季 祥， 喬 巖， 成 杰， 劉鮮艷， 趙昕宇， 鄭添慧， 徐迪華， 蔡 祿

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古包頭 014010)

擬微綠球藻生長(zhǎng)條件優(yōu)化

季 祥1，2， 喬 巖1， 成 杰1，2， 劉鮮艷1， 趙昕宇1，2， 鄭添慧1， 徐迪華1， 蔡 祿1，2

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古包頭 014010)

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)L16(45)，研究不同濃度的N、P、Fe、Mg以及維生素混合液對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，擬微綠球藻最適生長(zhǎng)的條件是f/2培養(yǎng)基中添加0.225 g/L NaNO3、0.015 g/L NaH2PO4·2H2O、0.018 9 g/L FeCl3·6H2O、0.025 g/L MgCl2，1 L維生素混合液體積為0.05 mL。

擬微綠球藻；礦質(zhì)元素；維生素；正交設(shè)計(jì)；生長(zhǎng)條件

擬微綠球藻是一類屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)，近似球形的單細(xì)胞真核生物[1]，具有較高的光合作用效率和油脂含量[2]，長(zhǎng)速度快，適合作水生動(dòng)物的餌料。藻中的多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的影響效果明顯[3-5]。但由于擬微綠球藻易受環(huán)境和不同營(yíng)養(yǎng)鹽等多種條件的影響，其質(zhì)量和產(chǎn)量不穩(wěn)定。在生產(chǎn)過(guò)程中資金投入大，成本高，產(chǎn)量和生物量都較低。針對(duì)這種情況，本研究對(duì)擬微綠球藻的營(yíng)養(yǎng)鹽含量進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，旨在優(yōu)化其生長(zhǎng)條件，以使其能滿足微藻現(xiàn)代化的大批量運(yùn)用。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為擬微綠球藻，內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

采用f/2培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為0.075 g/L NaNO3、0.005 g/L NaH2PO4·H2O；微量元素溶液是由4.16 g Na2EDTA、3.15 g FeCl3·6H2O、0.01 g CuSO4·5H2O、0.022 g ZnSO4·7H2O、0.01 g CoCl2·6H2O、0.18 g MnCl2·4H2O、0.006 g Na2MoO4·2H2O溶于去離子水中，并定容至 1 000 mL，每1 L培養(yǎng)基取1 mL；維生素混合溶液由0.1 g維生素B1、0.005 g維生素B12、0.005 g生物素溶于去離子水中，并定容至1 000 mL，每1 L培養(yǎng)基取1 mL。

培養(yǎng)基中分別添加NaNO3、NaH2PO4·2H2O、FeCl3·6H2O、MgCl2、維生素混合液，以考察不同濃度N、P、Fe、Mg和維生素混合液對(duì)藻生長(zhǎng)影響。NaNO3濃度梯度分別為 0.019、0.038、0.075、0.150、0.225 g/L；NaH2PO4·2H2O濃度梯度分別為0.001、0.003、0.005、0.011、0.017 g/L；FeCl3·6H2O濃度梯度分別為0.000 79、0.001 57、0.003 15、0.006 30、0.009 45 g/L；MgCl2濃度梯度分別為1.245、2.491、4.981、9.962、14.943 g/L；維生素混合液加入體積梯度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL/L。

為研究N、P、Fe、Mg和維生素混合液濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)交互作用，采用5因素4水平正交設(shè)計(jì)，各因素水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaNO3濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

氮源是藻類生長(zhǎng)的限制因子之一。在藻細(xì)胞中，氮是控制光合作用的元素。當(dāng)?shù)床蛔銜r(shí)，光合作用減弱且有利于飽和脂肪酸的合成；但當(dāng)?shù)礉舛冗^(guò)高時(shí)，微藻生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制，不利于飽和脂肪酸的合成[6-7]。硝酸鹽一直是培養(yǎng)擬微綠球藻的一種普通氮源，不同藻類對(duì)氮源的需求量和敏感度不同。NaNO3濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響如圖1所示。NaNO3在較低濃度時(shí)，由于缺少氮源，導(dǎo)致擬微綠球藻的生長(zhǎng)緩慢。在一定范圍內(nèi)，隨著NaNO3濃度的增加，其細(xì)胞數(shù)目呈上升趨勢(shì)。相關(guān)分析表明，NaNO3濃度與擬微綠球藻生物量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，當(dāng)NaNO3的濃度為 0.15 g/L 時(shí)，擬微綠球藻的D680 nm值最高，說(shuō)明在此濃度下其細(xì)胞生長(zhǎng)量最大，生長(zhǎng)狀況最佳。因此，NaNO3最適濃度為 0.15 g/L。

