呂運(yùn)舟+董筱昀+蔣澤平

摘要：以9個(gè)無性系播種苗的幼莖為外植體，進(jìn)行薄殼山核桃組織培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，9個(gè)無性系都具有腋芽萌發(fā)能力，可通過組織培養(yǎng)再生植株，但是不同無性系在不定芽分化、生根能力上有很大差異；9號(hào)無性系的不定芽增殖能力相對(duì)較強(qiáng)，平均增殖系數(shù)達(dá)到5.6個(gè)/外植體，是無性系科瑞克的1.9倍；9號(hào)無性系的生根能力相對(duì)最好，生根率為41.7%；6-BA濃度為4.0 mg/L時(shí)，多數(shù)無性系不定芽增殖較好；6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)更適于不定芽的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：薄殼山核桃；組織培養(yǎng)；增殖系數(shù)；無性系；生根能力

中圖分類號(hào)： S664.104+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0047-03

薄殼山核桃[Carya illinoensis（Wangenh. ） K. Koch.]別稱美國(guó)薄殼山核桃、長(zhǎng)山核桃，世界著名干果之一，原產(chǎn)北美，為胡桃科山核桃屬雌雄同株植物，花單性，雌雄異熟[1]，是優(yōu)良的果材兼用樹種[2]。我國(guó)于19世紀(jì)末20世紀(jì)初開始引種美國(guó)山核桃，目前種植范圍比較廣，干果深受消費(fèi)者歡迎。薄殼山核桃豐產(chǎn)性與品種密切相關(guān)，主要靠本砧嫁接擴(kuò)繁。但是，嫁接繁殖需要大量砧木，且技術(shù)要求高、人工成本大，同時(shí)受到季節(jié)限制，不利于快速擴(kuò)繁良種種苗。組織培養(yǎng)快繁是保持薄殼山核桃優(yōu)良性狀、加快其繁殖的有效手段，可促進(jìn)薄殼山核桃的推廣和利用。目前，國(guó)外學(xué)者開展薄殼山核桃組織培養(yǎng)研究相對(duì)較早，并取得一些進(jìn)展，但尚未建立成熟的再生體系[3-5]。Mathews等利用未成熟胚成功誘導(dǎo)出薄殼山核桃體細(xì)胞胚，但未能實(shí)現(xiàn)增殖和生根[6]；Phillips等用薄殼山核桃實(shí)生幼苗的頂芽和腋芽為外植體分化出不定芽，但繼代困難、重復(fù)性差[7]；Burns等以8個(gè)薄殼山核桃品種的未成熟胚為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)現(xiàn)，除植物激素等培養(yǎng)條件外，外植體基因型是影響再生體系建立的關(guān)鍵因素，品種Schley的體細(xì)胞誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于其他7種供試材料[8]；Renukdas等以薄殼山核桃Desirable和Cape Fear 2個(gè)品種的試管無菌苗為材料誘導(dǎo)莖段腋芽分化，并建立了植株再生體系[9]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)薄殼山核桃組織培養(yǎng)研究主要集中于外植體脫毒及腋芽分化[10-11]，而由于成年大樹外植體脫毒困難，未能實(shí)現(xiàn)其無菌培養(yǎng)。

本試驗(yàn)收集9種薄殼山核桃品種或優(yōu)良單株種子，培育半同胞子代實(shí)生幼苗，以帶腋芽莖段為外植體，研究不同品種子代、不同激素濃度對(duì)薄殼山核桃不定芽分化及植株再生的影響，以期探討薄殼山核桃組織培養(yǎng)再生過程的影響因子，為其擴(kuò)繁提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1 外植體的構(gòu)建 科瑞克（Creek）、波尼（Pownee）、馬罕（Mahan）、碧根源3號(hào)（Bigenyuan 3）的種子，采自江蘇省常州市金土地農(nóng)牧科技服務(wù)有限公司的薄殼山核桃果園內(nèi)；結(jié)合南京市實(shí)生大樹優(yōu)選，收集優(yōu)良薄殼山核桃種子，1號(hào)、5號(hào)采自中國(guó)科學(xué)院南京中山植物園內(nèi)，6號(hào)采自江蘇省南京市雨花臺(tái)景區(qū)內(nèi)，8號(hào)、9號(hào)采自江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院內(nèi)。2014年1月14日進(jìn)行播種，采取恒溫培養(yǎng)箱30 ℃催芽；出芽后育苗盤移植，置于室溫25 ℃的溫室內(nèi)生長(zhǎng)，日光燈為光源照射16 h/d；剪取帶腋芽莖段作為外植體材料（圖3-a）。

