趙志常， 劉茂柏， 李 彬， 陳瑋媛， 張婧玲， 黃麗雅， 劉 蕊， 林齊立

·論著·

MicroScan WalkAway儀器對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌檢測(cè)能力的評(píng)價(jià)

趙志常1， 劉茂柏1， 李 彬*， 陳瑋媛2， 張婧玲2， 黃麗雅2， 劉 蕊2， 林齊立2

目的 評(píng)價(jià)MicroScanWalkAway 96 Plus （MSW） 全自動(dòng)微生物分析儀在碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）鑒定與預(yù)警中的指導(dǎo)價(jià)值。方法 同時(shí)用PCR法和MSW系統(tǒng)檢測(cè)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存的81株CRE。以紙片擴(kuò)散法和PCR法為金標(biāo)準(zhǔn)，比較該分析儀器對(duì)CRE菌株鑒定及預(yù)測(cè)是否產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性。結(jié)果 MSW判定CRE的符合率為69.1 %（56/81）。PCR檢測(cè)有48株細(xì)菌攜帶碳青霉烯類(lèi)耐藥基因；儀器法檢測(cè)這些菌株時(shí)，高級(jí)專(zhuān)家系統(tǒng)（AES）預(yù)測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶的靈敏度為93.8 %，特異度為42.4 %，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為70.3 %，陰性預(yù)測(cè)值為82.4 %，準(zhǔn)確度為72.8 %。結(jié)論 MSW系統(tǒng)對(duì)CRE具有較強(qiáng)的檢測(cè)能力。

MicroScan WalkAway 96 Plus儀器； 碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌； 高級(jí)專(zhuān)家系統(tǒng)

碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）常表現(xiàn)出多重耐藥或廣泛耐藥的特點(diǎn)； CRE形成的機(jī)制很多，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是主要原因之一[1]。CRE給臨床治療用藥增加了很大的困難，應(yīng)予高度重視，根據(jù)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性制定治療方案，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，提高治療效果。MicroScan WalkAway 96 Plus （MSW）全自動(dòng)微生物分析儀可以便捷快速地鑒定藥敏信息，已在臨床廣泛使用。本研究擬探討該系統(tǒng)在CRE檢測(cè)和預(yù)測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性和臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

收集2011年8月3日－2012年8月3日福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院通過(guò)紙片擴(kuò)散法確認(rèn)CRE 81株（CRE為對(duì)亞胺培南、美羅培南或多利培南任一耐藥的腸桿菌科細(xì)菌）。

1.2 主要儀器與試劑

MicroScanWalkAway 96 Plus 全自動(dòng)微生物分析儀（德國(guó)西門(mén)子公司）；SIEMENS NC 50鑒定藥敏卡。

1.3 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)

以MSW全自動(dòng)微生物分析儀SIEMENS NC 50鑒定藥敏卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)，并對(duì)儀器高級(jí)專(zhuān)家系統(tǒng)（AES）的提示產(chǎn)碳青霉烯酶信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。SIEMENS NC 50鑒定藥敏卡質(zhì)控菌株根據(jù)儀器系統(tǒng)要求選擇產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC 700324和大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4 耐藥基因的PCR檢測(cè)及基因測(cè)序

煮沸法制備細(xì)菌DNA模板，參照文獻(xiàn)采用PCR檢測(cè)碳青霉烯類(lèi)耐藥基因（A組KPC、GES、SME、IMI和NMC-A；B組NDM-1、IMP、VIM、SPM和GIM；D組OXA-48），測(cè)序陽(yáng)性產(chǎn)物確定基因型[2]。

1.5 MSW儀器AES性能指標(biāo)

AES是自動(dòng)化儀器中自帶的軟件程序，可以用來(lái)代替有豐富經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家審核，該系統(tǒng)能產(chǎn)生自動(dòng)檢測(cè)報(bào)告中的技術(shù)錯(cuò)誤和異常的藥物表型。AES每天審核異常藥敏規(guī)則，使檢驗(yàn)醫(yī)師可對(duì)報(bào)告進(jìn)行修訂或重復(fù)處理。本研究以PCR擴(kuò)增檢測(cè)的碳青霉烯酶基因?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行AES提示產(chǎn)碳青霉烯酶的相關(guān)性能指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 MSW 檢測(cè)CRE菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性

81株CRE菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感率和耐藥率，見(jiàn)圖1。

圖1 81株CRE菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感率和耐藥率Figure 1 Susceptibility prof le of 81 strains of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae to commonly used antimicrobial agents

