王雪薇，劉 濤，褚貴新

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000）

三種硝化抑制劑抑制土壤硝化作用比較及用量研究

王雪薇，劉 濤，褚貴新*

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000）

【目的】硝化抑制劑是調(diào)控土壤氮素轉(zhuǎn)化與硝化作用微生物群落結(jié)構(gòu)的有效途徑。本文通過(guò)室內(nèi)模擬試驗(yàn)對(duì) 3 種硝化抑制劑在不同劑量下的硝化抑制效果進(jìn)行研究，旨在篩選出效果最佳的劑型與劑量，為石灰性土壤硝化抑制劑的合理應(yīng)用提供依據(jù)?！痉椒ā颗囵B(yǎng)試驗(yàn)在生長(zhǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，25℃ 黑暗條件培養(yǎng)；盆栽試驗(yàn)在溫室內(nèi)進(jìn)行。供試硝化抑制劑為雙氰胺 (DCD)、3, 4-二甲基吡唑磷酸鹽 (DMPP) 和 2-氯-6-三氯甲基吡啶(Nitrapyrin)，DCD 和 DMPP 用量均設(shè)定為純氮（N）量的 0 (CK)、1.0%、2.0%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、6.0% 和 7.0%；Nitrapyrin 用量分別為純氮量的 0、0.1%、0.125%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45% 和 0.5%，三種硝化抑制劑均設(shè) 10 個(gè)水平，每個(gè)水平 3 次重復(fù)。盆栽試驗(yàn)氮加入量為每公斤風(fēng)干土 0.50 g，三種硝化抑制劑用量分別為純氮用量的 5%、1%、0.648%。調(diào)查比較了三者的硝化抑制效果及對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化的影響及其對(duì)小青菜鮮重的生物學(xué)效應(yīng)；采用變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 法分析了不同硝化抑制劑對(duì)土壤AOA、AOB 群落結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】DCD、DMPP、Nitrapyrin 均可顯著抑制土壤硝化作用 (P ＜ 0.05)，各硝化抑制劑處理土壤的 NH4+-N 含量分別較對(duì)照提高了 46.2～256.1 mg/kg、291.8～376.7 mg/kg、3.68～372.9 mg/kg。DCD 與 DMPP 處理的硝化抑制率分別為 49.3%～79.4% 和 96.4%～99.4%，DCD 表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，但 DMPP 在 1%～7% 濃度范圍內(nèi)的劑量效應(yīng)不明顯。Nitrapyrin 在 0.1%～0.2% 濃度范圍內(nèi)有明顯的劑量效應(yīng)。0.25%～0.5% Nitrapyrin 的硝化抑制率為 98.9%～99.9%，其硝化抑制效果與 DMPP 處理相同。DCD、DMPP、Nitrapyrin 處理的小青菜地上部分鮮重分別比氮肥處理 (ASN) 提高了 12.7%、11.1%、17.6%。施用硝化抑制劑可改變土壤 AOA 和 AOB 群落結(jié)構(gòu)，且對(duì) AOA 群落結(jié)構(gòu)的影響大于 AOB，不同硝化抑制劑之間對(duì)AOA 和 AOB 群落結(jié)構(gòu)的影響無(wú)差異?！窘Y(jié)論】3 種硝化抑制劑的硝化抑制效果表現(xiàn)為 Nitrapyrin ≥ DMPP ＞DCD，均對(duì) AOA 與 AOB 群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。各硝化抑制劑處理均可提高小青菜地上部鮮重、葉片 Vc 含量及可顯著提高小青菜葉片氨基酸含量 (P ＜ 0.05)。綜合比較，Nitrapyrin 硝化抑制效果好于 DMPP，DCD 效果最差，推薦用量為基于純氮 0.25% 的 Nitrapyrin 添加量。

硝化抑制劑；石灰性土壤；銨態(tài)氮；硝態(tài)氮；硝化抑制率；氨氧化古菌；氨氧化細(xì)菌

硝化抑制劑 (nitrification inhibitors，NI) 是一類(lèi)抑制硝化過(guò)程的化學(xué)合成或天然的制劑。利用其延緩 NH4+-N 向 NO3–-N 的轉(zhuǎn)化[1]，可提高土壤對(duì)氮的固持，實(shí)現(xiàn)作物銨硝同步供給，達(dá)到改善作物氮素營(yíng)養(yǎng)與提高氮肥利用率的目的[2]。生物硝化抑制劑主要指具有硝化抑制效應(yīng)的氨基酸和氮堿類(lèi)有機(jī)化合物，如印度楝樹(shù)餅、非洲濕生臂形草、十字花科等植物[3]。20 世紀(jì) 50 年代中期以來(lái)化學(xué)合成硝化抑制劑的研究發(fā)展迅速，其主要分為氰胺類(lèi)、含氮雜環(huán)化合物、含硫化合物、烴類(lèi)及其衍生物四大類(lèi)[4]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究最為廣泛的硝化抑制劑有雙氰胺(DCD)、3，4-二甲基吡唑磷酸鹽 (DMPP)、2-氯-6-三氯甲基吡啶 (Nitrapyrin) 等[5]。研究發(fā)現(xiàn)施用Nitrapyrin 可使土壤氮素淋溶損失比對(duì)照降低13%[6]。DCD 和 DMPP 能有效減少 NO3–淋溶和 N2O排放[7]。

