李 猛，張恩平，張淑紅，周 芳，王 月，譚福雷，韓丹丹

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

長期不同施肥設(shè)施菜地土壤酶活性與微生物碳源利用特征比較

李 猛，張恩平*，張淑紅，周 芳，王 月，譚福雷，韓丹丹

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

【目的】探討長期不同施肥條件下設(shè)施菜地土壤的酶活性與微生物碳源利用特征，旨在為推進(jìn)耕地建設(shè)與健康質(zhì)量保護(hù)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持?！痉椒ā抗┰囃寥啦勺陨蜿栟r(nóng)業(yè)大學(xué)番茄 28 年定位施肥設(shè)施菜地，選取其中 6 個(gè)處理：N0、N1、N2、MN0、MN1、MN2進(jìn)行分析，其中 M 表示施腐熟馬糞 75000 kg/hm2，N0為不施肥，N1、N2尿素施用量為 652、1304 kg/hm2。采用 Biolog-ECO 法解析了土壤酶活性與微生物碳源利用特征的變化?！窘Y(jié)果】施用有機(jī)肥可以顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀等養(yǎng)分含量，長期單施氮肥可增加土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量，但有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀含量較對(duì)照下降。增施有機(jī)肥可以不同程度地提高土壤酶活性，而單施氮肥導(dǎo)致酶活性降低。增施有機(jī)肥可有效提高土壤微生物對(duì)碳源的利用能力，提高微生物群落功能多樣性，單施氮肥作用相反。具體表現(xiàn)為：菜田微生物對(duì)六類碳源利用能力由高到低依次為氨基酸類、糖類、羧酸類、聚合物類、胺類、酚酸類；其中對(duì) L-絲氨酸、N-乙?；?D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、L-精氨酸、丙酮酸甲脂、吐溫 80、D-纖維二糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露醇利用率較高，而對(duì)α-環(huán)式糊精、2-羥苯甲酸、γ-羥基丁酸基本不利用；31 種碳源對(duì) PC1 和 PC2 貢獻(xiàn)較大的分別有 12 種和 6 種 (|r| ＞ 0.5)。綜合比較，以有機(jī)肥配施一倍量氮肥 (MN1) 處理效果最佳，長期施用可以為設(shè)施菜地微生物創(chuàng)造最適宜的生存環(huán)境，使其保持較高的群落功能多樣性。【結(jié)論】長期不同施肥使得土壤微生物群落形成了不同的碳代謝方式，這是土壤微生物適應(yīng)環(huán)境變化的結(jié)果，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)中“植物–土壤–微生物”互作的結(jié)果。

長期施肥；設(shè)施菜地；土壤酶活性；土壤微生物；碳代謝

土壤酶活性與土壤營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，調(diào)查土壤酶活性強(qiáng)弱，有助于評(píng)判土壤的供肥能力[1]。土壤微生物是土壤生化過程的驅(qū)動(dòng)力，是物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的主體[2]。施肥是影響土壤質(zhì)量演化及其可持續(xù)利用最為深刻的農(nóng)業(yè)措施之一[3]。施肥對(duì)林地和大田土壤酶活性和微生物群體的影響研究較多[4–7]，對(duì)設(shè)施土壤的研究主要集中在微生物類群[8–9]和主要功能菌群[10–11]，對(duì)施肥條件下設(shè)施菜田微生物碳源利用特征的報(bào)道較少。本研究以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)連續(xù) 28 年長期定位施肥的設(shè)施菜田土壤為研究對(duì)象，分析了菜田土壤微生物碳源利用特征，并結(jié)合土壤酶活性揭示土壤微生物群落對(duì)肥料施用的響應(yīng)規(guī)律，旨在為保持設(shè)施菜田土壤健康和積極推進(jìn)耕地質(zhì)量的保護(hù)與建設(shè)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。在土壤中廣泛存在且對(duì)土壤肥力培育起重要作用的是氧化還原酶類和水解酶類[12]，本研究中共選擇測定了2 種氧化還原酶 (過氧化氫酶、多酚氧化酶) 和 4 種水解酶 (轉(zhuǎn)化酶、熒光素二乙酸酯酶、脲酶、中性磷酸酶)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試土壤取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄長期定位施肥試驗(yàn)菜田，試驗(yàn)地位于遼寧省沈陽市沈河區(qū) (北緯41°31′、東經(jīng) 123°24′)，屬北溫帶半濕潤大陸性氣候，降水集中在夏季，全年降水量 600～800 mm，夏季時(shí)間較短，冬寒時(shí)間較長，近 6 個(gè)月，年平均氣溫 6.2～9.7℃，年日照時(shí)間為 2517 h，全年無霜期為 150 d 左右。土壤類型為草甸土，試驗(yàn)始于 1988年，此時(shí)耕層養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì) 24.30 g/kg，全氮1.164 g/kg，堿解氮 86.41 mg/kg，速效磷 70.80 mg/kg，速效鉀 56.14 mg/kg，交換性鹽基總量 14.56 cmol/kg，pH 值 6.75。至 1996 年秋季之前一直為露地栽培試驗(yàn)，從 1997 年春至今為設(shè)施栽培試驗(yàn)。設(shè)施栽培前2 年為茄子，后一直為番茄，品種為‘遼園多麗’。

