5 mM)、中氮(5.9 mM)和高氮(17.6 mM)對培養(yǎng)紫球藻生長的影響，結(jié)果表明：紫球藻在高氮條件下可獲得最大生物量(5.54 g/L)。在本研究中(1 g/L KNO3即為9.9 mM)，紫球藻獲得的最高生物量比Li等[10]的研究結(jié)果低，這可能是因為培養(yǎng)紫球藻的培養(yǎng)基氮濃度的不同和培養(yǎng)條件的差異(如不同光質(zhì))所引起的。

圖1 不同氮濃度對紫球藻生長的影響Fig.1 Effect of different nitrogen concentration on P.cruentum cell growth

2.2 不同氮濃度條件下紫球藻藻膽蛋白的合成情況

紫球藻所合成藻膽蛋白包括別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白。在LED綠光條件下，不同氮濃度對紫球藻APC、B-PE和R-PC合成性能的影響，見圖2所示。從圖2結(jié)果可以看出，在缺氮條件下，紫球藻所合成APC、B-PE和R-PC濃度先上升后下降的趨勢；當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后，紫球藻APC、B-PE和R-PC濃度分別為0.24、2.52和0.58 mg/L。這結(jié)果表明，缺氮條件下紫球藻進(jìn)行光合作用產(chǎn)生的氧氣會提高機(jī)體內(nèi)活性氧水平，使葉綠體類囊體腔內(nèi)的pH值下降，酸化環(huán)境易導(dǎo)致藻膽蛋白的分解[17]。

對于氮濃度為0.5 g/L時，紫球藻APC、B-PE和R-PC的最高濃度處于第12～15天、第15天和第15天；當(dāng)培養(yǎng)時間超過15天，藻細(xì)胞可能已耗盡了培養(yǎng)基中的氮元素，進(jìn)而影響對藻膽蛋白的合成，導(dǎo)致APC、B-PE和R-PC濃度下降。當(dāng)?shù)獫舛确謩e提高到1 g/L和1.5 g/L時，紫球藻所合成的APC、B-PE和R-PC濃度能維持在較高水平。這可能是因為充足氮濃度可滿足紫球藻細(xì)胞合成所需的蛋白質(zhì)。值得注意的是，Li等[10，11]的研究選擇白光培養(yǎng)紫球藻，其合成的藻膽蛋白濃度在中后期(9～12天)則呈現(xiàn)下降趨勢。在本研究中，選擇LED綠光作為培養(yǎng)紫球藻的光源，則不會出現(xiàn)下降趨勢。一方面，與白光光源相比，綠色具有較低的光量子吸收值，可能降低類囊體腔的ROS水平，避免藻膽蛋白的分解[18]。另一方面，紫球藻葉綠素a和捕光藻膽素可能賦予其對綠光的適應(yīng)，促進(jìn)光合效應(yīng)[19]。因此，從圖2結(jié)果可得，最適合紫球藻合成藻膽蛋白的氮濃度為1～1.5 g/L。

圖2 不同氮濃度對紫球藻藻膽蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen concentrations on phycobiliprotein content of P.cruentum

2.3 不同氮濃度條件下紫球藻胞外多糖的合成情況

不同氮濃度對紫球藻合成胞外多糖的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在缺氮條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，紫球藻胞外多糖濃度逐漸升高。已有的研究也證實，紫球藻在缺氮條件下,紫球藻細(xì)胞光合作用固定二氧化碳主要用于合成胞外多糖[20]。當(dāng)?shù)獫舛葟?.5 g/L提高到1 g/L時，經(jīng)18天培養(yǎng)后，紫球藻胞外多糖的濃度從103.81 mg/L提高到255.62 mg/L。但是，在氮濃度為1 g/L和1.5 g/L條件下的紫球藻所合成胞外多糖濃度則無顯著差異。因此，最適合紫球藻合成胞外多糖的氮濃度為1～1.5 g/L。

圖3 不同氮濃度對紫球藻胞外多糖含量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen concentrations on extracellular polysaccharides content of P.cruentum

2.4 不同氮濃度條件下紫球藻油脂的合成情況

圖4為不同氮濃度條件下紫球藻合成油脂的結(jié)果。已有的研究[10,11,21]和本研究的結(jié)果都表明，缺氮有利于紫球藻油脂的合成。但是，與缺氮條件相比，紫球藻在0.5、1和1.5 g/L三個氮濃度條件下具有更高油脂濃度。這主要是因為微藻在這三個氮濃度條件下具有更高的生物量(見圖1)。同時，與其他氮濃度相比，在氮濃度為1 g/L下的紫球藻可合成最大的油脂濃度233.86 mg/L。

圖4 不同氮濃度對紫球藻TFAs含量的影響Fig.4 Effects of different nitrogen concentrations on TFAs content of P.cruentum