表1 擬微綠球藻生長(zhǎng)環(huán)境因素優(yōu)化L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2 NaH2PO4·2H2O濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

磷元素是構(gòu)成細(xì)胞膜、ATP、DNA和RNA的必需元素[8]，大多數(shù)藻類貯存磷源的方式為主動(dòng)吸收[9]。本試驗(yàn)以NaH2PO4·2H2O作為磷源，對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖2所示。在一定范圍內(nèi)，NaH2PO4·2H2O濃度的增加，促進(jìn)擬微綠球藻對(duì)磷的吸收，其細(xì)胞的內(nèi)含物大量增加，細(xì)胞數(shù)目呈上升趨勢(shì)。相關(guān)分析可知，NaH2PO4·2H2O濃度與擬微綠球藻生物量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，當(dāng)NaH2PO4·2H2O的濃度為0.011 g/L時(shí)，擬微綠球藻的D680 nm值最高，此時(shí)磷對(duì)擬微綠球藻的影響最顯著。

2.3 FeCl3·6H2O濃度對(duì)擬微綠球藻的生長(zhǎng)影響

鐵離子是構(gòu)成藻細(xì)胞內(nèi)一些氧化還原酶的輔基，并能以各種形式與蛋白結(jié)合，鐵元素缺乏會(huì)影響藻類細(xì)胞的正常代謝[10]。FeCl3·6H2O對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖3所示。FeCl3·6H2O濃度較低時(shí)，擬微綠球藻細(xì)胞數(shù)目少，這是因?yàn)榈蜐舛鹊蔫F不利于擬微綠球藻的代謝，隨著鐵濃度的增加，擬微綠球藻細(xì)胞數(shù)目在一定范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，當(dāng) FeCl3·6H2O濃度為0.006 3 g/L時(shí)D680 nm達(dá)到最大值，說(shuō)明在此濃度下最適合擬微綠球藻生長(zhǎng)。

2.4 MgCl2濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

鎂是構(gòu)成葉綠素的必需元素，在葉綠素合成和光合作用中起著重要作用，應(yīng)異常會(huì)影響藻類的生長(zhǎng)[11]。MgCl2對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖4所示。MgCl2濃度與擬微綠球藻生物量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，當(dāng)MgCl2在濃度為1.245～2.491 g/L測(cè)出的D680 nm值較高，且十分接近，隨著MgCl2濃度不斷增加，D680 nm值出現(xiàn)下降趨勢(shì)。表明低濃度的鎂離子促進(jìn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)，高濃度對(duì)擬微綠球藻的生長(zhǎng)起抑制作用。

2.5 維生素混合液濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

維生素是影響微藻生長(zhǎng)的重要因素之一。維生素混合液包括維生素B1、維生素B12和生物素。維生素B1是常用的藻類生長(zhǎng)促進(jìn)劑，維生素B12常作為催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶的輔基。維生素混合液濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖5所示。1 L培養(yǎng)基維生素混合液的體積量在0.5 mL時(shí)，擬微綠球藻的D680 nm值相對(duì)較大，此時(shí)是維持微藻細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳條件。1 L 培養(yǎng)基維生素混合液的體積量在1～3 mL，擬微綠球藻D680 nm值下降幅度大，說(shuō)明這個(gè)階段的維生素混合液對(duì)微藻的生長(zhǎng)有抑制作用。

2.6 5種營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)影響相互作用和優(yōu)化組合

由表2可知，5種因素對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)影響的主次順序?yàn)锽>A>D>E>C，可見(jiàn)B、A為影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素，磷源的質(zhì)量濃度水平對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響最大，其次是氮源質(zhì)量濃度水平對(duì)其生長(zhǎng)的影響。通過(guò)分析5因素的均值可知，5種營(yíng)養(yǎng)鹽最優(yōu)的水平組合為A2B2C4D2E1，即NaNO3濃度為0.225 g/L，NaH2PO4·2H2O濃度為 0.015 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O濃度為0.018 90 g/L，MgCl2濃度為0.025 g/L，1 L維生素混合液體積為0.05 mL。正交試驗(yàn)中NaNO3、NaH2PO4·2H2O的優(yōu)化濃度與單因素試驗(yàn)的結(jié)果較吻合，而鐵、鎂、維生素混合液的最適濃度較單因素試驗(yàn)低。由于正交試驗(yàn)考慮了各因子的交互作用，因此后續(xù)試驗(yàn)均以正交試驗(yàn)的結(jié)果所得培養(yǎng)基配方進(jìn)行藻體培養(yǎng)，以獲得最大生物量。