氨氧化細(xì)菌 (ammonium-oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌 (ammonium- oxidizing archaea, AOA)是驅(qū)動(dòng)土壤硝化生物過(guò)程的主要微生物群落。孫志梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)施用硝化抑制劑可顯著降低土壤的硝化潛勢(shì)及 AOA 與 AOB 數(shù)量。但不同土壤類(lèi)型、pH等條件下土壤的硝化作用微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性存在很大差異。盡管不同種類(lèi)硝化抑制劑對(duì)土壤 AOA、AOB 的影響已有研究，但從劑型、劑量上把目前幾種主要硝化抑制劑的作用效果及對(duì)土壤氨氧化關(guān)鍵微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)比較的研究尚不多見(jiàn)。

石灰性土壤硝化作用發(fā)生強(qiáng)烈[9]，通過(guò)適量硝化抑制劑結(jié)合氮肥施用可調(diào)控作物根區(qū)氮素供給形態(tài)，提高作物氮肥利用效率。而比較不同硝化抑制劑及其添加劑量對(duì)土壤硝化過(guò)程及其關(guān)鍵微生物群落結(jié)構(gòu)影響是確定合適硝化抑制劑劑型與合理劑量的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)比較雙氰銨 (DCD )、2-氯-6-(三氯甲基) 吡啶 (Nitrapyrin)、3, 4-二甲基吡唑磷酸鹽(DMPP) 三種硝化抑制劑對(duì)土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮?jiǎng)討B(tài)變化、硝化抑制率和表觀硝化率的劑量效應(yīng)，并利用 PCR-DGGE 的方法比較三者對(duì)土壤 AOA、AOB群落結(jié)構(gòu)及對(duì)小青菜氮素營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)的影響，旨在篩選出效果最佳的劑型與劑量，為石灰性土壤硝化抑制劑的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤為灌溉灰漠土 (calcaric fluvisals)，采自新疆石河子莫索灣墾區(qū) 147 團(tuán)，土壤質(zhì)地為壤土，土壤 pH 8.0、有機(jī)質(zhì) 15.8 g/kg、全氮 1.11 g/kg、堿解氮 63.8 mg/kg、速效磷 12.3 mg/kg、速效鉀215.6 mg/kg。新鮮土樣剔除雜物及殘留根系，風(fēng)干后過(guò) 2 mm 篩備用。供試硝化抑制劑為雙氰胺 DCD (dicyandiamide，含量 98.00%，白色晶體，分析純，上海山浦化工有限公司生產(chǎn))、3, 4-二甲基吡唑磷酸鹽 DMPP (3, 4-dimethylpyrazole phosphate，含量97.00%，白色粉末，分析純，美國(guó) J&K 化學(xué)有限公司生產(chǎn))、2-氯-6-三氯甲基吡啶 (nitrapyrin，含量24.00%，淺黃色乳油，浙江奧復(fù)托化工有限公司生產(chǎn))，供試氮肥為硫酸銨 ASN (ammonium sulfate，含量 99.00%，白色晶體)。供試小青菜為黑油小白菜(Brassica campestris L. ssp. chinnesis)。土壤總 DNA的提取采用 PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc. USA)。試驗(yàn)所用引物和 Taq 酶試劑盒均由大連寶生公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 培養(yǎng)試驗(yàn) 設(shè)計(jì) DCD 和 DMPP 用量分別為純氮量的 0 (CK)、1.0%、2.0%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、6.0% 和 7.0%；Nitrapyrin 用量為純氮（N）量的 0、0.1%、0.125%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45% 和 0.5%，均為 10 個(gè)水平，每個(gè)水平 3 次重復(fù)。

供試氮源為硫酸銨 (ASN，含 N 21.21%)，用量為 N 0.5 g/kg，風(fēng)干土。將硫酸銨與各硝化抑制劑按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求溶解于水中，與 1 kg 風(fēng)干土充分混勻，放入 PVC 自封袋，在靠近土壤上方 1 cm 處扎 1橫排通氣小孔 (共 6 個(gè)) 以創(chuàng)造好氣環(huán)境，后置于25℃ 人工氣候室中恒溫黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每天采用稱重法補(bǔ)水 1 次，使土壤含水量保持在田間持水量的 60%～65%。在培養(yǎng)開(kāi)始后的第 2、4、8、10、15、25、30 d 分別取樣，每次取樣 25 g，取樣土樣立即用 2.0 mol/L KCl 溶液浸提，浸提溶液放置于 –20℃ 冰箱，保存待測(cè)。