本研究選取其中的 6 個(gè)處理進(jìn)行試驗(yàn)，分別為：N0、N1、N2、MN0、MN1、MN2。M 表示施有機(jī)肥 (腐熟馬糞) 75000 kg/hm2，N0表示不施氮肥，N1、N2表示尿素施用量為 652、1304 kg/hm2。每處理 3次重復(fù)，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。有機(jī)肥于定植前一次性施入，氮肥在生長季節(jié)內(nèi)分 2 次追施，為防止肥料相互滲透影響，將每個(gè)小區(qū)建成 0.8 m 深的無底水泥池，面積為 1.5 m2(1 m × 1.5 m)。

試驗(yàn)從 2015 年 1 月 15 日持續(xù)到 2016 年 1 月 10日，春茬于 2015 年 3 月 18 日定植，8 月 3 日拉秧，調(diào)查了土壤理化性質(zhì)和酶活性；秋冬茬于 2015 年 8月 28 日定植，2016 年 1 月 10 日拉秧，研究了土壤微生物的碳源利用狀況。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

采用 5 點(diǎn)取樣法采集 0—20 cm 土壤，清除表層雜草及凋落物，混合制樣，置于室內(nèi)自然風(fēng)干后過篩保存。參照鮑士旦[13]的方法測定：有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定；銨態(tài)氮含量采用 2 mol/LKCl 浸提靛酚藍(lán)比色法測定；硝態(tài)氮含量采用酚二磺酸比色法測定；速效磷含量的測定采用 0.5 mol/L NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法；速效鉀含量的測定采用 NH4OAc 浸提—火焰光度計(jì)法；土壤含水量采用烘干法測定。

1.3 土壤酶活性測定

取樣方法同 1.2。參照嚴(yán)昶生[12]和李振高等[14]的方法測定：過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定；多酚氧化酶活性采用沒食子素比色法測定；轉(zhuǎn)化酶活性采用硫代硫酸鈉滴定法測定；脲酶活性采用苯酚鈉–次氯酸鈉比色法測定；磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定；FDA 水解酶活性采用熒光素比色法測定。

1.4 土壤微生物群落碳代謝的測定與分析

參照李振高等[14]的方法進(jìn)行培養(yǎng)。稱取相當(dāng)于 5 g 烘干土重的新鮮土樣，加入盛有 45 mL 已滅菌的0.85% 生理鹽水錐形瓶中，密封振蕩 0.5 h 后，依次稀釋為 10–2、10–3的梯度液。將 ECO 微平板從冰箱中取出，預(yù)熱到 25℃，將 10–3稀釋液接種到平板中，接種量為每孔 150 μL。將接種好的 ECO 平板加蓋，在 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 168 h，每隔 24 h用 ELISA 自動(dòng)讀數(shù)裝置進(jìn)行讀數(shù)。

土壤微生物群落整體碳代謝能力用 Biolog-ECO微平板的每孔平均吸光值 (average well color development，AWCD) 表示:

AWCD=∑ (C?R)/n

式中，C 為反應(yīng)孔的吸光度，R 為對(duì)照孔的吸光度，n 為碳源的種類 (n = 31)。

以拐點(diǎn) (120 h) 處的 AWCD 值計(jì)算不同施肥處理的香農(nóng)指數(shù) (H)，豐富度指數(shù) (S)，優(yōu)勢度指數(shù) (D)來表征土壤微生物群落功能多樣性。

式中，Pi為第 i 孔相對(duì)吸光度值 (C-R) 與整個(gè)平板相對(duì)吸光度值總和的比率。

表1 各施肥處理下土壤理化狀況Table 1 Soil physical and chemical characters under different fertilization treatments

S 為顏色變化的孔數(shù)，以吸光值 (C?R) ≥ 0.2 的個(gè)數(shù)計(jì)。

基于拐點(diǎn) (120 h) 處土壤微生物對(duì) 31 種單一碳源 (共六類：糖類 10 種，羧酸類 7 種，氨基酸類 6種，聚合物類 4 種，胺類 2 種和酚酸類 2 種) 的利用情況進(jìn)行碳代謝的指紋圖譜分析、主成分分析和聚類分析。指紋圖譜分析有助于全面了解微生物群落碳代謝特征，主成分分析可以明確土壤微生物利用的主要碳源，聚類分析可以清楚直觀地反映各處理間關(guān)系的遠(yuǎn)近。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用 Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初級(jí)統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 18. 0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 ( Oneway ANOVA)、顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期施肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

