張蕊馨 齊 彥 周迎春

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院·150040）

中藥多糖提取測(cè)量研究進(jìn)展*

張蕊馨 齊 彥**周迎春

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院·150040）

目的：對(duì)中藥糖的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。方法：查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)中藥多糖提純工藝、含量測(cè)定等方面進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果：中藥多糖可用用合理的工藝提取，適宜的方法測(cè)定。結(jié)論：可為中藥多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

中藥多糖 提純工藝 含量測(cè)定

多糖及糖復(fù)合物存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)。因此，中藥多糖在生命科學(xué)、藥物研究中的研究意義深遠(yuǎn)。

1 中藥多糖的提取、分離和純化概述

1.1 提取工藝概述

多糖是極性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇。常用的方法有水提法、酸提法、堿提法、超聲提法、微波提法等。

1.1.1 水提法 提取多糖最常用的方法之一是用水來(lái)作溶劑。植物多糖采用熱水浸提法提取較適宜，提取得到的溶液可直接分離不溶物，用濃度高的乙醇沉淀提純亦可；還可以利用乙醇濃度的不同，分級(jí)分離多糖的不同組分。梁婷婷等[1]研究了水提醇沉提取太子參多糖的最佳工藝條件。雖然水提法不需特殊設(shè)備，成本低等，但費(fèi)時(shí)且提取效率低。

1.1.2 酸提法 對(duì)一些特定的植物多糖提取，用稀酸提取能獲得更高的提取率。但為避免引起多糖中糖苷鍵的斷裂，需嚴(yán)格控制酸度。孟憲元等[2]利用稀酸提取得純度較高茜草多糖。

1.1.3 堿提法 為了得到更高的提取率，可在堿液中提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。李平等[3]利用堿法提取山茱萸多糖，得褐色山茱萸粗多糖。但為避免有些多糖在堿性較強(qiáng)時(shí)發(fā)生水解,堿的濃度應(yīng)合理控制。

1.1.4 超聲提取法 為了使提取的有效成分易于溶解于溶劑之中，可利用能產(chǎn)生“空化作用”及其次級(jí)效應(yīng)的超聲波，使生物細(xì)胞和組織易于破碎；這樣可大大加速了萃取過(guò)程，有利于被提取成分的生物活性盡量保持不變。胡斌杰[4]等利用超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖。發(fā)現(xiàn)超聲波法提取時(shí)間較傳統(tǒng)熱水法縮短3/4，而提取率高30%。

1.1.5 微波提取法 不同的物質(zhì)，微波吸收能力也不同，因此，吸收微波能力強(qiáng)的基體中某些物質(zhì)，或萃取體系中的某種組分，會(huì)被加熱，從基體或體系中分離出來(lái)，這是微波提取法的機(jī)制。劉青梅進(jìn)行了紫菜多糖微波提取的影響因素研究。表明影響微波浸提的主要因素為浸提時(shí)間、微波功率和液固質(zhì)量比。

1.1.6 生物酶解提取法 生物酶的特點(diǎn)是具有高度專(zhuān)一性，若作為浸提輔助劑，有利于中藥植物的細(xì)胞壁降解或水解，從而易于提取細(xì)胞內(nèi)有效成分。但是，中藥多糖用酶解法提取，對(duì)反應(yīng)的溫度以及pH值等參數(shù)的要求嚴(yán)苛，需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合理參數(shù)。張弛[5]等利用酶法技術(shù)提取板黨多糖，以纖維素酶提取的最優(yōu)工藝為：酶用量120U/g干粉、pH4.0、溫度40℃、酶解時(shí)間150min，提取率為28.22%。

1.2 分離和純化概述

1.2.1 多糖的分離 （1）除蛋白質(zhì)：游離蛋白質(zhì)在多糖中的去除方法依據(jù)多糖的類(lèi)型而異，對(duì)于微生物類(lèi)多糖的分離常用Sevag法及三氟三氯乙烷法處理，對(duì)于植物類(lèi)多糖分離的可用三氯醋酸法處理；而對(duì)于糖肽類(lèi)，則需用酶破壞蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合再去除。

（2）除色素：多糖提取過(guò)程中常伴隨氧化作用，會(huì)產(chǎn)生色素，而多糖的含量測(cè)定時(shí)，色譜分析的準(zhǔn)確性會(huì)受到色素干擾。因此需要除去色素，常用方法有活性炭吸附法、離子交換法、氧化劑氧化法等。

（3）除小分子雜質(zhì)：去除小分子雜質(zhì)，常用超濾和透析的方法。若要將多糖樣品按分子大小分級(jí)，可選用不同規(guī)格的超濾膜和透析袋進(jìn)行，或一定條件下的超速離心操作來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1.2.2 多糖的純化 （1）沉淀法：利用在不同濃度低級(jí)醇、酮中，多糖溶解度不同的性質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)分級(jí)沉淀。李卷梅[6]等用乙醇分級(jí)沉淀法純化香薷多糖。向多糖提物中依次加入6組體積分?jǐn)?shù)分別為20%～70%的乙醇，純化后得香薷多糖組分HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6，糖含量中等。