1.2.2 盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)所用瓷盆，規(guī)格為上端內(nèi)徑 20 cm，下端內(nèi)徑 9.5 cm，高 11 cm。每盆裝過(guò) 2 mm 尼龍篩的風(fēng)干土 4 kg。試驗(yàn)設(shè) 5 種處理：1) 不添加氮肥和硝化抑制劑 (CK)；2) 只添加硫銨 (ASN)；3) 硫銨 + DCD (ASN + DCD)；4) 硫銨 + DMPP (ASN + DMPP)；5) 硫銨 + Nitrapyrin (ASN + Nitrapyrin)。每1 kg 風(fēng)干土純氮用量為 0.50 g，按 ASN 計(jì) 2.36 g/kg；P2O50.15 g/kg，按重過(guò)磷酸鈣計(jì) 0.33 g/kg；K2O 0.30 g/kg，即硫酸鉀 (含 K2O 51%) 為 0.59 g/kg。DCD、DMPP、Nitrapyrin 用量分別為純 N 用量的 5%、1%、 0.648%。每個(gè)處理重復(fù) 4 次，隨機(jī)排列。將硫酸銨和硝化抑制劑溶解于水中，分別在小青菜定苗后第 2 d和 16 d 時(shí)各追施 50%，磷、鉀肥作為基肥一次性施入。幼苗長(zhǎng)出第二片真葉后進(jìn)行間苗，每盆定苗 10棵。定苗后 40 d 收獲。灌溉采用人工澆灌方式，各盆每次澆灌等量水量。盆栽試驗(yàn)在第 15 d 及收獲期40 d 分別取土樣與植株樣，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 土壤 DNA 提取與 PCR-DGGE 測(cè)定 盆栽試驗(yàn)自小青菜定苗后第 15 d 采集的土壤取樣后立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行過(guò)篩，去除細(xì)小根系，保存于–20℃ 冰箱用于土壤 DNA 提取。

氨氧化古菌 (AOA) PCR 擴(kuò)增及變性梯度凝膠電泳(DGGE)：氨氧化古菌 (AOA) rDNA PCR 擴(kuò)增采用通用引物對(duì) CrenamoA23f (5′-ATGGTCTGGCTWAGACG-3′)和 CrenamoA616R (5′-GCCATCCATCTGTATGTCCA-3′)[10]。PCR 擴(kuò)增條件為 94℃ 變性 5 min，接著 35 個(gè)循環(huán)(94℃ 變性 45 s，53℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1 min)，最后再 72℃ 延伸 10 min。產(chǎn)物片段長(zhǎng)度 600 bp。AOA 的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 DGGE 分離時(shí)，使用 6%的膠，變性濃度 15%～55%，緩沖液為 1 × TAE 溶液，電泳條件為電壓 110 V、溫度 60℃、時(shí)間 17 h。

氨氧化細(xì)菌 (AOB) PCR 擴(kuò)增及變性梯度凝膠電泳 (DGGE)：氨氧化細(xì)菌 (AOB) rDNA PCR 擴(kuò)增采用通用引物對(duì) amoA1F (5′-GGGGHTTYTACTGGTGGT-3′) 和amoA2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[11]。PCR 擴(kuò)增條件為 94℃ 變性 5 min，接著 35 個(gè)循環(huán)(92℃ 變性 1 min，50℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 45 s)，最后再 72℃ 延伸 5 min。產(chǎn)物片段長(zhǎng)度 500 bp。土壤中氨氧化細(xì)菌 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 DGGE 分離時(shí)，使用 7%的膠，變性濃度 27%～45%，緩沖液為 1 × TAE 溶液，電泳條件為電壓 110 V、溫度 60 ℃、時(shí)間 17 h。

DGGE 均使用 6% SYBR Gold (Invitrogen 公司)核酸凝膠染色 20 min。IngenyPhorU (荷蘭)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

土壤 pH 值采用電位法測(cè)定 (土水比 1∶5)；含水量測(cè)定為烘干法；有機(jī)質(zhì)采用高溫重鉻酸鉀氧化—容量法；全氮采用凱氏消煮法；有效磷測(cè)定采用 Olsen法；速效鉀測(cè)定采用乙酸銨浸提—火焰光度法；土壤 NH4+-N 含量采用靛酚藍(lán)比色法；土壤 NO3–-N 含量測(cè)定采用銅鎘還原柱法[12]。

植株葉片維生素 C 含量采用 2, 6-二氯酚靛酚滴定法測(cè)定[15]；氨基酸含量采用 80% 的乙醇提取茚三酮比色法測(cè)定，通過(guò)分光光度計(jì) 570 nm 波長(zhǎng)測(cè)定，結(jié)果用 1 g 植株鮮樣含有的氨基氮量的毫克數(shù)表示。

1.4 計(jì)算公式

式中，A 為不加抑制劑處理的土壤培養(yǎng)前后 NO3–-N含量之差 (mg/kg)，B 為添加硝化抑制劑處理的土壤培養(yǎng)前后 NO3–-N 含量之差 (mg/kg)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 Excel 和多元統(tǒng)計(jì)分析軟件 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software，San Diego，USA) 進(jìn)行圖表制作，使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)結(jié)果和土壤生理功能及多樣性指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行處理，處理間的差異顯著性采用 Duncan 法進(jìn)行單因素和雙因素多重比較。DGGE 指紋圖譜采用 Gel-QuantTM1.0軟件 (Multiplexed Biotechnologies Inc, USA) 進(jìn)行條帶判讀及遷移率、強(qiáng)度和面積計(jì)算。所得數(shù)據(jù)利用Primer 6.0 軟件 (Plymouth，United Kingdom) 首先通過(guò) Log (X + 1) 進(jìn)行歸一化處理，采用 Resemblance measure (S17 Bray Curtis similarity) 方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，在此基礎(chǔ)上對(duì) DGGE 指紋圖譜進(jìn)行多維尺度(MDS) 分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同劑量 DCD、DMPP、Nitrapyrin 處理土壤中 NO3–-N、NH4+-N 含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamics of soil NO3–-N and NH4+-N treated with different rates of DCD, DMPP and Nitrapyrin