經(jīng)過 28 年的連續(xù)施肥，各處理理化性質(zhì)如表 1所示?？梢钥闯?，施肥能夠改變土壤理化性質(zhì)，施用有機(jī)肥可以顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀等養(yǎng)分含量，并高于原始值；長期單施氮肥致使三者含量降低，且低于原始水平。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量主要受施氮水平影響，施氮量達(dá)到 N2水平時(shí)，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均顯著高于同等條件下的 N1和 N0處理。單施有機(jī)肥 (M) 較 N2處理可顯著提高土壤水分含量，與其他處理差異不顯著。

2.2 長期施肥對(duì)土壤酶活性的影響

不同施肥處理對(duì) 6 種酶活性產(chǎn)生的影響不同(表 2)。單施有機(jī)肥或與氮肥配施處理的過氧化氫酶、轉(zhuǎn)化酶、熒光素二乙酸酯酶和脲酶活性顯著高于單施氮肥處理，4 種酶活性從施有機(jī)肥到單施氮肥呈下降趨勢，而氮肥與有機(jī)肥配施時(shí)，施氮量對(duì) 4種酶活性無顯著影響，而當(dāng)?shù)蕟问r(shí)，過氧化氫酶和脲酶活性隨施氮量增加而顯著下降。多酚氧化酶活性的變化趨勢不明顯，僅在配施有機(jī)肥時(shí)，隨氮肥投入量的增加逐漸升高；除 MN1和 N1差異不顯著外，各處理之間中性磷酸酶活性均達(dá)顯著差異，表明中性磷酸酶活性對(duì)施肥比較敏感，不同施肥對(duì)其影響顯著。

2.3 土壤微生物群落碳代謝整體能力分析

分析每孔平均吸光值 (average well color development，AWCD) 變化趨勢可以區(qū)分樣品間微生物群落碳代謝能力的差異 。從圖 1 可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，不同處理微生物的碳源利用程度均逐漸增強(qiáng)。在 0～24 h 內(nèi)，各處理 AWCD ＜ 0.1，表明碳源基本未被利用；在 24～96 h 內(nèi)，各處理AWCD 快速增加，表明微生物碳源利用增加；96 h之后，AWCD 增長速率減緩，至 120 h 趨于穩(wěn)定，此時(shí)碳源利用趨于最大。特別的是，N0、N1最先達(dá)到穩(wěn)定期，而 N2的增長速率最低。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，各施肥處理土壤微生物群落的 AWCD 值存在明顯差異。以拐點(diǎn)處 120 h 為例，MN1＞ MN0＞ MN2≥N0≥ N1＞ N2，即配施有機(jī)肥處理高于單施氮肥處理，其中以 MN1最為顯著。單施氮肥將會(huì)導(dǎo)致微生物活性的降低，以 N2最為顯著，比 N0降低了 49%。

表2 不同施肥處理土壤酶活性Table 2 Enzyme activities affected by fertilization treatments

圖1 不同處理平均每孔顏色變化率Fig.1 Average well color development of soil microbial community in different treatments

2.4 土壤微生物碳代謝指紋圖譜分析

Biolog 代謝指紋圖譜是指土壤微生物對(duì)微平板上 31 種碳源的利用能力，通過圖譜分析可以全面了解設(shè)施菜地微生物碳源利用特征 (圖 2、圖 3)。有機(jī)肥配施氮肥處理土壤微生物對(duì)六類碳源的總利用高于單施氮肥處理，以 MN1優(yōu)勢最明顯；在六類碳源中，氨基酸類碳源利用率最高，酚酸類碳源最低，依次為：氨基酸類 ＞ 糖類 ＞ 羧酸類 ＞ 聚合物類 ＞ 胺類 ＞ 酚酸類。具體地，以 AWCDi≥ 0.8 碳源計(jì)：MN0有 13 種 (糖類 4 種，氨基酸類 3 種，羧酸類 3種，聚合物類、酚酸類和胺類各 1 種)，MN1同為 13種 (糖類 3 種、氨基酸類 4 種、羧酸類 3 種、聚合物類 2 種、酚酸類 1 種)，均占總碳源的 41.9%；MN2有 10 種 (糖類 4 種、氨基酸類 3 種、羧酸類 2 種、聚合物類 1 種)，占總碳源的 32.3%；N0有 4 種 (氨基酸類 2 種、羧酸類 1 種、聚合物類 1 種)，占總碳源的 12.9%；N1有 5 種 (糖類 2 種、氨基酸類 2 種、羧酸類 1 種)，占總碳源的 16.1%；N2有 3 種 (糖類 2種、羧酸類 1 種)，占總碳源的 9.7%，表明長期施肥改變了設(shè)施菜地微生物對(duì)碳源的利用能力，增施有機(jī)肥可顯著提高土壤微生物對(duì)碳源的利用率，少量氮肥單施可使微生物碳源利用略有增加，而過量氮肥投入將會(huì)導(dǎo)致微生物碳源利用能力下降。進(jìn)一步分析可知，在 31 種碳源中，設(shè)施菜田土壤微生物對(duì)L-絲氨酸、N-乙?；?D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、L-精氨酸、丙酮酸甲脂、吐溫 80、D-纖維二糖、D-半乳糖醛酸和 D-甘露醇利用率較高，而對(duì) α-環(huán)式糊精、2-羥苯甲酸、γ-羥基丁酸基本不利用。