2.2 CRE菌株的分布和MSW系統(tǒng)鑒定

CRE菌株分布及MSW系統(tǒng)鑒定見(jiàn)表1。以紙片擴(kuò)散法為比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，MSW判定CRE菌株的符合率為69.1 %（56/81），其中肺炎克雷伯菌的符合率最高，為86.1 %（31/36）；而大腸埃希菌的符合率僅為38.9 %（7/18）。

2.3 PCR和MSW AES系統(tǒng)檢測(cè)

81株CRE中碳青霉烯酶陽(yáng)性菌株經(jīng)PCR證實(shí)有48株攜帶產(chǎn)碳青霉烯類(lèi)耐藥基因，而MSW AES系統(tǒng)提示碳青霉烯酶陽(yáng)性菌株共64株，見(jiàn)表2。

2.4 PCR基因分型和MSWW 判定

PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因及測(cè)序結(jié)果的碳青霉烯酶基因型分布見(jiàn)表3。在48株攜帶不同碳青霉烯酶基因型的CPE菌株中，MSW判定為CRE菌株的能力以及AES 檢測(cè)碳青霉烯酶陽(yáng)性的提示情況有所不同，見(jiàn)表4。

表1 CRE菌株的分布和MSW對(duì)不同菌種鑒定情況Table 1 Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains identif ed by the MSW system

表2 CRE菌株的PCR提示產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌和MSW提示碳青霉烯酶陽(yáng)性菌株對(duì)比Table 2 Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae strains identif ed by PCR versus the advanced expert system of MicroScan WalkAway 96 Plus

2.5 MSW AES 檢測(cè)碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo)

以PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，MSW AES 檢測(cè)碳青霉烯酶的靈敏度為93.8 %，特異度為42.4 %，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為70.3 %，陰性預(yù)測(cè)值為82.4 %，準(zhǔn)確度為72.8 %，見(jiàn)表5。

3 討論

碳青霉烯類(lèi)抗生素被認(rèn)為是目前治療多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染的最有效藥物，然而隨著后抗生素時(shí)代的到來(lái)，CRE的檢出率呈逐年上升的趨勢(shì)[3]，在臨床治療用藥上增加了難度。本研究分離的CRE，分別以紙片擴(kuò)散法和PCR法檢測(cè)基因型為金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)分析MSW檢測(cè)CRE菌株的性能指標(biāo)，探討全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)CRE菌株鑒定與預(yù)警的指導(dǎo)價(jià)值和臨床意義。

表3 碳青霉烯酶基因型病原菌構(gòu)成Table 3 Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in terms of carbapenemase genotype

表4 MSW對(duì)不同碳青霉烯酶基因型菌株的判定和提示產(chǎn)酶情況Table 4 Performance of MicroScan WalkAway 96 Plus in differentiation of different carbapenemase genotypes of carbapenemresistant Enterobacteriaceae strains

本研究中CRE菌株對(duì)臨床常用抗生素耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)頭孢菌素類(lèi)和頭霉素類(lèi)耐藥率尤為突出（均＞90 %）。值得關(guān)注的是其對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素阿米卡星耐藥率最低，提示臨床治療時(shí)可適當(dāng)考慮選擇該藥物。此外，收集到的菌株以肺炎克雷伯菌最多，與現(xiàn)階段的碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌的分布相符[3-4]。但從CRE菌株的分布數(shù)據(jù)可見(jiàn)CRE已出現(xiàn)在多個(gè)腸桿菌科種屬中，這需引起我們的高度重視。MSW判定CRE的符合率為74.1 %，其中大腸埃希菌的符合率較低（38.9 %）。以往研究也發(fā)現(xiàn)MSW在檢測(cè)CRE時(shí)的靈敏度和特異度有限，且有時(shí)也存在漏檢[5-6]。因此，當(dāng)臨床實(shí)驗(yàn)室使用MSW判定待測(cè)大腸埃希菌是否為CRE菌株時(shí)，應(yīng)考慮結(jié)合使用紙片擴(kuò)散法或瓊脂稀釋法加以驗(yàn)證，以確保無(wú)漏檢。

表5 MSW AES檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo)Table 5 Performance of MicroScan WalkAway 96 Plus advanced expert system in predicting carbapenemase production of Enterobacteriaceae strains

