向玉勇， 徐中秋， 柴新義

(滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州 239000)

金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌分離與鑒定

向玉勇， 徐中秋， 柴新義

(滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州 239000)

金銀花尺蠖是近年來新發(fā)現的金銀花主要食葉害蟲之一，在河南、山東、安徽等地均有分布。為了解金銀花尺蠖幼蟲腸道環(huán)境中的細菌種類，對金銀花尺蠖幼蟲腸道中的細菌進行分離、純化和培養(yǎng)，獲得3個細菌菌株，對菌株的培養(yǎng)性狀、染色反應、菌體形態(tài)、生理生化反應進行系統(tǒng)研究。結果表明，它們分別屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。這3種菌株在金銀花尺蠖幼蟲腸道中存在的數量差別很大，其中葡萄球菌屬的數量最大，為6.59×1011個/mL。

金銀花尺蠖；腸道細菌；分離；鑒定

動物的腸道系統(tǒng)內寄居著數量巨大的微生物群，動物的生長發(fā)育除受溫度、濕度、光照等環(huán)境因素影響外，還受其腸道系統(tǒng)內的微生物群影響[1-2]。這些微生物群是在與宿主動物協同進化過程中形成的，含有多種酶系統(tǒng)，能參與寄主動物能量和物質代謝，以及遺傳信息運轉等一系列生理過程[3]，因此，對寄主動物的健康生長是有益的。昆蟲是動物界中數量最大的類群，在昆蟲腸道系統(tǒng)中寄居的正常微生物群，是昆蟲機體的生理組成部分，與昆蟲營養(yǎng)生理活動有著密切關系[4]。如有些昆蟲不能直接利用食物中的某些營養(yǎng)成分，必須依靠腸道內微生物的作用才能消化食物，從而促進營養(yǎng)物質的代謝和轉化。腸道微環(huán)境發(fā)生改變，可引起微生物群發(fā)生變化，從而影響昆蟲的生命活動。因此，對昆蟲腸道微生物菌群進行研究，可以通過人為調控打破其腸道微生態(tài)平衡，影響昆蟲的營養(yǎng)生理活動，使其不能正常發(fā)育，從而控制害蟲的發(fā)生危害，對害蟲防治具有十分重要的理論和實踐意義。目前，國內對昆蟲腸道微生物的研究只涉及少數昆蟲[4-7]，昆蟲是動物界中種類最大的類群，不同種類昆蟲甚至同種昆蟲不同蟲態(tài)腸道微生物的種類會存在差異。因此，還必須選擇更多的昆蟲種類加以系統(tǒng)研究，以明確不同種類昆蟲腸道微生物的類群。

金銀花尺蠖(Heterolochajinyinhuaphaga)屬鱗翅目尺蛾科昆蟲，別稱拱腰蟲，是近年新發(fā)現的金銀花主要食葉害蟲之一，在河南、山東、安徽等地已有報道[8-11]。該蟲常將金銀花葉片咬成缺刻或孔洞，甚至將葉片全部吃光，造成金銀花大面積減產，給金銀花生產帶來嚴重損失。目前，國內對金銀花尺蠖的研究主要是關于其生物學特性及防治方面[8-12]，而對其腸道微生物的研究尚未見報道。本試驗對金銀花尺蠖幼蟲的腸道細菌進行分離及鑒定，以了解其幼蟲腸道細菌的種類，為進一步探討腸道細菌對其生命活動的影響奠定基礎，從而為更好地利用微生態(tài)調控技術防治該蟲提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源與培養(yǎng)基

金銀花尺蠖幼蟲采集于安徽省明光市三界鎮(zhèn)，在室內人工氣候箱[光—暗周期為14 h—10 h、溫度為(25±1)℃、相對濕度為(70±7)%]中用新鮮的金銀花葉片飼養(yǎng)，選取大小一致的健康老熟幼蟲作為試驗材料。培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基等[13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸道細菌的分離與純化 取10頭金銀花尺蠖5齡老熟幼蟲，浸泡在75%的乙醇中將其殺死，15 s后取出蟲體放在0.1%氯化汞液中消毒2 min，再用滅菌水清洗，然后在無菌條件下取出消化道稱其質量后用滅菌研缽研磨成勻漿，研磨液用滅菌水稀釋至10-1～10-10。取10-8、10-9、10-10等3個稀釋度用平板稀釋法和涂抹法進行分離，各稀釋度重復3次，分別置于生化培養(yǎng)箱中，在30 ℃下培養(yǎng)72 h。挑取表征各異菌落在NA培養(yǎng)基平板上劃線、純化，然后分別移植斜面培養(yǎng)，并按出現數量依次編號。