圖2 長期施肥土壤微生物碳代謝指紋圖譜 (120 h)Fig.2 The fingerprint of soil microbial biomass carbon metabolism in different treatments

圖3 長期施肥條件下土壤微生物對(duì)六類碳源的總體利用狀況 (120 h)Fig.3 The overall utilization of six kinds of carbon sources in different treatments

圖4 長期施肥土壤微生物碳代謝主成分分析和聚類分析Fig.4 The principal component analysis and cluster analysis of soil microbial biomass carbon metabolism in the long term fertilization

2.5 土壤微生物碳代謝主成分分析與聚類分析

利用培養(yǎng) 120 h 的 AWCD 值，對(duì)長期施肥設(shè)施菜田土壤微生物利用單一碳源的特性進(jìn)行主成分分析和聚類分析 (圖 4)。由圖 4a 可知，碎石圖曲線從第 10 個(gè)因子開始變得比較平緩 (特征根 ≤ 1)，應(yīng)用主成分分析，在 31 個(gè)因子中共提取 10 個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到 90.24%。其中第一主成分(PC1) 的特征根為 7.204，方差貢獻(xiàn)率為 23.238%，第二主成分 (PC2) 特征根為 4.42，方差貢獻(xiàn)率為14.257%；第三主成分 (PC3) 特征根為 3.753，方差貢獻(xiàn)率為 12.106%。其余 4～10 主成分的貢獻(xiàn)率均小于 10%。選取 PC1 和 PC2 分析不同施肥處理微生物碳源利用情況 (圖 4b)，不同施肥處理的碳源利用在PC 軸上差異顯著。MN1、MN2位于 PC1 的正端；N0、N1、N2位于 PC1 的負(fù)端；MN0位于 PC1 的中段。在PC2 上，各處理基本分布在中段位置，僅 MN2明顯的分布在負(fù)端。進(jìn)一步分析 31 種碳源在 PC1、PC2上的載荷值 (表 3)，載荷值越高表示對(duì)應(yīng)碳源對(duì)主成分的影響越顯著。從表 3 可知，以|r| ＞ 0.5 計(jì)，對(duì)PC1 貢獻(xiàn)較大的碳源有 12 種，主要包括糖類 3 種、氨基酸類 4 種、羧酸類 1 種、聚合物類 2 種、酚酸類和胺類各 1 種；對(duì) PC2 貢獻(xiàn)較大的有 6 種，主要包括糖類 2 種，氨基酸類、羧酸類、聚合物類、酚酸類各 1 種。

聚類分析可以探究各施肥處理間碳代謝的遠(yuǎn)近關(guān)系，以組間平均聯(lián)接的樹狀圖來表示 (圖 4c)。從該圖中可以發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理的碳源利用方式可以聚為 2 類、3 類或 4 類。在 3 種分類方法中，MN1均單獨(dú)聚為一類，表明 MN1施肥處理下菜地微生物已經(jīng)形成了獨(dú)特的碳源代謝方式。以聚為 3 類為例，除 MN1外，N2也單獨(dú)聚為一類，N0、N1、MN0、MN2等處理的土壤微生物碳源代謝方式相似，表明長期施肥改變了微生物的碳代謝方式。

表3 不同碳源在 PC1 和 PC2 上的載荷值 (|r| ＜ 0.4 的數(shù)值未顯示)Table 3 Correlation analysis of different carbon source utilization with PC1 and PC2 (the values of |r| ＜ 0.4 are not shown)

