齊光輝 王凱

曲阜師范大學體育科學學院（山東曲阜 273165）

心肌縫隙連接蛋白43在運動預處理不同保護時相表達變化的比較研究

齊光輝 王凱

曲阜師范大學體育科學學院（山東曲阜 273165）

目的：比較大鼠心肌縫隙連接蛋白43（Cx43）mRNA和蛋白在運動預處理（EP）早、晚期保護時相的表達變化。方法：SD大鼠32只隨分為對照組（C組）、力竭運動組（EE組）、早期運動預處理+力竭運動組（EEP+EE組）和晚期運動預處理+力竭運動組（LEP+EE組）。在建立EP和EE動物模型基礎(chǔ)上，用原位雜交和實時熒光定量PCR方法觀察和檢測心肌Cx43 mRNA表達，用免疫組織化學和Western免疫印跡方法觀察和檢測心肌Cx43蛋白表達。結(jié)果：與EE組相比，EEP+EE和LEP+EE組心肌Cx43 mRNA和蛋白水平顯著升高。與EEP+EE組相比，LEP+EE組心肌Cx43原位雜交信號沒有顯著變化，Cx43 mRNA表達也沒有顯著性差異。與EEP+EE組相比，LEP+EE組心肌Cx43免疫陽性反應(yīng)無明顯變化，Cx43蛋白表達也沒有顯著性差異。結(jié)論：運動預處理早、晚期保護時相分別促進了心肌Cx43 mRNA和蛋白的表達，但在這兩個保護時相之間，Cx43 mRNA和蛋白的表達沒有明顯差異，表明心肌Cx43在介導運動預處理早、晚期心肌保護效應(yīng)中的表達變化規(guī)律和運動預處理早、晚期保護時相的變化具有同步性。

運動預處理；縫隙連接蛋白43；心??；大鼠；保護時相

運動預處理（exercise preconditioning，EP）作為運動干預手段，一方面能夠誘導減輕心肌缺血再灌注（ischemic-reperfusion，I/R）損傷的保護效應(yīng)[1，2]，另一方面能誘導減輕力竭運動致運動性心肌損傷的心肌保護效應(yīng)[3-5]，并且EP心肌保護效應(yīng)分為早期保護效應(yīng)（ear?ly exercise preconditioning，EEP）和晚期保護效應(yīng)（late exercise preconditioning，LEP）兩個時相，前者在預處理隨后就發(fā)生，時間約為1～3 h。后者在預處理后12 h發(fā)生，24～48 h達到高峰，并能夠持續(xù)24～72 h[6]。

EP心肌保護效應(yīng)的內(nèi)在機制可能涉及到信號轉(zhuǎn)導通路的中介物質(zhì)或效應(yīng)物質(zhì)的表達分布及活化。心肌縫隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）是心肌保護效應(yīng)中的一種重要的效應(yīng)物質(zhì)。心肌縫隙連接（gap junc?tion，GJ）是將相鄰心肌細胞進行連接的細胞內(nèi)通道，主要由效應(yīng)物質(zhì)心肌Cx43構(gòu)成，并且該物質(zhì)在心肌保護效應(yīng)信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)運動引起心肌Cx43表達明顯升高[7，8]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，EP引起了心肌Cx43蛋白水平明顯升高[9]。但是，關(guān)于心肌Cx43在EP早、晚期不同心肌保護時相中表達變化的比較研究未見相關(guān)報道。本研究旨在通過比較心肌Cx43 mRNA和蛋白在EP早、晚期保護時相中的表達變化，為深入探討EP早、晚期心肌保護效應(yīng)機制提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立