1.2.2 腸道細菌的鑒定 將分離純化得到的各細菌菌株進行形態(tài)染色，觀察其培養(yǎng)性狀，并進行生理生化測定，根據文獻[14-15]進行鑒定。

1.2.3 腸道細菌的數量測定 將腸道細菌懸浮液定量稀釋后，取一定量不同稀釋度的細菌懸浮液，在瓊脂平板上培養(yǎng)72 h，選取菌落生長稀疏、適當稀釋度計算菌落數，求出3個重復的平均值。按照以下公式計算出腸道中的細菌數[4]：腸道中的細菌數(個/mL)=平板上菌落數(個)×稀釋倍數/平板上加菌液的量(mL)。

2 結果與分析

通過對金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌進行分離純化，獲得3個細菌菌株，對3個菌株進行鑒定試驗。

2.1 菌體形態(tài)和培養(yǎng)性狀

在NA培養(yǎng)基上將供試菌株培養(yǎng)24 h，經革蘭氏染色法和3% KOH簡易法鑒別，均呈陽性。油鏡下觀察發(fā)現，1個菌株呈球狀，2個菌株呈桿狀。用NA、NB培養(yǎng)基將分離純化的供試菌株經28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察，3個菌株在2種培養(yǎng)基各呈不同的表現(表1)。

表1 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀

2.2 供試菌株生理性狀

從表2可知，經不同溫度、pH值、NaCl濃度下培養(yǎng)，所有供試菌株均在15～42 ℃、pH值5～9、NaCl濃度2%～7%條件下生長良好。在10 ℃低溫下只有3號菌株能夠正常生長；在55 ℃高溫下，只有1號菌株能夠正常生長；pH值=11條件下只有1、2號菌能正常生長；在10% NaCl濃度條件下只有1號菌株可以正常生長。

表2 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌生理性狀

注：“+”表示該條件下菌株擴繁；“-”表示該條件下菌株死亡。

2.3 供試菌株生化性狀

3種菌株均產生氧化酶和過氧化氫酶，能進行淀粉水解和硝酸鹽還原，均能分解利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、海藻糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、肌醇，甲基紅試驗均呈陰性，都不產生吲哚，其他生化項目各異(表3)。

表3 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌生化反應

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.4 菌株鑒定

通過對3個細菌菌株的培養(yǎng)性狀、菌體形態(tài)、染色反應、生理生化性狀等進行試驗，結果表明它們分別屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。由表4可見，金銀花尺蠖幼蟲腸道中各菌株存在的數量差別很大，其中葡萄球菌屬的數量最大，為6.59×1011個/mL。

表4 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌鑒定結果及存在數量

3 討論

與其他動物一樣，昆蟲與共生的腸道微生物之間建立了復雜的協同進化關系，其腸道系統(tǒng)為各種微生物提供適宜的生活環(huán)境，腸道微生物一方面幫助宿主昆蟲消化食物，為昆蟲提供各種營養(yǎng)物質，另一方面可以起著益生素的作用，調控腸道微生物區(qū)系本身之間的平衡，保證昆蟲健康。腸道微生物的類群和數量與昆蟲所取食的食物性質存在密切的關系，不同食性昆蟲腸道環(huán)境中的微生物菌株的種類和數量存在差別。如刺吸植物汁液的斑衣蠟蟬(Lycormadelicatula)成蟲消化道內存在有多黏芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)4種細菌，其中多黏芽孢桿菌數量最多[4]；取食動物性物品和食品的白腹皮蠹(Dermestesmaculatus)成蟲消化道內分布有堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、氣微菌屬(Aeromicrobium)、浸麻芽孢桿菌(Bacillusmacerans)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌和短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)6種細菌，以巨大芽孢桿菌數量最多[7]； 取食植物葉片或莖稈的沙漠蝗腸道中優(yōu)勢菌群為腸桿菌屬和鏈球菌屬[16]。本試驗從金銀花尺蠖幼蟲腸道中分離鑒定出3種細菌，分別為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其中葡萄球菌屬的數量最大。金銀花尺蠖的食性單一，只取食危害金銀花等少數忍冬科植物，消化道對食物消化也比較單一，可能導致腸道中的細菌種類比較少。另外，金銀花是中藥材，含有抑菌作用的活性成分，其活性成分對金銀花尺蠖腸道細菌的影響還有待進一步研究。

為適應中藥材無公害生產的要求，今后還需進一步分析金銀花尺蠖幼蟲腸道主要細菌菌株的功能，并與食物的營養(yǎng)成分進行關聯分析，探討細菌菌群與金銀花尺蠖幼蟲的共生機制，從而通過人工方法改善和調節(jié)腸道微生物的微生態(tài)條件，調控金銀花尺蠖的生長發(fā)育，實現該蟲的生態(tài)控制。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.029

2015-11-21

安徽省高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2012B123)；安徽省高等學校優(yōu)秀青年人才基金(編號：2009SQRZ147)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(編號：201310377018)。

向玉勇(1974—)，男，湖南麻陽人，博士，副教授，主要從事資源昆蟲學及害蟲防治研究。E-mail：xyy10657@sohu.com。

S433.4

A

1002-1302(2017)02-0106-02

向玉勇，徐中秋，柴新義. 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌分離與鑒定[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45(2)：106-108.