綜合上述分析，在 PC1 上，有機(jī)肥配施氮肥處理土壤微生物對(duì)?-甲基 D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸鹽、I-赤藻糖醇、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、α-丁酮酸、吐溫 80、苯乙基胺、4-羥基苯甲酸、α-環(huán)式糊精等 12 種碳源的利用高于單施氮肥的處理；在 PC2 上，MN1處理微生物對(duì)吐溫80、D-木糖、α-D-乳糖、2-羥苯甲酸的利用略高于其它處理，N2處理微生物對(duì) L-精氨酸，D-蘋果酸的利用高于其它處理，而其它 4 個(gè)處理對(duì)上述 6 種碳源的利用情況較為接近。

2.6 土壤微生物群落功能多樣性

通過 AWCD 值 (120 h) 計(jì)算得到微生物功能多樣性指數(shù) (表 4)，發(fā)現(xiàn)增施有機(jī)肥處理微生物的香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)均高于不施肥和單施氮肥處理，但是其常見種的優(yōu)勢度指數(shù)降低，以 MN1最明顯，表明有機(jī)肥配施一倍量氮肥可以提升土壤微生物種類和豐度，弱化某些單一菌群的優(yōu)勢度；單施氮肥處理的優(yōu)勢度最高，但是其香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)最低，表明長期單施氮肥將會(huì)導(dǎo)致土壤中微生物的種類和數(shù)量減少，促使某些適應(yīng)環(huán)境的菌群發(fā)揮出特定的優(yōu)勢，但是其微生物整體代謝功能依然明顯下降。

表4 施肥處理下微生物多樣性指數(shù)Table 4 Diversity indexes of soil bacteria in different treatments at 120 h

3 討論與結(jié)論

土壤酶學(xué)一開始便與土壤肥力的研究緊密結(jié)合在一起，土壤酶活性的高低能夠反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的強(qiáng)弱[12]。研究已經(jīng)證明，土壤酶活性作為土壤肥力的評(píng)價(jià)指標(biāo)是完全可行的，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，單一的酶活性并不能反映出土壤肥力的實(shí)際水平，應(yīng)該綜合考慮那些與土壤肥力直接相關(guān)的、分布最廣泛的土壤酶活性[15–17]。本文共研究了長期施肥條件下 6種土壤酶活性，結(jié)果表明，有機(jī)無機(jī)肥配施可不同程度地提高多種土壤酶活性，而單施化肥將會(huì)導(dǎo)致酶活性的顯著降低，這同高瑞等[18]在黃土和張恩平等[19]在設(shè)施菜田中的研究結(jié)論一致。施肥對(duì)土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的影響基本相似，這可能是土壤酶與土壤理化性質(zhì)關(guān)系密切[20–22]的緣故，因此在實(shí)際生產(chǎn)中可通過增施有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)肥配施來改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤酶活性，提升土地利用效率，同時(shí)減少化肥的施用量。

在土壤微生物方面，有機(jī)肥與無機(jī)肥配施可以增加土壤微生物數(shù)量，增強(qiáng)微生物的活性[6,23]，提高微生物群落功能多樣性[24–25]，在本研究中以 MN1的效果最佳。綜合分析可知，這是有機(jī)肥配施氮肥提高了土壤微生物對(duì)碳源的利用率，增強(qiáng)了土壤微生物整體碳代謝能力 (AWCD)，同時(shí)改變了土壤微生物對(duì)碳源的利用方式和利用能力的緣故，主成分分析表明，施肥對(duì)微生物群落碳代謝影響顯著，對(duì)PC1 貢獻(xiàn)較大的碳源，主要是氨基酸類，對(duì) PC2 主要是糖類。在本研究中，土壤微生物對(duì)氨基酸類碳源的利用率最高，前人的研究結(jié)果[8]表明，長期偏施氮肥使得土壤中好氣性固氮菌、亞硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、氨化細(xì)菌等氮素功能菌群數(shù)量增加。同時(shí)，有研究報(bào)道[26–27]，化肥或秸稈施入將限制土壤中某些細(xì)菌的生長，減少土壤細(xì)菌種類，改變土壤中的優(yōu)勢菌群，使微生物對(duì)碳源的利用多樣性降低，本研究微生物群落功能多樣性指數(shù)證明了該論斷。施肥可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性[28]，因此可推測本研究條件下長期偏施氮肥，使得土壤中氮素積累，氮素轉(zhuǎn)化功能菌成為該施肥條件下的優(yōu)勢菌群，數(shù)量較高且比較活躍。結(jié)合聚類分析，MN1處理土壤微生物已經(jīng)形成了獨(dú)特且最有益的碳源利用方式，偏好碳源為氨基酸類和糖類，長期施用可以為設(shè)施菜地微生物創(chuàng)造最佳的生存環(huán)境，從而使其保持較高的群落功能多樣性；而長期單施氮肥的土壤微生物碳源利用相似，偏好糖類，常見種優(yōu)勢度有所增加，但整體群落功能多樣性顯著降低。此種現(xiàn)象，可能與植物根系分泌物有關(guān)。研究表明，不同的氮素形態(tài)會(huì)對(duì)番茄根系分泌物各組分含量產(chǎn)生影響，以銨態(tài)氮為氮源時(shí)番茄根系分泌的銨態(tài)氮、游離氨基酸、可溶性糖較多[29]，表明施肥類型能夠影響番茄根系物質(zhì)分泌，而分泌物中包含的