選用體重約256±13 g的健康雄性SD大鼠32只作為實驗對象，采購于山東中醫(yī)藥大學實驗中心，許可證號：0013594，實驗動物合格證號：Scxk（魯）2013001。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，5只/籠，均以標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由飲食飲水。室溫20～22℃，相對濕度45%～50%，光照時間12 h/d。大鼠在0°跑臺連續(xù)進行5 d適應(yīng)性訓練，速度15 m/min，時間 10～20 min。在適應(yīng)性訓練后休息1 d，將32只大鼠隨機分為對照組（control group，C組）、力竭運動組（exhaustive exer?cise group，EE組）、早期運動預處理+力竭運動組（ear?ly exercise preconditioning + exhaustive exercise group，EEP+EE組）和晚期運動預處理+力竭運動組（late exercise preconditioning+ exhaustive exercise group，LEP+EE組）。參照Shen等[3，4]的文獻報道及我們前期的研究成果[5]，建立EP和EE模型。

C組不進行跑臺運動，EE組以35 m/min的速度運動至力竭，致大鼠運動性心肌損傷。EEP和LEP組進行一次速度為28～30 m/min、運動10 min、休息10 min、重復4次的間歇跑臺運動，建立EP模型。EEP+EE和LEP+EE組在上述EP基礎(chǔ)上，分別在30 min和24 h后再以35m/min的速度運動至力竭。

1.2 取材與處理

在建模結(jié)束30 min后，分別對C組、EE組、EEP+ EE組和LEP+EE組取材。實驗程序如下：腹腔麻醉大鼠并取出大鼠心臟。一部分心臟經(jīng)預先冷卻的滅菌生理鹽水清洗，置于液氮中速凍后，放置于－80℃冰箱保存，用于心肌Cx43 mRNA和蛋白表達的檢測。另一部分心臟進行原位灌注后，用于觀察心肌Cx43 mRNA和蛋白表達分布情況。

1.3 心肌CCxx4433 mmRRNNAA原位雜交實驗

切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水、漂洗、胃蛋白酶消化后，加原位雜交預雜交液進行預雜交孵育，滴加含有地高辛標記的寡核苷酸探針的雜交液進行雜交孵育，用SSC進行漂洗，滴加血清封閉液進行封閉并于恒溫箱內(nèi)孵育，滴加SABC進行孵育后，再滴加生物素化過氧化酶進行孵育并DAB顯色、蘇木素復染及鹽酸酒精分化。然后進行脫水透明、封片、觀察及攝片。合成的心肌Cx43 mRNA探針序列如下所示：5’-TCTCT CACGT GCGCT TCTGG GTCCT TCAGA TCATA-3’；5’-CT?CA TCCAG TGGTA CATCT ATGGG TTCAG CTT?GA G-3’；5’-AACAA TTCCT CGTGC CGCAA TTA?CA ACAAG CAAGC-3’。Cx43原位雜交試劑盒和DAB顯色試劑購買于武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 心肌CCxx4433 mmRRNNAA表達測定

采用實時熒光定量PCR方法檢測Cx43 mRNA表達。心肌組織加入Trizol試劑勻漿，進行總RNA的提取，用樣品RNA進行cDNA合成，合成的cDNA用于實時定量PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系由10×PCR緩沖液、Taq聚合酶、PCR特異引物F和R、2×ROX Reference Dye及cDNA組成。反應(yīng)程序為：（95℃，3 min），1個循環(huán)；（95℃，15 sec；59℃，20 sec；72℃，20 sec；82.5℃，20 sec），40個PCR循環(huán)。在ABI 7900 Realtime PCR儀上進行定量PCR的檢測。采用TANON凝膠圖像分析系統(tǒng)進行圖像處理，并以目的基因/GAPDH mRNA電泳條帶吸光度來表示Cx43 mRNA結(jié)果。Cx43和內(nèi)參GAPDH的序列位置見表1。