2.1 DCD、DMPP、Nitrapyrin 對(duì)土壤銨、硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的影響

由圖 1 可知，CK 處理土壤 NO3–-N 含量在 30 d培養(yǎng)過(guò)程中顯著上升，由第 2 d 的 35.0 mg/kg 增加到30 d 的 427.5 mg/kg。3 種硝化抑制劑處理的土壤NO3–-N 顯著低于 CK 處理 (P ＜ 0.05)。表明 ASN 在土壤中很快轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，而硝化抑制劑可明顯抑制土壤硝化作用。相比較，DMPP 與 Nitrapyrin 的硝化抑制效果作用時(shí)間較 DCD 長(zhǎng)，但 DCD 劑量效應(yīng)較前二者明顯。如各劑量 DMPP 處理的土壤 NO3–-N含量在整個(gè)培養(yǎng)期間增幅并不明顯，各濃度處理的土壤 NO3–-N 含量在第 30 d 仍保持在較低水平，較CK 處理減少了 394.3～401.3 mg/kg，且不同劑量間無(wú)顯著差異。在培養(yǎng)前 8 d，土壤 NO3–-N 含量隨Nitrapyrin 濃度升高無(wú)顯著差異，而在第 8 d 后，低濃度 (0.10%～0.20%) 處理的土壤 NO3–-N 含量迅速大幅度上升，明顯高于中濃度 (0.25%～0.35%) 和高濃度 (0.40%～0.50%) 處理，但中濃度與高濃度處理間的土壤 NO3–-N 含量仍保持較低水平 (在 30 d 時(shí)，平均僅為 19.8 mg/kg)。與 Nitrapyrin、DMPP 相比，DCD 對(duì)土壤硝化抑制作用時(shí)間短且效果差，尤其是在培養(yǎng)后期。

2.2 DCD、DMPP、Nitrapyrin 對(duì)土壤硝化抑制率的影響

硝化抑制率可表征硝化抑制劑對(duì)土壤硝化作用抑制的程度。由圖 2 可知，在培養(yǎng)的第 30 d，DCD用量從純氮的 1% 增加到 7% 時(shí)，其硝化抑制率由49.3% 提高到 79.4%，表明土壤的硝化抑制率隨DCD 濃度升高而顯著提高。在 1%～7% 劑量范圍內(nèi)，DMPP 濃度處理的硝化抑制率為 96.4%～99.4%，各濃度處理間差異不顯著。Nitrapyrin 濃度由 0.10% 增加到 0.25% 時(shí)，硝化抑制率顯著上升，由 41.7% 提高到 98.9%，當(dāng) Nitrapyrin 劑量大于 0.25% 后，各濃度處理間的土壤硝化抑制率也無(wú)明顯差異，始終保持在 99.0% 左右。從劑量效應(yīng)分析，DCD 抑制效果隨劑量的升高而增強(qiáng)。各劑量 DMPP 處理間的硝化抑制率無(wú)差異，說(shuō)明 1% 的用量已可發(fā)揮顯著效應(yīng)。低、中、高 Nitrapyrin 劑量間的土壤硝化抑制率有明顯差異。0.25%～0.5% 的 Nitrapyrin 劑量可實(shí)現(xiàn)與1%～7% DMPP 相同抑制效果，均明顯高于 DCD。

圖2 培養(yǎng) 30 天后不同劑量 DCD、DMPP、Nitrapyrin 對(duì)土壤硝化抑制率的影響Fig.2 Response of soil nitrification inhibition rates to different dosages of DCD, DMPP and Nitrapyrin 30 days since incubation

2.3 DCD、DMPP、Nitrapyrin 對(duì)土壤表觀硝化率的影響

由圖 3 可知，CK 處理的土壤硝化作用發(fā)生強(qiáng)烈，在培養(yǎng)期間表觀硝化率可增加到 94.1%，而各硝化抑制劑均可顯著降低土壤表觀硝化率 (P ＜ 0.05)。DCD 對(duì)表觀硝化率作用的劑量效應(yīng)表現(xiàn)為低濃度(1.0%～3.0%) 的最高 (55.77%)，后為中濃度 (3.5%～4.5%) ＞ 高濃度 (5.0%～7.0%)，且從第 15 d 起，3 個(gè)濃度范圍處理之間差異顯著 (P ＜ 0.05)。DMPP 各濃度表觀硝化率均較低，且在各劑量間無(wú)明顯差異。在培養(yǎng)的 2～15 d，Nitrapyrin 三個(gè)濃度區(qū)間的土壤表觀硝化率差異不顯著，但在 15～30 d 時(shí)，低濃度(0.10%～0.20%) 土壤表觀硝化率急劇上升到 61.4% (30 d)，比 15 d 的表觀硝化率提高 52.3%，顯著高于中濃度 (0.25%～0.35%) 和高濃度 (0.40%～0.50%) 的(P ＜ 0.05)。中濃度和高濃度區(qū)間的土壤表觀硝化率在 0～30 天培養(yǎng)期內(nèi)差異不顯著。3 種硝化抑制劑對(duì)土壤表觀硝化率影響總體表現(xiàn)為 Nitrapyrin ≤ DMPP＜ DCD，與硝化抑制率的變化 (圖 2) 相互印證。