依據(jù)不同鹽濃度中，不同多糖溶解度不同，而將多糖分離稱(chēng)鹽析法。氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等常用作鹽析劑,其中硫酸銨效果最佳。而對(duì)于各種不同酸性多糖，可通過(guò)控制季胺鹽的濃度分離得到。何偉珍[7]等對(duì)用季銨鹽沉淀法純化銀耳粗多糖。加2%CTAB溶液于提取液可得純化產(chǎn)率37.4%的精品銀耳多糖，且多糖含量由50.5%增加到76.28%。

常用斐林試劑、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等作絡(luò)合劑與多糖形成金屬絡(luò)合物而沉淀分離，也是一種有效的方法。

（2）柱層析法：選擇不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液，作為洗脫劑，采用葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠的柱層析法，可分離純化大小不同的多糖分子。但處理粘多糖效果不佳。

為了處理各種酸性、中性多糖和粘多糖，可選擇不同濃度堿型和硼砂型兩種洗脫劑，采用DEAE-纖維素和ECTEOLA-纖維素的陰離子交換劑柱層析法，其過(guò)程中能夠吸附雜質(zhì)而達(dá)到部分純化的效果。

（3）其他方法：若按多糖的電荷性質(zhì)不同分級(jí)，可采用區(qū)域電泳法純化多糖。聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳是比較常用的方法。

2 中藥多糖含量測(cè)定概述

2.1 多糖測(cè)定方法

2.1.1 比色法 目前苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法應(yīng)用最廣。多糖含量的比色測(cè)定法，其作用機(jī)制是多糖在濃硫酸的作用下先被水解成單糖，然后生成糖醛衍生物，再與苯酚或者葸酮縮合產(chǎn)生有色化合物。這里利用了吸收值與糖濃度存在的線(xiàn)性關(guān)系，在一定濃度范圍內(nèi)和適當(dāng)波長(zhǎng)下，可以通過(guò)比色測(cè)定其含量。梁麗軍[8]等用蒽酮-硫酸法建立大蒜多糖的含量測(cè)定方法。

2.1.2 滴定法 滴定法的作用機(jī)制是在酸性環(huán)境及適宜溫度下，可以水解經(jīng)乙醇沉淀分離后的多糖成單糖，然后使用次甲基藍(lán)指示劑，對(duì)標(biāo)定過(guò)的堿性酒石酸銅溶液進(jìn)行滴定，測(cè)量樣液體積的消耗量，以此計(jì)算其含量多少。該方法速度快,無(wú)需精密儀器，適用于所有多糖，但是，滴定法伴隨著還原反應(yīng)，還原糖會(huì)影響其結(jié)果。陳廣東[9]等采用高錳酸鉀滴定法快速測(cè)定肝速康膠囊中云芝多糖的含量。表明了高錳酸鉀滴定法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

2.1.3 薄層色譜法 薄層色譜是利用樣品組分的差異與吸附劑之間的吸附力不同，而且其分配系數(shù)在展層溶劑中亦不相同，從而使混合物出現(xiàn)分離。薄層層析的特點(diǎn)是樣品需要量較少，設(shè)備操作簡(jiǎn)便，分離效果好。王亞娟[10]等建立了雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定烏靈膠囊中多糖含量的方法。結(jié)果顯示該方法測(cè)定烏靈膠囊中多糖的含量，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

2.1.4 高效液相色譜法（HPLC法) HPLC法既能測(cè)定樣品中多糖的含量，也能測(cè)量分子量分布。HPLC作用機(jī)制是選用TSK、SW凝膠排斥色譜柱，以分子量不同的標(biāo)準(zhǔn)右旋糖酐作標(biāo)準(zhǔn)，在示差折光檢測(cè)器中檢測(cè)經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理的樣品。HPLC法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如分析快速、選擇性強(qiáng)、分離效能高、靈敏度高等。強(qiáng)靜等[12]采用HPLCELSD法測(cè)定多糖的含量。其條件為：漢邦KromasilC18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫30℃；流動(dòng)相為(5:95)；流速0.8ml/min；檢測(cè)器漂移管溫度115℃；進(jìn)樣量20μl；分析時(shí)間5min。

2.1.5 氣相色譜法(GC法) 若要既定性又定量分析多糖的組分及含量，就選用GC法。該方法的操作是先用鹽酸-甲醇把多糖酸水解物或甲醇解物，再用三氟乙?；?TFA)轉(zhuǎn)化為乙酰化產(chǎn)物，或者三甲基硅烷基化(TMS)轉(zhuǎn)化為硅烷化產(chǎn)物，然后用氣相色譜分析處理。吳韶輝[12]等采用三氟乙酸水解豌豆根尖黏液中的多糖。使用氣相色譜分離測(cè)定了衍生化后的6種單糖。