糖類、氨基酸、羧酸類在為土壤微生物提供碳源的同時(shí)，其他次生代謝物質(zhì)將對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生選擇塑造作用[30]，此后再通過根際微生物介導(dǎo)影響土壤酶活性[31]，最終推動(dòng)相關(guān)的微生物群落逐漸成為優(yōu)勢菌群，而這種變化正是土壤微生物通過自身調(diào)節(jié)適應(yīng)土壤生態(tài)環(huán)境變化的結(jié)果，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)中“植物–土壤–微生物”互作的結(jié)果。

[1]Dick R P. Soil enzyme activities as integrative indicators of soil health[A]. Pankhurst C E, Doube B M, Gupta V. Biological Indicators of Soil Health[M], 1997, 121–156.

[2]胡亞林, 汪思龍, 顏紹馗. 影響土壤微生物活性與群落結(jié)構(gòu)因素研究進(jìn)展[J]. 土壤通報(bào), 2006, 37(1): 170–176. Hu Y L, Wang S L, Yan S K. Research advances on the factors influencing the activity and community structure of soil microorganism[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2006, 37(1): 170–176.

[3]劉恩科, 趙秉強(qiáng), 李秀英, 等. 長期施肥對(duì)土壤微生物量及土壤酶活性的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 32(1): 176–182. Liu E K, Zhao B Q, Li X Y, et al. Biological properties and enzymatic activity of arable soils affected by long-term different fertilization systems[J]. Journal of Plant Ecology, 2008, 32(1): 176–182.

[4]邱珊蓮, 劉麗花, 陳濟(jì)琛, 林新堅(jiān). 長期不同施肥對(duì)黃泥田土壤酶活性和微生物的影響[J]. 中國土壤與肥料, 2013, (4): 30–34. Qiu S L, Liu L H, Chen J C, Lin X J. Effects of long-term different fertilization on soil enzyme activity and soil microbe in yellow paddy fields[J]. Soil and Fertilizer Sciences in China, 2013, (4): 30–34.

[5]Wertz S, Leigh A K K, Grayston S J. Effects of long-term fertilization of forest soils on potential nitrification and on the abundance and community structure of ammonia oxidizers and nitrite oxidizers[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2012, 79: 142–154.

[6]陸海飛, 鄭金偉, 余喜初, 等. 長期無機(jī)有機(jī)肥配施對(duì)紅壤性水稻土微生物群落多樣性及酶活性的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2015, 21(3): 632–643. Lu H F, Zheng J W, Yu X C, et al. Microbial community diversity and enzyme activity of red paddy soil under long-term combined inorganic-organic fertilization[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2015, 21(3): 632–643.

[7]李旺霞, 陳彥云, 陳科元, 等. 不同覆膜栽培對(duì)馬鈴薯土壤酶活性和土壤微生物的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 28(5): 2154–2157. Li W X, Chen Y Y, Chen K Y, et al. Effects of different filmcovering modes on enzyme activity and edaphon in soil of potato[J]. Southwest China Journal of Agricultural Science, 2015, 28(5): 2154–2157.

[8]張淑紅, 高巍, 張恩平, 李亮亮. 長期定位施氮對(duì)連作番茄土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響[J]. 土壤通報(bào), 2012, 43(1): 60–65. Zhang S H, Gao W, Zhang E P, Li L L. Effect of long-term nitrogen application on culturable microorganisms quantity of tomato continuous cropping[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2012, 43(1): 60–65.

[9]張恩平, 陳聰, 張淑紅, 等. 長期定位施肥對(duì)菜田土壤微生物及酶活性的影響[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 42(6): 672–676. Zhang E P, Chen C, Zhang S H, et al. Effect of long-term fixed fertilization on soil microbe and enzymatic activity[J]. Journal of Shenyang Agricultural University, 2011, 42(6): 672–676.

[10]王亞男, 曾希柏, 俄勝哲, 等. 施肥對(duì)設(shè)施菜地氨氧化細(xì)菌群落和豐度的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 31(12): 2425–2432. Wang Y N, Zeng X B, E S Z, et al. Effects of fertilization treatments on community structure and abundance of ammonia-oxidizing bacteria in greenhouse soil[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2012, 31(12): 2425–2432.