2.4 不同種植方式對(duì)氨氧化古菌、氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

氨氧化古菌 (AOA) 和氨氧化細(xì)菌 (AOB) 是驅(qū)動(dòng)土壤硝化生物過(guò)程的關(guān)鍵微生物。在相似度為 68%下，3 種硝化抑制劑處理的 AOB 群落結(jié)構(gòu)明顯不同于對(duì)照處理 (CK)。在相似度為 75% 下，Nitrapyrin處理的 AOB 群落結(jié)構(gòu)明顯有別于 DMPP 和 DCD 處理 (圖 4A)，應(yīng)力系數(shù)為 0.14，表明擬合度好，差異顯著 (Stress ＜ 0.2)。AOA 群落在相似度 85% 水平下可分為 CK、施氮處理 (ASN) 及 3 種硝化抑制劑處理3 類(lèi) (圖 4B)，且差異極顯著 (Stress = 0.09)，但DCD、DMPP 及 Nitrapyrin 之間對(duì) AOA 群落結(jié)構(gòu)的影響差異不明顯。以上說(shuō)明施用硝化抑制劑可改變土壤 AOA 和 AOB 群落結(jié)構(gòu)，且對(duì) AOA 群落結(jié)構(gòu)的影響大于 AOB。然而不同硝化抑制劑之間對(duì) AOA和 AOB 群落結(jié)構(gòu)的影響無(wú)明顯差異。

圖3 不同劑量 DCD、DMPP、Nitrapyrin 處理 2、15、30 d 時(shí)對(duì)土壤表觀硝化率的影響Fig.3 Response of soil apparent nitrification rates to different dosages of DCD, DMPP and Nitrapyrin at the 2 th, 15 th and 30 th days of incubation

圖4 土壤氨氧化細(xì)菌 (A) 和氨氧化古菌 (B) 群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行的多維尺度 (MDS) 分析Fig.4 MDS analysis of community structures of AOB (A) and AOA (B) as affected by DCD, DMPP and Nitrapyrin

2.5 各硝化抑制劑與氮肥配施對(duì)小青菜品質(zhì)的影響

由表 1 可知，與 CK 處理相比，施用氮肥 (ASN)可以增加小青菜產(chǎn)量、維生素 C 含量和氨基酸含量；與氮肥處理 (ASN) 相比，加入硝化抑制劑對(duì)小青菜產(chǎn)量、維生素 C 及氨基酸含量均有提高，且對(duì)氨基酸含量的提高效應(yīng)顯著 (P ＜ 0.05)。DCD、DMPP、Nitrapyrin 處理的小青菜地上部分鮮重較ASN 處理分別提高了 12.7%、11.1%、17.6%，葉片維生素 C 含量分別較 ASN 處理提高了 15.7%、19.5%、24.4%，葉片氨基酸含量分別比 ASN 處理提高了 18.2%、17.8%、16.7%。3 種硝化抑制劑對(duì)小青菜產(chǎn)量、維生素 C 及氨基酸含量總體效果表現(xiàn)為Nitrapyrin ＞ DMPP ＞ DCD。

表1 不同劑量硝化抑制劑配施對(duì)小青菜產(chǎn)量和葉片中Vc、氨基酸的影響Table 1 The influences of DCD, DMPP and Nitrapyrin addition on the yields, Vc contents and amino acid contents of pakchoi

3 討論

石灰性土壤廣泛分布于干旱半干旱地區(qū)，pH 一般在 7.5～8.5 之間、通氣良好，硝化作用發(fā)生強(qiáng)烈[15]。氨氧化古菌 (AOA) 與氨氧化細(xì)菌 (AOB) 是影響土壤硝化過(guò)程的主要微生物群落。辜運(yùn)富等通過(guò)大田試驗(yàn)表明，施肥能增加 AOB 微生物數(shù)量并改變其群落結(jié)構(gòu)[16]。賀紀(jì)正等對(duì)河南封丘長(zhǎng)期定位試驗(yàn)點(diǎn)堿性潮土 (pH 8.3～8.7) 的 DGGE 分析顯示，不同施肥處理引起 AOB 群落結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)堿性土壤中長(zhǎng)期施肥處理對(duì) AOB 的數(shù)量及組成有明顯影響而對(duì)AOA 的影響較小[17]。本研究結(jié)果也表明，在石灰性土壤中單施硫銨與配施 3 種硝化抑制劑組合對(duì)土壤AOA、AOB 的群落結(jié)構(gòu)均有一定影響。

不同硝化抑制劑在土壤中發(fā)揮硝化抑制作用的有效時(shí)間與其自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)密切相關(guān)。Chalk 等研究表明 DCD 能顯著抑制硝化活性較高的土壤中銨的氧化，減少硝酸鹽的形成[18]，但由于 DCD 水溶性很高(13℃ 水中的溶解度為 22.6 g/L)，在土壤剖面中移動(dòng)性強(qiáng)，容易與 NH4+在土壤空間分布上發(fā)生分離現(xiàn)象，從而影響其硝化抑制效果，當(dāng)遇到強(qiáng)降雨或在保水能力較差的土壤中，容易發(fā)生淋溶損失[19]。由于土壤膠體和有機(jī)質(zhì)的吸附作用，DMPP 在土壤中的移動(dòng)性非常有限，在土壤中的降解速度慢，不易與NH4+發(fā)生分離現(xiàn)象和淋溶[19]，使得 DMPP 硝化抑制效果穩(wěn)定，發(fā)揮作用時(shí)間長(zhǎng)。Nitrapyrin 易于見(jiàn)光分解為 6-氯-吡啶甲酸，造成揮發(fā)損失，不適合表施，但將其應(yīng)用于高有機(jī)質(zhì)的土壤時(shí)，其揮發(fā)損失可通過(guò)有機(jī)質(zhì)的吸附相應(yīng)減少[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DCD 在培養(yǎng)過(guò)程 30 d 中，硝化抑制率僅為49.3%～79.4%，而 DMPP 硝化抑制效果始終保持在99.0% 左右，Nitrapyrin 的硝化抑制效果在前 8 d 與DMPP 相一致，而 8 d 后稍有下降，尤其是低濃度條件下。在當(dāng)前水氮一體化節(jié)水滴灌施肥條件下，1 個(gè)滴灌周期為 8～10 d，DMPP、Nitrapyrin 可與每次滴施氮肥相結(jié)合，通過(guò)滴灌管道系統(tǒng)把肥料氮與硝化抑制劑隨水均勻分布于作物根區(qū)附近，抑制土壤硝化作用，從而達(dá)到優(yōu)化耕層土壤銨硝供給比例，改善作物氮素營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)作物生長(zhǎng)的目的。