表1 心肌Cx43與GAPDH序列和擴增片段

1.5 心肌CCxx4433的定位表達

柑橘產(chǎn)量與氣溫、降水量呈顯著正相關(guān)；與日照時數(shù)呈極顯著負相關(guān)。需要加強研究柑橘各發(fā)育期氣象因子與柑橘產(chǎn)量的關(guān)系，掌握柑橘生長發(fā)育期對氣溫、降水、日照的需求，有效利用氣象條件，防范氣象災(zāi)害，結(jié)合生產(chǎn)實際，加強果園管理，提高柑橘產(chǎn)量與品質(zhì)。

采用免疫組織化學SABC法，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、漂洗、孵育、山羊血清封閉及孵育后，滴加一抗（1∶200，兔抗鼠Cx43），孵育，置于室溫并經(jīng)PBS漂洗，滴加生物素化二抗（1∶200，羊抗兔IgG），于37℃溫箱內(nèi)孵育，滴加SABC，孵育、顯色、脫水、透明及封片。

1.6 心肌CCxx4433蛋白表達檢測

采用western blot方法，取心肌組織低速勻漿并進行15 min離心后，取上清待用，加入電泳緩沖液煮沸、上樣、電泳，進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并將轉(zhuǎn)移后的膜置于室溫封閉，再進行免疫反應(yīng)，分別加入Cx43和GAPDH一抗（1∶5000和1∶10000，兔抗鼠。Cx43，購于武漢博士德生物工程有限公司。GAPDH，購于上?？党缮锕こ坦荆Ｏ茨ず蠹尤攵梗?∶5000，羊抗兔），室溫震蕩孵育，充分洗膜并進行顯色。心肌Cx43的蛋白水平用Cx43蛋白灰度值/GAPDH灰度值的相對比值表示。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較采用One-way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌CCxx4433原位雜交實驗觀察

心肌Cx43原位雜交結(jié)果如圖1所示，C組原位雜交信號呈棕褐色分布于心肌細胞胞漿之中。與EE組相比，EEP+EE和LEP+EE組原位雜交信號增強，而EEP+ EE和LEP+EE組相比，原位雜交信號沒有明顯差異。

圖1 各組大鼠心肌Cx43原位雜交結(jié)果（×400）

2.2 心肌CCxx4433實時熒光定量PPCCRR檢測

心肌Cx43實時熒光定量PCR結(jié)果如圖2所示。與EE組相比，EEP+EE和LEP+EE組水平升高，且具有統(tǒng)計學意義（2.12±0.18 vs.1.51±0.15；2.19±0.29 vs.1.51±0.15，P＜0.05），而EEP+EE和LEP+EE組相比沒有顯著性差異（2.12±0.18 vs.2.19±0.29，P＞0.05）。

圖2 各組大鼠心肌Cx43 mRNA表達水平比較

心肌Cx43免疫組織化學實驗結(jié)果如圖3所示。C組免疫陽性反應(yīng)呈棕褐色桿狀或小斑點狀分布于心肌細胞閏盤處和心肌細胞側(cè)-側(cè)處，以閏盤處較多；與EE組相比，EEP+EE和LEP+EE組免疫陽性反應(yīng)增強。而EEP+EE和LEP+EE組相比，免疫陽性反應(yīng)無顯著差異。

圖3 各組大鼠心肌Cx43免疫組織化學結(jié)果（×400）

2.4 心肌CCxx4433免疫印跡檢測

心肌Cx43免疫印跡結(jié)果如圖4所示。與EE組相比，EEP+EE和LEP+EE組水平升高，且具有統(tǒng)計學意義（0.51 ± 0.08 vs.0.30 ± 0.10；0.51 ± 0.27 vs.0.30±0.10，P＜0.05）。而LEP+EE組和EEP+EE組相比沒有顯著性差異（0.51±0.08 vs.0.51±0.27，P＞0.05）。

圖4 各組大鼠心肌Cx43蛋白水平比較

3 討論

3.1 運動預處理心肌保護效應(yīng)