[11]曾希柏, 王亞男, 王玉忠, 等. 施肥對(duì)設(shè)施菜地nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 25(2): 505–514. Zeng X B, Wang Y N, Wang Y Z, et al. Effects of different fertilization regimes on abundance and community structure of the nir-K type denitrifying bacteria in greenhouse vegetable soils[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2014, 25(2): 505–514.

[12]嚴(yán)昶生. 土壤肥力研究方法[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1988. Yan C S. Research methods of soil fertility[M]. Beijing: Agricultural Press, 1988.

[13]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析(第三版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版. 2000. Bao S D. Soil and agricultural chemistry analysis[M]. Beijing: China Agricultural Press, 2000.

[14]李振高, 駱永明, 滕應(yīng). 土壤與環(huán)境微生物研究法[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2008. Li Z G, Luo Y M, Teng Y. Research methods of soil and environmental microorganism[M]. Beijing: Science Press, 2008.

[15]關(guān)松蔭, 張德生, 張志明. 土壤酶及其研究法[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1986. Guan S M, Zhang D S, Zhang Z M. Soil enzyme and its research method[M]. Beijing: Agricultural Press, 1986.

[16]周禮愷. 土壤酶學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1988. Zhou L K. Soil enzymology[M]. Beijing: Science Press, 1988.

[17]Garcia-Ruiz R, Ochoa V, Hinojosa M B, et al. Suitability of enzyme activities for the monitoring of soil quality improvement in organic agricultural systems[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40: 2137–2145.

[18]高瑞, 呂家瓏. 長期定位施肥土壤酶活性及其肥力變化研究[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2005, 13(1): 143–145. Gao R, Lü J L. Study on the enzyme activities and fertility change of soils by a long-term located utilization of different fertilizers[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2005, 13(1): 143–145.

[19]張恩平, 譚福雷, 王月, 等. 氮磷鉀與有機(jī)肥配施對(duì)番茄產(chǎn)量品質(zhì)及土壤酶活性的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2015, 42(10): 2059–2067. Zhang E P, Tan F L, Wang Y, et al. Effects of NPK fertilizers and organic manure on nutritional quality, yield of tomato and soil enzyme activities[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2015, 42(10): 2059–2067.

[20]孫瑞蓮, 趙秉強(qiáng), 朱魯生, 等. 長期定位施肥對(duì)土壤酶活性的影響及其調(diào)控土壤肥力的作用[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2003, 9(4): 406–410. Sun R L, Zhao B Q, Zhu L S, et al . Effects of long-term fertilization on soil enzyme activities and its role in adjusting-controlling soilfertility[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2003, 9(4): 406–410.

[21]邱莉萍, 劉軍, 和文祥, 等. 長期培肥對(duì)土壤酶活性的影響[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2003, 21(4): 44–47. Qiu L P, Liu J, He W X, et al. Effect of long-term fertilization on soil enzymatic activities[J]. Agricultural Research in the Arid Areas, 2003, 21(4): 44–47.

[22]朱美玲, 貢璐, 張龍龍. 塔里木河上游典型綠洲土壤酶活性與環(huán)境因子相關(guān)分析[J]. 環(huán)境科學(xué), 2015, 36(7): 2678–2685. Zhu M L, Gong L, Zhang L L. Soil enzyme activities and their relationships to environmental factors in a typical oasis in the upper reaches of the Tarim River[J]. Environment Science, 2015, 36(7): 2678–2685.

[23]張恩平, 高巍, 張淑紅, 李天來. 長期施肥條件下菜田土壤微生物特征變化[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 28(7): 1288–1291. Zhang E P, Gao W, Zhang S H, Li T L. Effects of long term fertilization on vegetable field soil microbial characteristics[J]. Chinese Journal of Ecology, 2009, 28(7): 1288–1291.

[24]劉晶鑫, 遲鳳琴, 許修宏, 等. 長期施肥對(duì)農(nóng)田黑土微生物群落功能多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 26(10): 3066–3072. Liu J X, Chi F Q, Xu X H, et al. Effect of long-term fertilization on microbial community functional diversity in black soil[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2015, 26(10): 3066–3072.

[25]陳曉芬, 李忠佩, 劉明, 等. 長期施肥處理對(duì)紅壤水稻土微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2015, 34(7): 1815–1822. Chen X F, Li Z P, Liu M, et al. Effect of long-term fertilizations on microbial community structure and functional diversity in paddy soil of subtropical China[J]. Chinese Journal of Ecology, 2015, 34(7): 1815–1822.

[26]劉恩科, 梅旭榮, 趙秉強(qiáng), 等. 長期不同施肥制度對(duì)土壤微生物生物量碳、氮、磷的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 14(3): 63–68. Liu E K, Mei X R, Zhao B Q, et al. Long-term effects of different fertilizer management on microbial biomass C, N and P in a fluvoaquic soil[J]. Journal of China Agricultural University, 2009, 14(3): 63–68.