2.1.6 高效毛細(xì)管電泳(HPCE法) 近年來(lái)，人們開(kāi)發(fā)了對(duì)多糖進(jìn)行分析的高效毛細(xì)管電泳法，取得更好的效果。高現(xiàn)朝[13]等采用高效毛細(xì)管電泳法分析百合多糖的單糖組成。表明高效毛細(xì)管電泳法用于分析多糖的組成，精度高，操作方便。

此外，多糖分析還有其他方法可用。而且隨著檢測(cè)儀器愈來(lái)愈先進(jìn)，多糖含量檢測(cè)將變得更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。常靜[14]等利用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)對(duì)不同等級(jí)貴州靈芝的紅外光譜進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明可用紅外光譜法來(lái)預(yù)測(cè)靈芝多糖含量。

2.2 多糖定量測(cè)定方法存在問(wèn)題的解決方法

2.2.1 多糖的提取分離純化問(wèn)題與雜質(zhì)干擾問(wèn)題的解決

對(duì)于還原性雜質(zhì)的干擾，一般的做法是先分別測(cè)定總糖和單糖，再用總糖量減去單糖量的方法排除，但是這種處理無(wú)法從根本上解決雜質(zhì)干擾問(wèn)題。

若要多糖定量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，需要多糖的提取分離純化、雜質(zhì)檢查、純度鑒別，得到無(wú)雜質(zhì)純度高的多糖，再選擇不同的定量測(cè)定方法。

若定量測(cè)定要求不高時(shí)，可以用比色法進(jìn)行測(cè)定精制粗多糖；而當(dāng)定量測(cè)定要求較高時(shí)，精制粗多糖就需要采取多種方法分離純化，獲得純多糖，再進(jìn)行定量測(cè)定才能得到可靠結(jié)果。

2.2.2 設(shè)備問(wèn)題和測(cè)量值與真實(shí)值偏差問(wèn)題的解決

蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量雖然應(yīng)用較多，但是，若測(cè)定復(fù)雜的糖類(lèi)化合物，需改良傳統(tǒng)比色法，才能解決多糖定量測(cè)定中存在的問(wèn)題。此外，若提高中藥多糖測(cè)定的準(zhǔn)確性，也需要應(yīng)用精密儀器在高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等方法中才能滿(mǎn)足要求。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)文獻(xiàn)綜述，旨在為中藥多糖在藥物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供了科學(xué)依據(jù)，相信更多中藥多糖的研究將成為人類(lèi)疾病治療探索中的另一條有效途徑。

[1] 梁婷婷，周英，林冰，等.太子參多糖的水提醇沉工藝研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2013,32(1):79-82.

[2] 孟憲元，刑連宗.茜草多糖的提取與分析[J].北京中醫(yī)，2005，24（1）：35-36.

[3] 李平，王艷輝，馬潤(rùn)宇.堿提山茱萸多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性研究[J].中草藥，2003，11（34）：973-976.

[4] 胡斌杰，陳金鋒，王宮南.超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖的比較研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（2）：190-192.

[5] 張弛，朱玉昌，周大寨.板黨多糖酶法提取研究[J].食品科學(xué)，2008，29（11）：308-311.

[6] 李卷梅，聶少平，李景恩，等.香薷多糖的乙醇分級(jí)純化及其性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2010，31(19):182～185.

[7] 何偉珍，吳麗仙.銀耳多糖的提取分離與純化[J].海峽藥學(xué)，2008,20（7）:33-35.

[8] 梁麗軍,曾哲靈,熊濤,等.蒽酮-硫酸法測(cè)定大蒜多糖含量[J].食品科學(xué),2008,29(9):499.

[9] 陳廣東,劉江,趙正保,等.高錳酸鉀滴定法快速測(cè)定肝速康膠囊中云芝多糖的含量[J].中國(guó)藥房,2006,17(17):1338.

[10] 王亞娟,馮旭東.雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定烏靈膠囊中多糖的含量[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2008,21(1):108.

[11] 強(qiáng)靜,房克慧,劉訓(xùn)紅,等.太子參多糖含量分析及其動(dòng)態(tài)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(9):2238.

[12] 吳韶輝,蔡妙珍,李似姣,等.柱前衍生化氣相色譜法分析豌豆根尖黏液中的多糖[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào),2009,37(3):429.

[13] 高現(xiàn)朝, 馬宏偉.HPCE法分析百合多糖的單糖組成[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2009, 15(8):27.

[14] 常靜, 唐延林, 劉子恒, 等.靈芝多糖含量的紅外光譜預(yù)測(cè)模型研究.光譜實(shí)驗(yàn)室, 2010, 27 (2):677.

黑龍江省中醫(yī)藥管理局基金資助項(xiàng)目（ZHY10-Z45）

** 通訊作者:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·哈爾濱 150040