在LED綠光下，經(jīng)18天培養(yǎng)后，采收紫球藻細(xì)胞，利用氣相色譜法分析其脂肪酸組成，結(jié)果見表1。由表1可知，紫球藻所合成的主要脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA/C20∶5(ω-3))、花生四烯酸(ARA/C20∶4(ω-6))、亞油酸(LA/C18∶2(ω-6))和棕櫚酸(PA/C16∶0)。此外，實驗結(jié)果表明，不同氮濃度會明顯影響紫球藻某些脂肪酸的合成。如，在缺氮條件下，紫球藻有利于棕櫚酸和亞油酸的合成。但是，隨著培養(yǎng)基氮濃度的升高，紫球藻油脂中棕櫚酸和亞油酸的比例呈下降趨勢；相反的是，ARA和EPA的比例則呈上升趨勢。Breuer等[22]和Asgharpour等[23]研究也表明，在缺氮的條件下，紫球藻傾向合成棕櫚酸和亞油酸，不利于ARA和EPA的積累。Hu等[21]考察氮磷脅迫對紫球藻脂肪酸合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫球藻在氮充足和磷限制的條件下可提高ARA和EPA的合成。這些已有的研究和本研究的結(jié)果都可表明，氮濃度水平可調(diào)控紫球藻機(jī)體某些特定脂肪酸的合成。因此，從紫球藻脂肪酸組成上，高氮(1.5 g/L)有利于紫球藻合成ARA和EPA。

表1 紫球藻在不同氮濃度實驗組培養(yǎng)18天后的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of P.cruentum after cultivation for 18 days under the different nitrogen concentrations media treatments

2.5 不同氮濃度條件下的紫球藻生物產(chǎn)量和活性物質(zhì)產(chǎn)量

經(jīng)培養(yǎng)18天后，分析不同氮濃度條件下的紫球藻生物產(chǎn)量和活性物質(zhì)產(chǎn)量，結(jié)果見圖5。在紫球藻生物產(chǎn)量方面，在氮濃度為1 g/L條件下培養(yǎng)紫球藻可獲得最大生物產(chǎn)量為150 mg/(L·d)。在藻膽蛋白產(chǎn)量方面，紫球藻在1 g/L和1.5 g/L的氮濃度下可獲得最大APC和R-PC產(chǎn)量；對于B-PE，紫球藻B-PE產(chǎn)量隨氮濃度的升高而升高。在胞外多糖產(chǎn)量方面，紫球藻獲得最大胞外多糖所需的氮濃度為1.5 g/L；但是，氮濃度為1 g/L和1.5 g/L下的紫球藻胞外多糖產(chǎn)量則無顯著差異。對于ARA產(chǎn)量方面，紫球藻在1 g/L和1.5 g/L的氮濃度下獲得的ARA產(chǎn)量無顯著差異，但顯著高于其他氮濃度下的值。EPA產(chǎn)量的變化趨勢與ARA產(chǎn)量趨勢是一致的。因此，基于圖5的結(jié)果，為了節(jié)省培養(yǎng)成本，選擇氮濃度為1 g/L作為紫球藻FJ-12培養(yǎng)的最佳氮濃度，不僅有利于紫球藻細(xì)胞的生長，還可以促進(jìn)藻膽蛋白、胞外硫酸酯多糖和PUFAs活性產(chǎn)物的聯(lián)產(chǎn)協(xié)同合成，克服了現(xiàn)有技術(shù)調(diào)控紫球藻合成多種活性物質(zhì)的瓶頸問題。

圖5 不同氮濃度條件下的紫球藻生物產(chǎn)量和活性物質(zhì)產(chǎn)量Fig.5 Biomass and active substance productivity of P.cruentum under different nitrogen concentrations

在LED綠光條件下，探究了不同氮濃度(0、0.5、1和1.5 g/L)對紫球藻細(xì)胞的生長和活性產(chǎn)物合成的影響。實驗結(jié)果表明：紫球藻細(xì)胞在氮濃度為1 g/L條件下可獲得最大的生物量(3.09 g/L)；在氮濃度為1 g/L和1.5 g/L條件下，紫球藻細(xì)胞可獲得較高的APC、B-PE、R-PC、胞外多糖、ARA和EPA濃度和產(chǎn)量。此外，與其他前人研究不同的是，本研究在LED綠光條件下，紫球藻在高氮濃度條件下所合成的這些活性物質(zhì)不會出現(xiàn)下降趨勢，可實現(xiàn)紫球藻聯(lián)產(chǎn)協(xié)同合成藻膽蛋白、胞外硫酸酯多糖和PUFAs，為規(guī)?；B(yǎng)殖紫球藻多聯(lián)產(chǎn)開發(fā)生物活性物質(zhì)提供實踐依據(jù)。