研究表明，田間條件下 DMPP 施用量為 0.5～1.5 kg/hm2時(shí)，硝化抑制效應(yīng)時(shí)間可持續(xù) 4～10 周[21]。Azam 等發(fā)現(xiàn)當(dāng) DMPP 在土壤中均勻分布時(shí)，0.39 μg/g 土 DMPP 即可起顯著硝化抑制效果[19]，DMPP用量?jī)H為 DCD 的 1/10 時(shí)，其硝化抑制效果仍然高于DCD。石美等指出，0.5% DMPP 與 1% DMPP 處理的硝化抑制效果并無(wú)顯著差異[22]。而對(duì)于同種硝化抑制劑不同濃度的處理，硝化抑制效果及其作用時(shí)間也會(huì)隨濃度增高而增加，本研究結(jié)果顯示，在 1%～3.5% DCD 硝化抑制效果只能維持 5～15 d，且效果欠佳，而高濃度的 DCD 處理卻能維持 30 d；0.1% Nitrapyrin 的硝化抑制效果僅能維持 8 d，但達(dá)到0.25%～0.5% 劑量時(shí)，直到培養(yǎng)結(jié)束其硝化抑制率依舊保持在 99.0%。同樣在 1%～7% 的劑量下，DCD的硝化抑制劑效果作用時(shí)間短，劑量效應(yīng)顯著，而DMPP 的硝化抑制作用并未隨濃度增加而明顯升高，說(shuō)明低濃度的 DMPP 就可發(fā)揮顯著硝化抑制效應(yīng)，在石灰性土壤 DMPP 的劑量還應(yīng)小于 1.0%，合理的劑量需進(jìn)一步通過(guò)濃度梯度試驗(yàn)確定。Nitrapyrin 在中、高劑量的硝化抑制率和表觀硝化率與 DMPP 基本一致，低劑量雖然降低了硝化抑制劑效果，但仍高于 DCD 處理。當(dāng) Nitrapyrin 用量?jī)H為純氮用量 0.25% 時(shí)已可達(dá)到最佳的硝化抑制效果。

此外，Zerulla 等[23]研究指出，Nitrapyrin 是一種有機(jī)氯化合物，如果施用量過(guò)大，或長(zhǎng)期施用會(huì)對(duì)某些作物產(chǎn)生毒性；Thomson 等[24]研究表明當(dāng)Nitrapyrin 施用量?jī)H為 10 mg/kg 時(shí)，會(huì)因致毒作用而導(dǎo)致豆類(lèi)植株根系和地上部生長(zhǎng)受到抑制，干物質(zhì)量下降 50% 左右。但 Swezey 等[25]研究表明，施用1% 的 Nitrapyrin 非但對(duì)棉花無(wú)副作用，反而使其產(chǎn)量提高 12%。本研究也發(fā)現(xiàn) 0.65% 劑量的 Nitrapyrin對(duì)小青菜并無(wú)抑制作用，反而顯著提高了小青菜的生物量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì) (維生素 C 和氨基酸含量，表 1)，且在 3 種硝化抑制劑中表現(xiàn)最好，可能是今后在農(nóng)業(yè)氮素管理中廣泛應(yīng)用的合適劑型。

4 結(jié)論

1) 三種硝化抑制劑均可顯著抑制土壤 NH4+-N 向NO3–-N 轉(zhuǎn)化，使 NH4+-N 在培養(yǎng)期維持較高含量。不同處理間土壤 NH4+-N 含量表現(xiàn)為 DMPP ≥ Nitrapyrin ＞DCD。

2) DCD 的硝化抑制率為 49.3%～79.4%，且在1.0%～7.0% 濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)；DMPP 的硝化抑制率為 96.7%～99.4%，且劑量效應(yīng)(1.0%～7.0%) 不顯著。Nitrapyrin 的硝化抑制率為41.7%～99.9%，在低劑量下 (0.1%～0.2%) 表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，在中、高劑量 (0.25%～0.5%) 下無(wú)明顯劑量效應(yīng)，三者硝化抑制效果表現(xiàn)為 Nitrapyrin ≥DMPP ＞ DCD。

3) 三種硝化抑制劑均改變了土壤 AOA 和 AOB群落結(jié)構(gòu)，且對(duì) AOA 群落結(jié)構(gòu)的影響大于 AOB。施用硝化抑制劑均可提高小青菜的產(chǎn)量、氨基酸含量與維生素 C 的含量。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]曾后清, 朱毅勇, 王火焰, 等. 生物硝化抑制劑-一種控制農(nóng)田氮素流失的新策略[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2012, 49(2): 382–388. Zeng H Q, Zhu Y Y, Wang H Y, et al. Biological nitrification inhibitor–a new strategy for controlling nitrogen loss from farmland[J]. Acta Pedologica Sinca, 2012, 49(2): 382–388.