表2 擬微綠球藻正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7 優(yōu)化后生長(zhǎng)情況測(cè)定

擬微綠球藻在優(yōu)化后的培養(yǎng)基與f/2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)相比，擬微綠球藻在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況良好(圖6)，優(yōu)化后擬微綠球藻的生物量在第4天開(kāi)始超過(guò)f/2培養(yǎng)基。

3 結(jié)論

采用單因素和正交試驗(yàn)，研究了NaNO3、NaH2PO4·2H2O、FeCl3·6H2O、MgCl2以及維生素混合液濃度對(duì)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，擬微綠球藻最佳培養(yǎng)基配方為NaNO30.225 g/L、NaH2PO4·2H2O 0.015 g/L、FeCl3·6H2O 0.018 90 g/L、MgCl20.025 g/L，1 L維生素混合液體積 0.05 mL。優(yōu)化后擬微綠球藻的最大生物量(D680 nm)可達(dá)1.544，是優(yōu)化前的1.35倍。通過(guò)優(yōu)化，提高了擬微綠球藻的生物量，可以滿足微藻現(xiàn)代化的大批量生產(chǎn)。

[1]陳常杰. 海洋微擬球藻microRNA測(cè)序鑒定及其轉(zhuǎn)基因體系的建立[D]. 青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2012.

[2]Jinkerson R E，Radakovits R，Posewitz M C，et，al. Genomic in-sights from the oleaginous model algaNannochloropsisgaditana[J]. Bioengineered，2013，4：37-43.

[3]陳曉琳，劉鏡恪，徐世宏，等. 微粒飼料中魚(yú)油n-3 HUFA的分子結(jié)構(gòu)對(duì)真鯛仔稚魚(yú)生長(zhǎng)、存活的影響[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2004，25(6)：13-18.

[4]劉鏡恪，雷霽霖. 人工調(diào)節(jié)輪蟲(chóng)n-3 HUFA對(duì)黑鯛仔魚(yú)生長(zhǎng)、存活的影響[J]. 科學(xué)通報(bào)，1997，42(12)：1330-1333.

[5]邱小琮，周洪琪，曾慶華，等. 營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的輪蟲(chóng)、鹵蟲(chóng)對(duì)牙鲆仔魚(yú)的成活、生長(zhǎng)及體脂肪酸組成的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2004，23(2)：4-8.

[6]Redfield A C. The biological control of chemical factors in the environment[J]. American Scientist，1958，46：205-221.

[7]黃一江，鄭明剛，孫中濤，等. 不同溫度和N、Fe3+質(zhì)量濃度對(duì)微擬球藻脂肪酸組成及SCD基因表達(dá)的影響[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展，2014，32(1)：92-98.

[8]黃冠華，陳 峰，魏 東，等. 兩步培養(yǎng)法提高蛋白核小球藻的油脂含量[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36(12)：97-101.

[9]華汝成. 單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與利用[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1983：135-137.

[10]Stewart W D P. Algal physiology and biochemistry[M]. London：Black Well Scientific Publications，1974：610-625.

[11]Finkle B J，Appleman D. The effect of magnesium concentration on growth of Chlorella[J]. Plant Physiology，1953，28(4)：664-673.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.046

2015-12-04

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(編號(hào)：2015MS0335)；內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：NJZZ14162)；大學(xué)生創(chuàng)新基金(編號(hào)：2014026)。

季 祥(1978—)，男，內(nèi)蒙古包頭人，副教授，從事生物質(zhì)能、微藻生物技術(shù)研究。E-mail：jixiang@imust.cn。

蔡 祿，教授，博士生導(dǎo)師，從事分子生物學(xué)、生物質(zhì)能源及生物信息學(xué)研究。E-mail：nmcailu@163.com。

S968.41+9

A

1002-1302(2017)02-0154-03

季 祥，喬 巖，成 杰，等. 擬微綠球藻生長(zhǎng)條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：154-156.