Murry等[10]研究發(fā)現(xiàn)，缺血預處理（ischemic pre?conditioning，IP）能夠誘導減輕缺血性心肌損傷的保護效應(yīng)，并且，IP心肌保護效應(yīng)分為第一保護時相（first window of protection，F(xiàn)WOP）和第二保護時相（second window of protection SWOP）。FWOP作為早期發(fā)生的保護效應(yīng)，通常在IP后即刻發(fā)生，并能持續(xù)約2～3 h，而SWOP是在IP后12～24 h發(fā)生，并能持續(xù)約72～90 h的晚期保護效應(yīng)[11，12]。

EP作為一種預處理的手段，也能夠誘導減輕心肌損傷的保護效應(yīng)。與IP心肌保護效應(yīng)分為FWOP和SWOP兩個保護時相相類似，EP心肌保護效應(yīng)分為EEP和LEP兩個保護時相。Domenech等[6]研究發(fā)現(xiàn)，EP誘導產(chǎn)生了減輕心肌I/R損傷心肌梗塞面積的早、晚期兩個時相的保護效應(yīng)。Babai等[13]研究發(fā)現(xiàn)，EP可以誘導產(chǎn)生減輕心肌I/R損傷引發(fā)的室性心律失常的早、晚期兩個時相的保護效應(yīng)。Shen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，EP可以誘導產(chǎn)生減輕異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）導致的心肌損傷，對ISO所致心肌損傷產(chǎn)生早、晚期保護效應(yīng)。以上研究表明，EP能夠誘導產(chǎn)生減輕心肌I/R損傷心肌梗塞面積、心律失常等早、晚期兩個時相心肌保護效應(yīng)。本課題組參照Domenech等[6]和Shen等[3，14]文獻報道的運動方案建立運動預處理和力竭運動模型，研究發(fā)現(xiàn)，EP誘導了減輕力竭運動導致的急性心肌損傷的早、晚期保護效應(yīng)[5]。

以上研究表明，EP一方面能夠誘導產(chǎn)生減輕缺血性心肌損傷的早、晚期保護效應(yīng)，另一方面能夠誘導減輕運動性心肌損傷的早、晚期保護效應(yīng)。在EP誘導減輕心肌損傷的保護效應(yīng)中，涉及到的信號轉(zhuǎn)導通路主要包括觸發(fā)物質(zhì)-中介物質(zhì)-效應(yīng)物質(zhì)，其中中介物質(zhì)主要包括蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和蛋白激酶A等；效應(yīng)物質(zhì)主要包括ATP敏感鉀通道、熱休克蛋白和縫隙連接蛋白等離子通道和效應(yīng)蛋白[15]。

根據(jù)以上分析可知，EP減輕心肌損傷保護效應(yīng)的機制可能是運動作為一種預處理的刺激引起中介物質(zhì)的活化，進一步調(diào)控了效應(yīng)物質(zhì)的活化或增強了其表達水平，從而誘導了減輕運動性心肌損傷的早、晚期保護效應(yīng)[16，8]。但是，在EP心肌保護效應(yīng)中，具體是哪一種或哪些物質(zhì)介導了早、晚期保護效應(yīng)，尚需進一步探討。