[2]孫志梅, 張闊, 劉建濤, 等. 氮肥調(diào)控劑對(duì)潮褐土中不同氮源氮素轉(zhuǎn)化及油菜生長(zhǎng)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 23(9): 2497–2503. Sun Z M, Zhang K, Liu J T, et al. Effects of nitrogen regulators on fertilizer nitrogen transformation in meadow cinnamon soil and on pakchoi growth[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(9): 2497–2503.

[3]Slangen J, Kerkhoff P. Nitrification inhibitors in agriculture and horticulture: A literature review[J]. Nutrient Cycling in Agroecosystems, 1984, 5(1): 1–76.

[4]奉小憂, 曾清如, 皮荷杰, 等. 3種硝化抑制劑對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)毒性的比較[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2010, 5(2): 268–273. Feng X Y, Zeng Q R, Pi H J, et al. Comparison of toxicity induced by three nitrification inhibitors on wheat[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 25(2): 268–273.

[5]Weiske A, Benckiser G, Herbert T, et al. Influence of the nitrification inhibitor 3, 4-dimethyl pyrazole phosphate(DMPP) in comparison to dicyandiamide (DCD) on nitrous oxide emissions, carbon dioxide fluxes and methane oxidation during 3 years of repeated application in field experiments[J]. Biology and Fertility of Soils, 2001, 34: 109–117.

[6]Owens L B. Effects of nitrapyrin on nitrate movement in soil columns[J]. Journal of Environmental Quality, 2001, 10(3): 308–310.

[7]Zaman M, Blennerhassett J D. Effects of the different rates of urease and nitrification inhibitors on gaseous emissions of ammonia and nitrous oxide, nitrate leaching and pasture production from urine patches in an intensive grazed pasture system[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2010, 136(3–4): 236–246.

[8]孫志梅, 武志杰, 梁文舉, 等. 3, 5-二甲基吡唑?qū)︿@態(tài)氮硝化及作物生長(zhǎng)的影響[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2006, 12(6): 869–874. Sun Z M, Wu Z J, Liang W J, et al. Effects of different application rates of 3, 5-dimethylpyrazole on soil ammonium nitrification and crop growth[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2006, 12(6): 869–874.

[9]劉倩, 褚貴新, 劉濤, 等. DCD在不同質(zhì)地土壤上的硝化抑制效果和劑量效應(yīng)研究[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 19(4): 765–770. Liu Q, Chu G X, Liu T, et al. Nitrification inhibition and dosedependent effect of dicyandiamide on sandy, loamy and clayey soils[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2011, 19(4): 765–770.

[10]Ovres L, Forney L, Daae F L, et al. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63: 3367–3373.

[11]Yergeau E, Filion M, Vujanovic V, et al. A PCR denaturing gradient gel electrophoresis approach to assess Fusarium diversity in asparagus[J]. Journal of MicrobiologicalMethods, 2005, 60: 143–154.

[12]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2000. Bao S D. Soil and agrochemical analysis[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2000.

[13]McCarty G W, Bremner J M. Laboratory evaluation of dicyandiamide as a soil nitrification inhibitor[J]. Communication in Soil Science and Plant Analysis, 1989, 20(19/20): 2049–2065.

[14]林江輝, 李輝信, 胡鋒, 等. 干土效應(yīng)對(duì)土壤生物組成及礦化與硝化作用的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2004, 41(6): 924–930. Lin J H, Li H X, Hu F, et al. Effects of rewetting on soil biota structure and nitrogen mineralization, nitrification in air-dried red soil[J]. Acta Pedologica Sinca, 2004, 41(6): 924–930.

[15]杜景龍, 陳德超, 王兆華. GIS 支持下的土壤綜合肥力指標(biāo)的定量計(jì)算[J]. 土壤肥料, 2005, (2): 17–20. Du J L, Chen D C, Wang Z H. Construction and application of a variable fertilizer model based on GIS[J]. Soils & Fertilizers, 2005, (2): 17–20.

[16]辜運(yùn)富, 云翔, 張小平, 等. 不同施肥處理對(duì)石灰性紫色土微生物數(shù)量及氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(12): 4119–4126. Guo Y F, Yun X, Zhang X P, et al. Effect of different fertilizer treatments on soil microbes and ammonium oxidizing bacterial community in a calcareous purple paddy soil[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2008, 41(12): 4119–4126.

[17]賀紀(jì)正, 張麗梅. 氨氧化微生物生態(tài)學(xué)與氮循環(huán)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 29(1): 406–415. He J Z, Zhang L M. Advances in ammonia-oxidizing microorganisms and global nitrogen cycle[J]. Acta Ecologica Sinica, 2009, 29(1): 406–415.

[18]Chalk P M, Victoria RK, Muraoka T, et al. Effect of a nitrification inhibitor on immobilization and mineralization of soil and fertilizer nitrogen[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1990, 22: 533–538.