MSW AES一般是根據(jù)藥敏結(jié)果中所有第三代頭孢菌素和碳青霉烯類(lèi)的亞胺培南與厄他培南結(jié)果進(jìn)行推斷腸桿菌科細(xì)菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶。當(dāng)?shù)谌^孢菌素不敏感，且同時(shí)亞胺培南或厄他培南不敏感時(shí)，儀器則會(huì)推斷該菌株產(chǎn)酶。在本研究中MSW AES檢測(cè)CRE菌株的碳青霉烯酶陽(yáng)性提示率比PCR法檢測(cè)其中的碳青霉烯酶基因的檢出率高，這可能是因?yàn)镸SW僅是表型監(jiān)測(cè)，其他非基因因素（如生長(zhǎng)溫度、pH值等環(huán)境因素）引起的假陽(yáng)性影響檢出率，也可能與PCR未檢測(cè)到的其他當(dāng)前未知碳青霉烯酶基因有關(guān)[7]。

此外，MSW判定為CRE的菌株數(shù)少于AES提示碳青霉烯酶陽(yáng)性的菌株數(shù)。出現(xiàn)這種矛盾結(jié)果，我們分析可能是由于一些菌株出現(xiàn)碳青霉烯類(lèi)抗生素中介（如本儀器配套藥敏卡中的3種藥物），因而儀器并未判定為CRE。因此，當(dāng)日常工作中遇到此類(lèi)矛盾結(jié)果時(shí)，我們建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加貼碳青霉烯類(lèi)藥敏紙片，如果條件允許，分子生物學(xué)方法（如PCR）也可考慮使用。

MSW及其AES對(duì)攜帶有IMP、VIM、NDM-1或KPC的CRE的判定能力均較高（見(jiàn)表4）。但值得注意的是攜帶IMP-8的CRE菌株存在差異，AES預(yù)警信息相對(duì)于儀器對(duì)CRE直接鑒定上似乎更有優(yōu)勢(shì)（93.0 % 對(duì) 78.6 %）。這也再次給實(shí)驗(yàn)室一個(gè)提醒，實(shí)際操作中我們應(yīng)該更加重視AES系統(tǒng)提示信息！

由于本次研究菌株的數(shù)量與菌屬種類(lèi)有限，且可供參考的國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少，因此，有必要使用更多的樣本來(lái)減少實(shí)驗(yàn)中的偶然誤差，進(jìn)一步確認(rèn)此儀器判定CRE的性能。

總之，MSW和AES預(yù)測(cè)CRE菌株快速簡(jiǎn)便，靈敏度好，可信度高，適宜在臨床實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)使用，但必要時(shí)仍需要結(jié)合紙片擴(kuò)散法，以防止漏檢。

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Evaluation on the performance of Micr oScan WalkAway in detecting carbapenem-resistant Enterobacteriaceae

ZHAO Zhichang, LIU Maobai, LI Bin, CHEN Weiyuan, ZHANG Jingling, HUANG Liya, LIU Rui, LIN Qili. （Department of Pharmacy, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China）

Objective To investigate the performance of MicroScan WalkAway 96 Plus (MSW) system in detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE). Methods A total of 81 stock CRE strains were used in this study. Bacterial identif cation and antimicrobial susceptibility test were performed by MSW system. Beta-lactamases genes blaKPC, blaIMP, blaVIM, blaOXA-48and blaNDMwere amplif ed by PCR and subjected to sequencing analysis. Disk diffusion method and PCR were used as gold standard to evaluate the performance and reliability of MSW system in identifying carbapenem-resistant and carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae. Results Overall, 69.1 % (56/81) of the Enterobacteriaceae strains were identif ed as CRE by the MSW system. The results of PCR showed that 48 strains were carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. When carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae strains were identif ed by the instrument using an advanced expert system, the sensitivity was 93.8 % and specif city was 42.4 %. The positive predictive value was 70.3 %, the negative predictive value was 82.4 % and the predictive accuracy value was 72.8 %. Conclusions The MicroScan WalkAway 96 Plus system has shown good performance in detection of CRE.

MicroScan WalkAway 96 Plus system; carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; advanced expert system

R378.2

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0042-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.008

2015-11-16

2016-05-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201328)；福建省高校杰青項(xiàng)目（JA13134）；福建省衛(wèi)計(jì)委中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2015-ZQN-ZD-15）。

1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，福州 350001；

*檢驗(yàn)科；2. 福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與技術(shù)工程學(xué)院。

趙志常（1982－），女，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

李彬, E-mail:leonlee307@hotmail.com。