3.2 縫隙連接蛋白4433在運動預處理早、晚期保護時相的表達變化

心肌Cx43是形成縫隙連接通道的主要蛋白成分，在心肌保護效應(yīng)信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮重要作用。IP保護效應(yīng)影響了心肌缺血損傷時心肌Cx43的表達和分布，可能是因為IP改變了缺血時心肌Cx43的磷酸化狀態(tài)而達到保護缺血心肌的作用，而心肌Cx43磷酸化狀態(tài)維持的機制可能是通過IP引起心肌線粒體ATP敏感鉀通道開放或激活PKC激酶的活性來實現(xiàn)的。EP心肌保護效應(yīng)也能夠促進心肌Cx43的表達，心肌Cx43在EP誘導的心肌保護效應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用[9]。但是對心肌Cx43在EP早、晚期兩個保護時相中的表達變化比較的研究尚未涉及。本實驗進一步比較了心肌Cx43 mRNA和蛋白在EP早、晚期保護時相中的表達變化，結(jié)果顯示，運動性心肌損傷后Cx43 mRNA明顯下降，在EP誘導的早期和晚期保護效應(yīng)中，Cx43 mRNA表達明顯上升，而EP的兩個保護效應(yīng)相比較，Cx43 mRNA的表達未見明顯變化。心肌Cx43蛋白的表達和Cx43 mRNA的表達相類似，在EP誘導的早期和晚期保護效應(yīng)中，Cx43蛋白的表達明顯上升，而早、晚期不同保護時相相比較，Cx43蛋白的表達未見明顯變化。

心肌Cx43是心室肌細胞之間電流的主要導體[17]，對心肌縫隙連接通道正常電偶聯(lián)功能、心臟正常電活動和協(xié)調(diào)心臟舒縮功能有重要影響[18]。研究表明，心肌缺血時，氧自由基增加、鈣超載及酸中毒等因素可導致心肌Cx43和心肌縫隙連接通道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而引起電脫偶聯(lián)，這是誘發(fā)缺血性心律失常的重要因素[19]。李玉光等[20]研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血時，引起心肌Cx43降解，并且心肌端-端連接處的降解比側(cè)-側(cè)連接處的降解更為明顯，端-端連接處心肌Cx43的明顯減少會導致心臟縱向傳導速度明顯下降，使心肌傳導速度的各向異性發(fā)生改變，這些改變是導致心肌傳導阻滯和折返傳導，誘發(fā)心律失常發(fā)生的根本原因。Beardslee等[21]研究發(fā)現(xiàn)，心肌組織隨缺血情況的加重可能發(fā)生心肌Cx43磷酸化水平下降而去磷酸化水平升高，認為心肌Cx43的去磷酸化和細胞內(nèi)的ATP水解互為因果，因此影響了細胞間電偶聯(lián)，導致傳導異常和形成折返性心律失常。

除了心肌缺血能夠影響心肌Cx43的表達外，有研究發(fā)現(xiàn)，過度訓練能夠影響心肌Cx43的表達變化，引起心肌側(cè)-側(cè)連接處電偶聯(lián)增多，端-端連接處電偶聯(lián)減少，并且發(fā)生分布紊亂現(xiàn)象[7]。在心臟中，心臟脈沖的傳導速度存在著各向異性，當各向異性低時，正常情況下有序化的心臟收縮和舒張功能會被破壞，發(fā)生折返性的幾率增大，較容易發(fā)生心房顫動和心律失常。過度訓練引起心肌損傷的機制可能是連接蛋白構(gòu)型變化增加了橫向傳導，降低了各向異性傳導的能力，使傳導速度減慢，增加了傳導折返環(huán)形成的幾率，誘使心律失常的發(fā)生。因為連接蛋白正常構(gòu)型是心臟傳導的解剖學基礎(chǔ)，有研究結(jié)果表明，在病理條件下，伴隨著心衰程度的加重，連接蛋白發(fā)生端-端連接減少，側(cè)-側(cè)連接增加的構(gòu)型改變。心肌脈沖傳導速度減慢，形成折返傳導的幾率加大，隨著心衰程度的進一步加重，連接蛋白發(fā)生降解和蛋白量減少，引起心肌傳導阻滯加重，進而誘發(fā)心律失常[22]。