1.1.2 培養(yǎng)基 選用WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L。在此基礎(chǔ)上，添加NAA 0.01 mg/L、6-BA 0.5 mg/L作為芽誘導(dǎo)及伸長(zhǎng)培養(yǎng)基；添加NAA 0.5 mg/L、6-BA 1.0～5.0 mg/L作為芽增殖培養(yǎng)基；添加IBA 0.5～5 mg/L、活性炭3.0 g/L作為生根培養(yǎng)基。培養(yǎng)基pH值均為5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

待溫室幼苗長(zhǎng)至7～8 cm時(shí)，切取1.0～1.5 cm莖段，作為起始外植體；流水沖洗30 min，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇消毒30 s；用0.1 mg/L HgCl2消毒6 min，無菌水沖洗4次；接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，后續(xù)試驗(yàn)以分化的無菌芽為材料。每處理15個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件：溫度為（25±2） ℃，光照度為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為16 h/d。培養(yǎng)30 d進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel、DPS軟件進(jìn)行處理，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同無性系腋芽萌發(fā)和生長(zhǎng)的差異

由表1可見，薄殼山核桃不同無性系子代在腋芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)上有明顯的差異；9號(hào)無性系子代的腋芽萌發(fā)率相對(duì)最高，為97.8%，與1號(hào)無性系的腋芽萌發(fā)率差異不顯著，與其他無性系的腋芽萌發(fā)率差異顯著；最低的為馬罕子代，腋芽萌發(fā)率為65.7%，其他無性系均在70%以上；腋芽生長(zhǎng)量最大的為5號(hào)無性系，平均腋芽長(zhǎng)為4.2 cm，單芽最長(zhǎng)達(dá)5.2 cm；腋芽生長(zhǎng)量最小的為碧根源3號(hào)，平均腋芽長(zhǎng)為2.1 cm，且生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)較弱，與其他無性系差異顯著。

2.2 不同6-BA濃度對(duì)不同無性系子代芽增殖的影響

由圖1可見，在一定濃度范圍內(nèi)，隨6-BA濃度的增加，薄殼山核桃子代不定芽的分化數(shù)呈增加趨勢(shì)；對(duì)碧根源3號(hào)而言，6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)芽的增殖數(shù)相對(duì)最多，平均為3.4個(gè)/外植體；6號(hào)無性系芽增殖數(shù)相對(duì)最多時(shí)6-BA濃度為3.0 mg/L；其他7個(gè)無性系芽增殖數(shù)相對(duì)最多時(shí)6-BA濃度為4.0 mg/L，其中9號(hào)無性系的芽增殖數(shù)最多，平均為5.6個(gè)/外植體。由圖2可見，無性系1號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、波尼具有相同的變化趨勢(shì)，芽長(zhǎng)與6-BA濃度呈負(fù)相關(guān)；馬罕、無性系6號(hào)分別在6-BA濃度為3.0、2.0 mg/L時(shí)芽長(zhǎng)達(dá)到最大，后隨6-BA濃度的增加而芽長(zhǎng)減??；隨6-BA濃度的增加，科瑞克、碧根源3號(hào)的芽長(zhǎng)表現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢(shì)；6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，5號(hào)、9號(hào)無性系的芽生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)較好，芽長(zhǎng)分別為4.1、4.0 cm，且最為健壯。方差分析結(jié)果表明，薄殼山核桃芽分化數(shù)量與芽長(zhǎng)在不同6-BA濃度間、不同無性系間均存在極顯著性差異（表2）。

2.3 不同IBA濃度對(duì)組培苗生根的影響

將不定芽轉(zhuǎn)移至低濃度6-BA培養(yǎng)基上過渡生長(zhǎng)，當(dāng)不定芽長(zhǎng)至3～4 cm時(shí)剪下，將4個(gè)無性系轉(zhuǎn)移至添加不同質(zhì)量濃度IBA的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由表3可見，添加不同質(zhì)量濃度IBA的生根培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)科瑞克等4個(gè)無性系生根，但不同無性系所需的最佳IBA濃度及不同無性系的生根能力均存在差異；低濃度IBA不能誘導(dǎo)科瑞克生根，當(dāng)IBA濃度為5.0 mg/L時(shí)才能生根；IBA濃度3.0 mg/L時(shí)，波尼、6號(hào)的無性系生根率相對(duì)較高，分別為23.9%、37.9%；隨IBA濃度的增加，9號(hào)無性系的生根率逐漸增加；參試的4個(gè)無性系中，9號(hào)無性系的生根能力相對(duì)最強(qiáng)，IBA濃度為5.0 mg/L時(shí)，生根率高達(dá)41.7%；薄殼山核桃屬于直根系樹種，側(cè)根生長(zhǎng)能力相對(duì)較差，4個(gè)無性系的生根數(shù)均相對(duì)較少，在1～4個(gè)之間（圖3-d）。