[27]羅希茜, 郝曉暉, 陳濤, 等. 長期不同施肥對(duì)稻田土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 29(2): 740–748. Luo X Q, Hao X H, Chen T, et al. Effects of long-term different fertilization on microbial community functional diversity in paddy soil[J]. Acta Ecologica Sinica, 2009, 29(2): 740–748.

[28]徐萬里, 唐光木, 葛春輝, 等. 長期施肥對(duì)新疆灰漠土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(2): 468–477. Xu W L, Tang G M, Ge C H, et al. Effects of long-term fertilization on diversities of soil microbial community structure and function in grey desert soil of Xinjiang[J]. Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(2): 468–477.

[29]葛體達(dá), 唐東梅, 蘆波, 等. 番茄根系分泌物、木質(zhì)部和韌皮部汁液組分對(duì)礦質(zhì)氮和有機(jī)氮營養(yǎng)的響應(yīng)[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2008, 35(1): 39–46. Ge T D, Tang D M, Lu B, et al. Influence of organic and inorganic nitrogen supply on the composition of tomato seedling root exudates, xylem and phloem sap grown in hydroponic culture[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2008, 35(1): 39–46.

[30]吳林坤, 林向民, 林文雄. 根系分泌物介導(dǎo)下植物-土壤-微生物互作關(guān)系研究進(jìn)展與展望[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 38(3): 298–310. Wu L K, Lin X M, Lin W X. Advances and perspective in research on plant-soil-microbe interactions mediated by root exudates[J]. Chinese Journal of Plant Ecology, 2014, 38(3): 298–310.

[31]劉善江, 夏雪, 陳桂梅, 等. 土壤酶的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(21): 1–7. Liu S J, Xia X, Chen G M, et al. Study progress on functions and affecting factors of soil enzymes[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(21): 1–7.

Comparison of soil enzyme activities and microbial C metabolism in installed vegetable fields under long-term different fertilization

LI Meng, ZHANG En-ping*, ZHANG Shu-hong, ZHOU Fang, WANG Yue, TAN Fu-lei, HAN Dan-dan
( College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China )

【Objectives】Soil microbial carbon source utilization characteristics under a long-term fertilization in vegetable fields were discussed to reveal the response mechanism of soil microbial community for fertilizing and provide a theoretical basis and data support in maintaining facilities vegetable soil health and actively promoting quality of cultivated land protection and construction.【Methods】The investigation used soil from a 28 years fertilization protected vegetable field experiment in Shenyang Agricultural University, and 6 treatments were chosen, including no fertilization control (N0), organic fertilizer only (MN0) and nitrogen fertilizer plus organic fertilizer (MN1, MN2), nitrogen fertilizer only (N1, N2). Organic manure was horse manure (75000 kg/hm2), N1and N2treatments were urea of 652 kg/hm2、1304 kg/hm2. Biolog ECO-plate methods were used to analyze the soil microbial carbon source utilization characteristics.【Results】Application of organic fertilizer could significantly improve the contents of soil organic matter, available phosphorus and available potassium. Single nitrogen fertilization decreased these contents, but increased ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in soil. The enzymeactivities could be improved by applying organic manure, while the activities under the single application of nitrogen fertilizer were decreased. In terms of carbon source utilization, the application of organic fertilizer could use more soil microbial carbon source than that in single N fertilization. The prior used 6 kinds carbon sources were amino acids, carbohydrates, carboxylic acids, polymers, amines and phenolic acids in turn. The fingerprint analysis showed that soil microorganism in the facility vegetable field could use the following carbon source effectively: L-serine, N-acetyl glucosamine, L-asparagine acid, L-arginine, methyl pyruvate, Tween 80, D-cellobiose, D-galacturonic acid and D-mannitol. In contrast, α-ring cyclodextrins, 2-hydroxy benzoic acid and γhydroxybutyric acid were seldom used. About 12 kinds of carbon source had larger contribution to PC1, and 6 kinds to PC2 (|r| ＞ 0.5).【Conclusion】Comprehensive comparison, the most feasible treatment is the organic fertilizer plus 652 kg/hm2of urea in creating the most suitable living environment for soil microorganisms and maintaining a higher functional diversity of microbial community under the long-term application. Single use of organic manure or over use of nitrogen will offset this effect.

long-term fertilization; protected vegetable field; soil enzyme activity; soil microorganism; carbon metabolism

2016–01–28接受日期：2016–05–26

科技部項(xiàng)目（2013BAD20B08）；遼寧省自然科學(xué)基金（2015020767）資助。

李猛（1991—），男，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事蔬菜栽培與生態(tài)方面的研究。E-mail：806841254@qq.com

* 通信作者 E-mail：zhangep024@163.com