以上因心肌缺血和過度訓練對心肌Cx43的影響及所誘發(fā)的心律失常的機制可能相一致，并且因心肌缺血和過度訓練所引起的心肌Cx43的表達變化與我們前期的研究結(jié)果相吻合[23]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律性的運動訓練也能夠影響心肌Cx43的表達變化，田振軍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動引起心肌Cx43表達的升高及其分布構(gòu)型的變化。Bellafiore等[8]研究發(fā)現(xiàn)，耐力運動在引起心肌Cx43表達增加的同時，導致了心肌毛細血管面積明顯增加，表明心肌Cx43的表達變化參與了心肌微脈管的重塑過程。同時我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，運動性心肌損傷引起了心肌Cx43蛋白水平明顯降低，而EP在一定程度上維持了心肌Cx43蛋白的表達水平[9]。以上研究表明，過度訓練和力竭運動能夠引起心肌Cx43的表達下降，而EP及其規(guī)律性運動可以維持該蛋白的表達及分布。

本研究發(fā)現(xiàn)心肌Cx43 mRNA和蛋白在EP早、晚期不同保護時相中的表達明顯上升，且該蛋白的表達變化時間和EP早、晚期保護時相相一致。心肌Cx43蛋白表達的增加及表達的重新分布通過改變心肌縫隙連接通道的構(gòu)型，進一步影響了心肌細胞電偶聯(lián)及電生理特性，從而減輕了運動性心肌損傷。以上心肌Cx43蛋白不但在EP早期保護時相中發(fā)揮了心肌保護效應(yīng)，也在EP晚期保護時相中發(fā)揮了心肌保護效應(yīng)，表明EP早期保護時相和晚期保護時相都能夠通過促進心肌Cx43的表達而誘導心肌保護效應(yīng)。這提示在EP誘導的減輕力竭運動所致運動性心肌損傷的早、晚期保護效應(yīng)中，心肌Cx43作為一種效應(yīng)物質(zhì)介導了此心肌保護效應(yīng)。而心肌Cx43在EP的早期保護效應(yīng)和晚期保護效應(yīng)相比較未見明顯差異，表明心肌Cx43在介導運動預處理早、晚期心肌保護效應(yīng)中的表達變化規(guī)律和運動預處理早、晚期保護時相的變化具有同步性。

心肌Cx43作為EP心肌保護通路的效應(yīng)物質(zhì)，是公知的磷酸化蛋白，其C-末端絲氨酸殘基有許多磷酸化位點，受多種蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)。心肌Cx43介導EP早、晚期保護效應(yīng)的機制可能受到PKC的調(diào)控。Yu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PKC的活化一方面引起了心肌Cx43蛋白表達增加，同時還引起了該蛋白表達分布及構(gòu)型的變化。Miura等[25]研究發(fā)現(xiàn)，可以通過激活PKC激酶以維持心肌Cx43磷酸化水平，關(guān)閉縫隙連接通道，從而減少死亡因子的擴散來發(fā)揮縮小心肌梗塞面積的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PKC能夠引起心肌Cx43具體位點的變化從而導致該蛋白構(gòu)象變化。Bao等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PKC引起了心肌Cx43在S368位點的磷酸化，從而導致該蛋白構(gòu)型發(fā)生變化，并進一步影響到縫隙連接通道，引起該通道通透性降低。Ek-Vitorin等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PKC引起的心肌Cx43在S368位點的磷酸化參與了心肌縫隙連接通道對選擇滲透性的調(diào)控。以上研究提示，可能是PKC直接磷酸化心肌Cx43羧基末端區(qū)域的S368位點，導致單通道電導功能發(fā)生變化，進而降低細胞間通訊聯(lián)系并影響心肌細胞保護效應(yīng)。