3 結(jié)論與討論

無性繁殖是短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)薄殼山核桃良種種苗工廠化繁育的理想手段。目前，薄殼山核桃已有成功建立體胚發(fā)生的報(bào)道[6，8]，但是低分化率、低生根率限制了通過此方法建立植株再生體系。Renukdas等曾報(bào)道以薄殼山核桃試管無菌苗誘導(dǎo)莖段腋芽分化成功建立植株再生體系[9]，但由于成熟胚脫毒進(jìn)瓶污染率較高而限制了外植體來源數(shù)量，進(jìn)一步影響在生產(chǎn)中的應(yīng)用。筆者以成熟種子培育的幼苗為材料，大大增加了外植體數(shù)量，同時(shí)也減少了脫毒過程的污染，研究結(jié)果表明，薄殼山核桃9個(gè)無性系子代都具有腋芽萌發(fā)能力，可通過組織培養(yǎng)再生植株，但是不同無性系子代在不定芽分化、生根能力上有很大差異；各無性系芽增殖數(shù)在2.9～5.6個(gè)/外植體之間，9號(hào)無性系子代的不定芽增殖能力相對(duì)較強(qiáng)，科瑞克相對(duì)最差，9號(hào)無性系不定芽的增殖能力是無性系科瑞克的1.9倍；9號(hào)無性系子代的生根能力也相對(duì)較好，生根率達(dá)到41.7%，但生根率不是很高。這種差異說明薄殼山核桃的芽增殖能力與生根能力可能受遺傳因素影響較大。

工廠化繁育薄殼山核桃良種苗木需要從優(yōu)良品種植株上采集外植體，而大樹外植體滅菌較為困難，傅玉蘭等研究不同滅菌方法在薄殼山核桃當(dāng)年生帶芽莖段無菌培養(yǎng)體系建立中的效果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過暗培養(yǎng)、70%乙醇浸泡30 s、0.2% HgCl2處理15 min等措施可將無菌率提高到95%[12]，但未見無菌材料獲取及后續(xù)擴(kuò)繁體系建立的報(bào)道。筆者前期在大樹外植體脫毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HgCl2濃度過高或浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，都會(huì)嚴(yán)重影響腋芽的萌發(fā)，造成無菌材料獲取失敗?？偟膩砜矗ㄟ^組織培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)薄殼山核桃的體外植株再生，但要實(shí)現(xiàn)工廠化快繁還須進(jìn)一步摸索培養(yǎng)條件以提高生根效率和成苗率。

參考文獻(xiàn)：

[1]Benucci G M，Bonito G，F(xiàn)alini L B，et al. Mycorrhization of pecan trees （Carya illinoinensis） with commercial truffle species：Tuber aestivum Vittad. and Tuber borchii Vittad.[J]. Mycorrhiza，2012，22（5）：383-392.

[2]Grauke L J，Starr J L. Phenotypic screening of pecan seedling rootstocks in search of nematode resistance[J]. Trees，2014，28（5）：1333-1341.

[3]陳 芬，姚小華，高煥章，等. 薄殼山核桃不同無性系開花物候特性觀測(cè)和比較[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2015，28（2）：209-216.

[4]Hansen K C，Lazarte J E. In vitro propagation of pecan seedlings[J]. HortScienee，1984，19（2）：237-239.

[5]Kamal P，Kamal S K. In vitro germination of pecan（Carya illinoinensis）embryo[J]. Biharean Biologist，2010，4（1）：37-43.

[6]Mathews H，Wetzstein H Y. A revised protocol for efficient regeneration of somatic embryos and acclimatization of plantlets in pecan，Carya illinoensis[J]. Plant Science，1993，91（1）：103-108.

[7]Phillips G C，Corte Olivares J，Butler N S A. Micropropagation of pecan[J]. HortScience，1990，25（10）：1308.

[8]Burns J A，Wetzstein H Y. Development and characterization of embryogenic suspension cultures of pecan[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1997，48（2）：93-102.

[9]Renukdas N N，Mahoharan M，Gamer J O. In vitro propagation of pecan[Carya illinoinensis（Wangenh） K. Koch][J]. Plant Biotechnology，2010，27（2）：211-215.

[10]Hassanen S A，Gabr F M. In vitro rooting of pecan[Carya illinoensis （Wangenh.） K. Koch][J]. World Applied Sciences Journal，2013，21（3）：315-319.

[11]董筱昀，蔣澤平，蔣 春，等. 薄殼山核桃試管離體培養(yǎng)中不定芽誘導(dǎo)及增殖技術(shù)的研究[J]. 江蘇林業(yè)科技，2013，40（3）：10-14.

[12]傅玉蘭，谷 鳳，吳 煒，等. 美國(guó)山核桃組培中材料滅菌的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，31（2）：169-172.王一諾，黃雪彥，李 磊，等. 高山石斛再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：50-52.