[19]Azam F, Benckiser G, Müller C, et al. Release, movement and recovery of 3, 4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP), ammonium, and nitrate from stabilized nitrogen fertilizer granules in a silty clay soil under laboratory conditions[J]. Biology and Fertility of Soils, 2001, 34: 118–125.

[20]黃益宗, 馮宗煒, 張福珠. 硝化抑制劑硝基吡啶在農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用[J]. 土壤與環(huán)境, 2001, 10(4): 323–326. Huang Y Z, Feng Z W, Zhang F Z. Application of nitrapyrin in agriculture and environmental protection[J]. Soil and Environmental Science, 2001, 10(4): 323–326.

[21]Di H J, Cameron K C. How does the application of different nitrification inhibitors affect nitrous oxide emissions and nitrate leaching from cow urine in grazed pastures?[J]. Soil Use and Management, 2012, 28(1): 54–61.

[22]石美, 張妹婷, 沈鋒, 等. 石灰性土壤中不同硝化抑制劑的抑制效果及其對(duì)亞硝態(tài)氮累積的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(3): 500–506. Shi M, Zhang M T, Shen F, et al. Effects of nitrification inhibitors on nitrification inhibition and nitrite accumulation in calcareous soil[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(3): 500–506.

[23]Zerulla W, Barth T, Dressel J, et al. 3, 4-Dimethylpyrazole phosphate (DMPP): A new nitrification inhibitor for agriculture and horticulture: An introduction[J]. Biology and Fertility of Soils, 2001, 34: 79–84.

[24]Thomson C J, Marschner H, Romheld V. Effect of nitrogen fertilizer form on the pH of the bulk soil and rhizosphere, and on the growth, phosphorus, and micronutrient uptake by bean[J]. Journal of Plant Nutrition, 1993, 16: 493–506.

[25]Swezey A W, Turner G O. Crop experiments on the effect of 2-chloro-6-(trichloromethyl) pyridine for the control of nitrification of ammonium and urea fertilizers1[J]. Agronomy Journal, 1962, 54(6): 29–29.

Inhibition of DCD, DMPP and Nitrapyrin on soil nitrification and their appropriate use dosage

WANG Xue-wei, LIU Tao, CHU Gui-xin*
( College of Agronomy, Shihezi University/Production and Construction Group Key Laboratory of Oasis Ecological Agriculture, Shihezi, Xinjiang 832003, China )

【Objectives】Nitrification inhibitors are effective in regulating the transformation of soil nitrogen and the community structure of microbes which involve in the N nitrification process. Incubation and pot experiments were conducted to compare nitrification effects of 3 common used nitrification inhibitors, and to study the dosage for practical use in calcareous soil.【Methods】The incubation experiment was carried out in a plant growth chamber at 25℃ in dark condition, and the pot experiment was conducted in greenhouse. The tested three inhibitors were dicyandiamide (DCD), 3,4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP) and chloro-6-trichloromethyl-pyridine (nitrapyrin). The dosage of DCD and DMPP designed as 0 (CK), 1.0%, 2.0%, 3.0%,3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 6.0% and 7.0% of the N addition, those of nitrapyrin were 0, 0.1%, 0.125%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45% and 0.5%. N 0.50 g per kg of dry soil was added in pot experiment, and the dosages of three inhibitors were all 5%, 1%, 0.648% of the N addition. The nitrate inhibition rate and the biomass of pakchoi were investigated; the soil microbial community structures of AOA and AOB were analyzed using the method of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).【Results】Soil nitrification was significantly inhibited by DCD, DMPP and nitrapyrin (P ＜ 0.05). Compares with the CK, soil NH4+-N concentrations were increased by 46.2–256.1 mg/kg with DCD, by 291.8–376.7 mg/kg with DMPP and by 3.68–372.9 mg/kg with nitrapyrin, respectively. The nitrification inhibition rates were 49.3%–79.4% with DCD and 96.4%–99.4% with DMPP. The DCD addition exhibited an obvious dose effect, namely, the nitrification inhibition rates were increased significantly with DCD dose increasing, the DMPP did not in the addition range of 1.0%–7.0%, Although nitrapyrin only showed dose response in low concentrations from 0.1% to 0.2%, the inhibition rate had reached 98.9%–99.9% when nitrapyrin concentration raised over 0.25%. The inhibition ability followed the order of nitrapyrin ≥ DMPP ＞ DCD. A significant impact of all three NIs on AOA and AOB community structure alteration was found, but there was no significant difference among the three inhibitors. The pakchoi above-ground weight, the contents of Vitamin C and amino acid were significantly improved by DCD, DMPP and nitrapyrin addition (P ＜ 0.05), with the increase of pakchoi biomass of 12.7% with DCD, 11.1% with DMPP and 17.6% with nitrapyrin, respectively.【Conclusions】Briefly, DCD, DMPP and nitrapyrin showed significant role in retarding nitrification in calcareous soil and exerted an obvious influence on AOA and AOB community structure (P ＜ 0.05). Comparatively, nitrapyrin was superior over DMPP and DCD on the soil inhibition, and the addition dose of 0.25% based on pure N was recommended for nitrapyrin application.

nitrification inhibitor; calcareous soil; ammonium; nitrate; nitrification inhibition rate; AOA; AOB

2016–03–30接受日期：2016–05–17

國(guó)家“十二五”科技支撐項(xiàng)目（2012BAD42B02）資助。

王雪薇（1993—），女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)方面研究。E-mail：grammays17@163.com

* 通信作者 E-mail：chuguixinshzu@163.com