根據(jù)我們的研究，EP能維持心肌Cx43蛋白的表達，在運動性心肌損傷過程中維持心肌Cx43的含量，減少其脫磷酸化，從而保持其構(gòu)成的心肌縫隙連接通道的基本結(jié)構(gòu)，減少橫向傳導，增加了各向異性傳導的能力，使傳導速度加快，減少傳導折返環(huán)形成的幾率，在一定程度上減少運動性心肌損傷的發(fā)生。以上研究只對PKC能夠調(diào)控心肌Cx43的表達進行了探討，而進一步的研究發(fā)現(xiàn)，不管是在EP早期心肌保護效應(yīng)還是晚期保護效應(yīng)中，PKC都影響了心肌Cx43的表達及分布[28]。并且，也有研究發(fā)現(xiàn)，在EP早期和晚期心肌保護效應(yīng)中，δPKC的蛋白表達升高[14]，表明δPKC的蛋白表達變化和EP早期和晚期保護時相的變化相一致。同時δPKC的蛋白表達升高與我們研究中心肌Cx43在EP早、晚期保護時相中的表達升高以及PKC調(diào)控了EP早、晚期保護時相中的心肌Cx43的表達結(jié)果相吻合。這提示PKC作為一種重要的中介物質(zhì)，對EP早、晚不同心肌保護時相中效應(yīng)物質(zhì)心肌Cx43的表達具有調(diào)控作用。從而也證實了PKC調(diào)控心肌Cx43的表達和運動預處理早、晚期保護時相的變化相一致。

正是PKC的調(diào)控，引起心肌Cx43表達升高和分布構(gòu)型發(fā)生變化，從而介導了減輕運動性心肌損傷保護效應(yīng)。PKC的亞型較多，到底是哪一種亞型參與了對心肌Cx43在S368位點的磷酸化尚需作進一步探討。除了PKC能夠調(diào)控心肌Cx43的表達外，影響該蛋白表達分布的因素很多，該蛋白可能還受到其他中介物質(zhì)的調(diào)控，或者也可能是因為心肌Cx43和其他效應(yīng)物質(zhì)之間的相互作用引起了該蛋白的表達變化，從而介導了減輕運動性心肌損傷的保護效應(yīng)。心肌Cx43在EP不同保護時相表達變化的機制尚需深入探討。

4 結(jié)論

運動預處理早、晚期保護時相分別促進了心肌Cx43 mRNA和蛋白的表達，但在這兩個保護時相之間，Cx43 mRNA和蛋白的表達沒有顯著性差異，表明心肌Cx43在介導運動預處理早、晚期心肌保護效應(yīng)中的表達變化規(guī)律和運動預處理早、晚期保護時相的變化具有同步性。

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Comparative Study on the Expression of Myocardial Connexin 43 in Different Cardioprotection Stages of Exercise Preconditioning

Qi Guanghui，Wang Kai
College of Sports Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China

Wang Kai，Email：wangkai-liaoda@163.com

ObjectiveTo compare the expression of myocardial connexin 43（Cx43）mRNA and its pro?tein during early and late cardioprotection stages of exercise preconditioning.MethodsThirty-two Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group，an exhaustive exercise（EE）group，an early exercise preconditioning+exhaustive exercise（EEP+EE）group and a late exercise preconditioning +exhaustive exercise（LEP+EE）group，each of 8.All groups were given intervention as their group name indicated.Then in situ hybridization and real-time fluorescent quantitative PCR methods were used to detect the changes of myocardial Cx43mRNA and immunohistochemical method and Western blotting were used to detect the changes of Cx43 protein.ResultsCompared with EE group，there was significant increase in Cx43 mRNA and its protein expression in group EEP+EE and LEP+EE.Com?pared with EEP+EE group，no significant changes was found in situ hybridization and Cx43 Immunoreac?tivity in LEP+EE group，neither did significant differences in the expression of Cx43 mRNA and its pro?tein.ConclusionEEP and LEP can significantly promote the expression of myocardial Cx43 mRNA and its protein respectively.However there is no significant changes of myocardial Cx43 mRNA and protein expression between the 2 time phases.It demonstrates that the expression of Cx43 in the early and late stage of myocardial protective effect was consistent with the changes of the early and latephase of the protective effect of EP.

exercise preconditioning，connexin43，myocardial，rats，protection phase

2016.01.25

中國博士后科學基金資助（編號：2014M560538）

王凱，Email：wangkai-liaoda@163.com